楊 亞，朱詩(shī)蘭，范蘇婉，任 曼，李升和

(安徽科技學(xué)院,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部豬肉質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 鳳陽(yáng) 233100)

蜂花粉(Bee pollen)，是蜜蜂從顯花植物花蕊內(nèi)采集的花粉粒，加入了特殊的腺體分泌物混合而成的一種不規(guī)則團(tuán)狀物[1]，含有豐富的蛋白質(zhì)、游離氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素、礦物元素和多種生物活性酶等[2]。研究表明，蜂花粉具有促進(jìn)生長(zhǎng)、增強(qiáng)免疫力、延緩衰老、抗氧化、抗癌和抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種生物功能和藥理作用[3]。

腸道是機(jī)體重要的免疫和消化器官[4]，其巨大的表面積和豐富的淋巴組織在整體免疫中扮演著重要角色，直接或間接影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收及機(jī)體免疫功能，正常的腸道結(jié)構(gòu)功能是動(dòng)物機(jī)體健康的保證[5]。方小明等[6]研究發(fā)現(xiàn)，荷花蜂花粉能夠改善5-氟尿嘧啶造成的結(jié)腸粘膜損傷以及腸道傳輸功能失調(diào)。卜凡方[7]研究發(fā)現(xiàn)，便秘可能會(huì)導(dǎo)致小腸絨毛受壓迫，影響營(yíng)養(yǎng)吸收功能，攝取油菜蜂花粉對(duì)此現(xiàn)象有所改善。王允超等[8]研究發(fā)現(xiàn)，破壁蜂花粉能調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，促進(jìn)乳酸菌等有益菌生長(zhǎng)，降低腸道pH，改善腸道內(nèi)環(huán)境。目前，圍繞蜂花粉開(kāi)展的研究主要在于其營(yíng)養(yǎng)成分、對(duì)正常動(dòng)物的生產(chǎn)性能和免疫功能的影響。而對(duì)腸組織損傷模型的影響研究較少。因此，本試驗(yàn)以地塞米松(Dexamethasone，DEX)建立的腸組織損傷模型小鼠為試驗(yàn)對(duì)象，研究不同濃度的蜂花粉對(duì)腸組織損傷小鼠小腸組織結(jié)構(gòu)的影響，以期為蜂花粉的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 6周齡清潔級(jí)昆明系健康小鼠60只，體重18～25 g，購(gòu)于江蘇省南京市青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖場(chǎng)，合格證號(hào)：SCXK(滬)2018-0004。

1.1.2 試驗(yàn)藥物 地塞米松磷酸鈉注射液(山西省芮城科龍獸藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：獸藥字040192530)；破壁蜂花粉(安徽省宿松縣劉氏蜂產(chǎn)品有限責(zé)任公司),純度≥98%。

1.2 試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)

清潔級(jí)6周齡健康小鼠60只，體重18～25 g，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組和實(shí)驗(yàn)Ⅰ～Ⅳ組，每組10只，雌雄各半。第1～7天，模型組和試驗(yàn)Ⅰ～Ⅳ組連續(xù)隔日注射地塞米松(40 mg/kg)4次塑造模型，第8～22天Ⅰ～Ⅳ組分別飲用添加0.357、0.714、1.071、1.429 mg/mL蜂花粉的水，空白對(duì)照組和模型組飲用蒸餾水。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度25～27 ℃, 濕度55%～63%, 光照12 h。自由飲水和采食(飼喂基礎(chǔ)日糧)。

1.3 樣品采集與處理

試驗(yàn)期22 d，禁食不禁水12 h后，吸入乙醚麻醉處死小鼠，取小腸各段，立即置于4%多聚甲醛固定保存；制作組織蠟塊；切片；HE染色；封片；用BA410型生物顯微鏡，采集小腸各段切片結(jié)構(gòu)，用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行測(cè)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

2 結(jié)果

2.1 蜂花粉對(duì)模型小鼠小腸組織結(jié)構(gòu)形態(tài)的影響

2.1.1 蜂花粉對(duì)小鼠十二指腸組織結(jié)構(gòu)形態(tài)的影響 由圖1可見(jiàn)，與對(duì)照組相比腹腔注射地塞米松導(dǎo)致小鼠十二指腸腸絨毛數(shù)量減少，存在腸絨毛粘連現(xiàn)象，小腸腺損傷嚴(yán)重，腸上皮缺損，隱窩加深，而對(duì)照組的腸絨毛排列整齊，呈柱狀，環(huán)形皺襞較多，結(jié)構(gòu)完整，隱窩深淺適度。與模型組和對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組絨毛增長(zhǎng)，寬度變寬，隱窩較明顯，無(wú)粘連現(xiàn)象；試驗(yàn)Ⅱ組絨毛數(shù)量變多，絨毛增粗，隱窩深度變淺；試驗(yàn)Ⅲ組絨毛最為發(fā)達(dá)，絨毛細(xì)長(zhǎng)，排列緊密，隱窩明顯變淺，排列緊湊；試驗(yàn)Ⅳ組絨毛密度明顯增大，長(zhǎng)度增加。綜合觀察，試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ組的十二腸絨毛高度均比試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組高，隱窩深度均比Ⅰ、Ⅱ組低，效果明顯。

A:空白對(duì)照組 B:地塞米松處理組 C～F:地塞米松+蜂花粉試驗(yàn)Ⅰ～Ⅳ組圖1 蜂花粉對(duì)小鼠十二指腸組織結(jié)構(gòu)的影響(HE染色，100×)Fig.1 Effects of bee pollen on duodenal tissue structure in mice (HE staining, 100×)

2.1.2 蜂花粉對(duì)小鼠空、回腸組織結(jié)構(gòu)形態(tài)的影響 蜂花粉對(duì)小鼠空腸、回腸組織結(jié)構(gòu)的影響見(jiàn)圖2。顯微觀察可見(jiàn)，模型組的腸絨毛低矮，數(shù)量減少，排列較稀疏，絨毛頂端上皮細(xì)胞脫落，隱窩深度變淺；對(duì)照組的腸絨毛呈柱狀，絨毛粗短，排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，隱窩較淺。與對(duì)照組和模型組相比，試驗(yàn)各組絨毛均有所增長(zhǎng)，寬度變寬，隱窩較明顯；綜合比較試驗(yàn)Ⅲ組絨毛細(xì)長(zhǎng)，排列緊密且整齊，隱窩明顯加深，數(shù)量增多，排列緊湊，效果最佳。

A:空白對(duì)照組；B:地塞米松處理組；C～F:地塞米松+蜂花粉試驗(yàn)Ⅰ～Ⅳ組圖2 蜂花粉對(duì)小鼠空腸組織結(jié)構(gòu)的影響(HE染色，100×)Fig.2 Effects of bee pollen on jejunal tissue structure in mice (HE staining, 100×)

2.2 蜂花粉對(duì)模型小鼠小腸絨毛的影響

2.2.1 蜂花粉對(duì)小鼠十二指腸絨毛的影響 蜂花粉對(duì)小鼠十二指腸絨毛的影響見(jiàn)圖3。與對(duì)照組相比，模型組十二指腸絨毛高度較空白對(duì)照組顯著降低了20%。與空白對(duì)照組和模型組相比，各試驗(yàn)組絨毛高度均有所增高，其中試驗(yàn)Ⅲ組分別極顯著升高了34%和67%。試驗(yàn)組間相比較，試驗(yàn)Ⅲ組十二指腸絨毛高度顯著性高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ組(P<0.05)。

與對(duì)照組相比，模型組小鼠十二指腸的隱窩深度極顯著上升了64%。與對(duì)照組和模型組相比，試驗(yàn)Ⅲ組分別極顯著降低了33%、59%；試驗(yàn)Ⅳ組較對(duì)照組升高了10%，差異不顯著。試驗(yàn)組間相比較，其中試驗(yàn)Ⅲ組隱窩深度顯著性低于Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ組。綜合比較，試驗(yàn)Ⅲ組蜂花粉濃度對(duì)小鼠十二指腸組織結(jié)構(gòu)的保護(hù)和促進(jìn)作用最好，與組織結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果一致。

加入工作室要端正動(dòng)機(jī)，如果是僅僅是停留在尋找安慰和困難求助的層面，工作室的作用不大；如果是以渴望成長(zhǎng)，深度參與，承擔(dān)主要任務(wù)為動(dòng)機(jī)，工作室會(huì)是你成長(zhǎng)的最佳平臺(tái)。

2.2.2 蜂花粉對(duì)小鼠空腸絨毛的影響 蜂花粉對(duì)小鼠空腸絨毛和隱窩的影響見(jiàn)圖4，模型組的絨毛高度較對(duì)照組下降了4.93%；試驗(yàn)Ⅱ組的絨毛高度較對(duì)照組和模型組分別升高了19.82%、23.78%，差異均具有極顯著性；試驗(yàn)Ⅲ組的絨毛高度較對(duì)照組和模型組分別升高了25.16%、28.85%，差異均具有極顯著性；試驗(yàn)Ⅳ組的絨毛高度較對(duì)照組和模型組分別升高了2.60%和7.42%，和模型組相比差異顯著。

圖4 蜂花粉對(duì)小鼠空腸絨毛的影響Fig.4 Effect of bee pollen on jejunum villi in mice

模型組的小鼠空腸隱窩深度較對(duì)照組極顯著的降低了16.29%；試驗(yàn)Ⅰ組的空腸隱窩深度較對(duì)照組和模型組分別升高了2.68%、18.53%，試驗(yàn)Ⅱ組的空腸隱窩深度較對(duì)照組和模型組分別升高了3.8%、19.49%；試驗(yàn)Ⅲ組的隱窩深度較對(duì)照組與模型組分別升高了6.33%、21.59%；同對(duì)照組及模型組相比，試驗(yàn)Ⅳ組的空腸隱窩深度分別升高了3.26%和19.02%。綜合來(lái)看，蜂花粉對(duì)空腸絨毛的保護(hù)作用明顯，但是對(duì)腸隱窩的促進(jìn)作用不明顯，可能跟蜂花粉的吸收部位有關(guān)。

2.2.3 蜂花粉對(duì)小鼠回腸絨毛的影響 蜂花粉對(duì)小鼠回腸組織結(jié)構(gòu)的影響見(jiàn)圖3，與對(duì)照組相比，模型組的絨毛高度降低了8%，差異極顯著；試驗(yàn)Ⅲ組的絨毛高度較對(duì)照組和模型組分別升高了21%、31%，均具有極顯著性差異(P<0.001)；試驗(yàn)Ⅳ組的絨毛高度較對(duì)照組和模型組分別升高了9%和19%，差異均具有極顯著性(P<0.001)。

模型組的小鼠回腸的隱窩深度與空白對(duì)照組的相比降低了7%；試驗(yàn)Ⅰ組的回腸隱窩深度較對(duì)照組和模型組分別升高了5%、13%；試驗(yàn)Ⅱ組的腸隱窩深度較對(duì)照組的下降了0.4%，較模型組的隱窩深度上升了8%；試驗(yàn)Ⅲ組的隱窩深度較對(duì)照組與模型組分別升高了10%、19%。綜合分析，與空腸結(jié)果類(lèi)似，蜂花粉對(duì)回腸絨毛保護(hù)作用強(qiáng)于對(duì)隱窩的保護(hù)。

圖5 蜂花粉對(duì)小鼠回腸絨毛的影響Fig.5 Effect of bee pollen on ileal villi in mice

3 結(jié)論與討論

3.1 地塞米松對(duì)小腸組織結(jié)構(gòu)有不良影響

地塞米松屬于糖皮質(zhì)激素，制備免疫抑制模型的常用藥物之一[9]。其大多數(shù)作用都是基于與特異性受體的相互作用的結(jié)果[10]，其受體廣泛存在于肝、胃腸平滑肌、淋巴組織、胸腺等細(xì)胞內(nèi)[11]，糖皮質(zhì)激素進(jìn)入靶細(xì)胞，與其受體結(jié)合后，形成激素-受體復(fù)合物作為基因轉(zhuǎn)錄的激活因子，合成或抑制某些特異性蛋白質(zhì)，由此易導(dǎo)致腸道功能紊亂[12]，而且大劑量的糖皮質(zhì)激素會(huì)誘導(dǎo)胃產(chǎn)生較多的胃蛋白酶和胃酸, 損傷胃黏膜屏障，加快消化性潰瘍進(jìn)展[13]。李相玲等[14]在探討“環(huán)磷酰胺和地塞米松對(duì)小鼠腸道黏膜免疫抑制的比較”研究中證明DEX主要通過(guò)抑制胸腺依賴(lài)性淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致輔助性T細(xì)胞輔助B細(xì)胞的活化能力下降，抑制腸道淋巴細(xì)胞活化，抑制腸道粘膜免疫；潘書(shū)磊等[15]在探討“地塞米松對(duì)仔豬腸道黏膜形態(tài)的影響”中證明DEX會(huì)影響腸道絨毛發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

3.2 蜂花粉對(duì)地塞米松致小鼠小腸組織結(jié)構(gòu)損傷后與功能有改善和保護(hù)作用

蜂花粉營(yíng)養(yǎng)成分豐富，具有多種生理功能, 如調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、抗炎、抗腫瘤、抗凋亡、增強(qiáng)應(yīng)激能力、降低膽固醇等作用[16]；蜂花粉因富含有酚酸和黃酮類(lèi)物質(zhì)具有抗氧化能力[17]，其中的類(lèi)黃酮可以治療過(guò)敏性和免疫性疾病[18]；蜂花粉具有很好的抗菌活性，對(duì)細(xì)菌、真菌的生長(zhǎng)都有一定的抑制作用[19]。有研究表明蜂花粉可以明顯增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，抵御細(xì)菌和某些病毒，對(duì)機(jī)體無(wú)毒副作用, 作為免疫增強(qiáng)劑十分理想[20]。王允超等[21]研究發(fā)現(xiàn)，破壁蜂花粉能調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，促進(jìn)乳酸菌等有益菌生長(zhǎng)，降低腸道pH，改善腸道內(nèi)環(huán)境。

小腸是動(dòng)物機(jī)體食物消化和選擇性吸收的主要場(chǎng)所，其分為十二指腸段、空腸段與回腸段，而十二指腸段杯狀細(xì)胞少，絨毛密集，其中的G細(xì)胞可分泌胃泌素，促進(jìn)胃酸的分泌，S細(xì)胞分泌的促胰酶素可促進(jìn)胰液分泌，是消化吸收功能最強(qiáng)的。同時(shí)腸道在機(jī)體免疫中扮演著重要的角色[22]，淋巴組織廣泛的分布，形成黏膜相關(guān)淋巴組織(mucosal-associated lymphoid tissue, MALT)，比如腸道孤立淋巴小結(jié)，彌散淋巴組織等[23]，抵御外來(lái)病菌和異物的侵襲。測(cè)定的小腸組織結(jié)構(gòu)各項(xiàng)指標(biāo)包括絨毛高度、隱窩深度及其兩者的比值，此為探究模型建立后腸道受損與對(duì)照組的差異性，從而探究蜂花粉的適宜功效濃度。研究證明腸道的絨毛高度和隱窩深度可以體現(xiàn)腸道的功能狀態(tài)，絨毛高度增加，其相應(yīng)的吸收表面積也增大，吸收能力加強(qiáng)[24]，對(duì)提高動(dòng)物生產(chǎn)性能具有重要意義。

本次實(shí)驗(yàn)證明通過(guò)地塞米松磷酸鈉注射液建立的腸道損傷模型與對(duì)照組相比，小鼠的絨毛高度、隱窩深度差異均顯著(P<0.05)，依據(jù)前人研究選擇0.357 mg/mL、0.714 mg/mL、1.071 mg/mL、1.429 mg/mL蜂花粉濃度，發(fā)現(xiàn)其對(duì)腸道損傷小鼠的絨毛高度、隱窩深度均有顯著的保護(hù)作用(P<0.05)，而在以上濃度中1.071 mg/mL組對(duì)小鼠腸道的形態(tài)恢復(fù)效果最好。

綜上所述，腹腔注射地塞米松對(duì)小鼠小腸的組織結(jié)構(gòu)具有明顯不良影響，甚至造成損傷；飲水添加不同濃度蜂花粉對(duì)地塞米松致小鼠小腸組織結(jié)構(gòu)損傷有明顯的緩解和保護(hù)作用，其中以添加1.071 mg/mL蜂花粉濃度組對(duì)模型小鼠小腸作用最佳。