付 康，隋廣超*，史金銘*

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

原發(fā)性肝癌由于其起病隱匿，早期癥狀不明顯且發(fā)展迅速，致使確診時(shí)在大多數(shù)患者體內(nèi)已發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，使得治療難度增加，預(yù)后性差，這導(dǎo)致肝癌成為致死率最高的惡性腫瘤之一[1]。隨著近些年分離純化和化學(xué)合成技術(shù)的發(fā)展，許多具有抗癌活性的天然小分子化合物得以被分離或合成。纖細(xì)薯蕷皂苷是一種三萜類(lèi)化合物，在薯蕷科植物中含量較為豐富[2]。既往研究已報(bào)道薯蕷皂苷及其衍生物具有抗腫瘤活性[2-4]，但目前相關(guān)研究仍較少，且其對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)功能影響及價(jià)值仍不清楚。本研究以纖細(xì)薯蕷皂苷作用于人肝癌細(xì)胞系HepG2，探討其對(duì)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的作用，并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)，為纖細(xì)薯蕷皂苷抑制肝癌分子機(jī)制和臨床價(jià)值的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

來(lái)源于人的肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；CCK-8試劑盒購(gòu)買(mǎi)于MedChem Express公司；凋亡試劑盒購(gòu)買(mǎi)于南京諾唯贊生物科技有限公司；各種蛋白抗體均購(gòu)買(mǎi)于Cell Signaling Technology公司；纖細(xì)薯蕷皂苷購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Target Molecule公司。

1.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且細(xì)胞狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞，以3×104個(gè)/mL的密度，100L/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中過(guò)夜培養(yǎng)24 h。纖細(xì)薯蕷皂苷實(shí)驗(yàn)組分別加入100L溶于MEM培養(yǎng)液的終濃度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mol/L的纖細(xì)薯蕷皂苷溶液，對(duì)照組加入100 L與實(shí)驗(yàn)組依次對(duì)應(yīng)等DMSO濃度的MEM溶液，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h后，每孔加入10 L CCK-8溶液，另取三個(gè)孔不鋪細(xì)胞，只加100L MEM培養(yǎng)液和10L CCK-8溶液作為空白對(duì)照，在培養(yǎng)箱中孵育3h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)426nM處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率=[(A纖細(xì)薯蕷皂苷實(shí)驗(yàn)組-A空白對(duì)照組平均值) / (ADMSO對(duì)照組平均值-A空白對(duì)照組平均值)] ×100%

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將HepG2細(xì)胞以3×106個(gè)/mL的密度，1.5 mL/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中過(guò)夜培養(yǎng)24h。纖細(xì)薯蕷皂苷實(shí)驗(yàn)組分別加入溶于MEM培養(yǎng)液的終濃度為5、7.5、10、15、20mol/L的纖細(xì)薯蕷皂苷溶液，對(duì)照組加入與20 mol/L的纖細(xì)薯蕷皂苷溶液等DMSO濃度的MEM溶液，處理24 h后收集細(xì)胞,將細(xì)胞重懸于100 L 1×Binding Buffer，并加入5 L Annexin V-FITC和5 L PI Staining Solution，輕輕吹勻至單細(xì)胞懸液，室溫、避光，孵育10 min后加入400 L 1×Binding Buffer，輕輕混勻。染色后樣品在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀在488 nm和530 nm激發(fā)波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)。晚期凋亡細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比值為細(xì)胞晚期凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

將HepG2細(xì)胞以3×105個(gè)/mL的密度，3 mL/板接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)板中過(guò)夜培養(yǎng)24bh。實(shí)驗(yàn)組用溶于MEM培養(yǎng)液的終濃度為5、10 mol/L的纖細(xì)薯蕷皂苷溶液，對(duì)照組加入與10 mol/L的纖細(xì)薯蕷皂苷溶液等DMSO比例的MEM溶液，處理24 h后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集蛋白。采用Bradford法鑒定蛋白濃度，取20 ug蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶封閉2 h。分別用抗體PARP、cleaved PARP、caspase 3、GAPDH、BCL2進(jìn)行4°C過(guò)夜孵育。用TBST洗膜3次，再加入二抗，室溫孵育1h。用TBST洗膜4次。膜經(jīng)ECL超敏發(fā)光液顯色后進(jìn)行成像。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“±s”表示。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 纖細(xì)薯蕷皂苷對(duì) HepG2 細(xì)胞增殖的影響

纖細(xì)薯蕷皂苷在3mol/L時(shí)對(duì)HepG2的生長(zhǎng)有明顯抑制作用。隨著纖細(xì)薯蕷皂苷濃度的增加，HepG2細(xì)胞活力逐漸降低，呈現(xiàn)明顯的濃度與抑制率正相關(guān)性，其IC50為4.105M。見(jiàn)圖一。

2.2 纖細(xì)薯蕷皂苷誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡

隨著纖細(xì)薯蕷皂苷處理的濃度的升高，使HepG2發(fā)生晚期凋亡的細(xì)胞比例也逐漸上升。HepG2細(xì)胞在5、7.5、10、15和20 mol/L纖細(xì)薯蕷皂苷處理24 h后，晚期凋亡率分別為（3.1925%±0.156）%、（10.525%±0.287）%、（31.65%±0.420）%、（62.325%±1.282）%和（72.725%±1.903）%。見(jiàn)圖二。

2.3 PARP、cleaved PARP、caspase 3、BCL2蛋白水平的變化

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HepG2細(xì)胞在10 mol/L纖細(xì)薯蕷皂苷處理24 h后，細(xì)胞內(nèi)PARP蛋白水平下降，cleaved PARP蛋白水平升高說(shuō)明PARP蛋白在體內(nèi)被切割；caspase 3和BCL2蛋白水平均有下降，說(shuō)明藥物誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生了凋亡。見(jiàn)圖三。

3 討 論

纖細(xì)薯蕷皂苷是一類(lèi)在薯蕷科植物中含量豐富的薯蕷皂苷類(lèi)化合物。前人曾報(bào)道薯蕷皂苷及其類(lèi)似物對(duì)部分腫瘤細(xì)胞有抑制作用[5]，但其對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)功能影響尚不清楚。本研究針對(duì)纖細(xì)薯蕷皂苷，探究了其對(duì)人肝癌細(xì)胞的促凋亡作用及其分子機(jī)制。

BCL2家族包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中有重要作用。其中BCL2屬于BCL2家族中的抗凋亡蛋白，其定位于細(xì)胞核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和線粒體外膜上，直接影響線粒體膜功能。BCL2可通過(guò)BH3結(jié)構(gòu)域與同家族的促凋亡蛋白結(jié)合，從而形成異源二聚體，以此維持促凋亡蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位分布。若BCL2蛋白的含量相對(duì)下降，BCL2家族的促凋亡蛋白將移位到線粒體膜上，刺激線粒體釋放促凋亡因子，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6,7]。Caspase 3作為caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行者之一，活化后的caspase 3能切割PARP蛋白，從而影響DNA的復(fù)制及損傷修復(fù)[8]。

本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)纖細(xì)薯蕷皂苷處理后，HepG2細(xì)胞內(nèi)的BCL2蛋白含量相對(duì)減少，說(shuō)明纖細(xì)薯蕷皂苷很可能直接或者間接的作用于BCL2蛋白上導(dǎo)致其蛋白表達(dá)的下降，從而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Caspase 3蛋白水平的下降，表明有caspase 3 被切割而激活，同時(shí)，PARP蛋白也被切割，這些現(xiàn)象說(shuō)明caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)已進(jìn)行到了效應(yīng)階段。隨著纖細(xì)薯蕷皂苷處理濃度的升高，HepG2細(xì)胞的存活率逐漸下降，發(fā)生晚期凋亡的細(xì)胞占比也在升高，說(shuō)明纖細(xì)薯蕷皂苷能抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。

綜上所述，纖細(xì)薯蕷皂苷表現(xiàn)出的抗腫瘤活性，使其可能作為抗腫瘤藥物的主要成分而被開(kāi)發(fā)利用，有望為肝癌的臨床治療提供新的方法。