張秀霞 王冬梅 李軍濤 胡永華 鄭佩華 魯耀鵬 冼健安

摘要：從西沙群島永興島灘涂底泥中，通過富集分離純化得到1株光合細菌（編號YX-1），對菌株進行形態(tài)觀察和生理生化特性分析，經(jīng)16S rDNA鑒定為紅假單胞菌。將該菌株接種到模擬富營養(yǎng)化養(yǎng)殖污水中，結果顯示該菌株具有較強的COD、氨氮和亞硝酸鹽去除能力，優(yōu)于陽性對照菌株，可開發(fā)應用于海南水產(chǎn)養(yǎng)殖污水的凈化處理。

關鍵詞：光合細菌;分離;養(yǎng)殖污水;凈化

中圖分類號：S182?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）04-0278-04

收稿日期：2018-12-05

基金項目：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部財政專項（編號：NFZX2018）;天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室開放基金（編號：TJAE201808）。

作者簡介：張秀霞（1982—），女，廣東梅州人，碩士，工程師，主要從事水產(chǎn)健康養(yǎng)殖研究。E-mail：107265834@qq.com。

通信作者：冼健安，博士，副研究員，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)及毒理學、水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料學研究。E-mail：xian-ja@163.com。

光合細菌（photosynthetic bacteria，PSB）是一類具有光合色素、能在無氧條件下進行光合磷酸化的微生物，分布廣泛，遍及江河、沼澤、湖泊、海洋、池塘及活性污泥和土壤中[1]，易培養(yǎng)，生長速度快，繁殖力和生命力強，與自然界的C、N、S化學循環(huán)有重要關系，在自然界自我凈化過程中擔負著重要角色，在污水凈化、水產(chǎn)養(yǎng)殖、保健品研發(fā)、產(chǎn)氫、農(nóng)業(yè)等多方面得到廣泛應用[2-3]。PSB最初被應用于處理有機污水，后來逐漸引入應用到水產(chǎn)養(yǎng)殖當中。PSB在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的研究和應用主要集中在調(diào)控、改善和穩(wěn)定養(yǎng)殖水體的水質(zhì)[4]，防治疾病的發(fā)生及利用PSB作為生物餌料和營養(yǎng)性添加劑[5-6]。

本研究從西沙群島永興島灘涂底泥中富集并分離篩選出1株光合細菌菌株，對其形態(tài)學和生理生化特性進行了分析，并對其在模擬的富營養(yǎng)化對蝦養(yǎng)殖污水中的凈化效果進行了研究，為其進一步開發(fā)利用奠定基礎。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?試驗材料

試驗使用飼料為本實驗室自制對蝦飼料，陽性對照菌為市售光合細菌產(chǎn)品。

1.1.2?試驗試劑

PCR擴增試劑購自TaKaRa公司，其他試劑購自廣州化學試劑廠。

1.1.3?培養(yǎng)基配方

1.1.3.1?富集培養(yǎng)基

NaCl 2.00 g、MgSO4·7H2O 0.20 g、NH4Cl 1.00 g、NaHCO3 2.00 g、KH2PO41.75 g、CH3COONa 3.00 g、酵母膏1.00 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0[7]。

1.1.3.2?分離培養(yǎng)基

培養(yǎng)基成分見表1，按上儲備液A、B、D、E配制好后用2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值為7.0，置于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃，滅菌20 min，若配固體培養(yǎng)基則再添加2%瓊脂粉，儲備液C、 F使用時在無菌超凈工作臺中用0.22μm針孔過濾器過濾后加入。

1.2?方法

1.2.1?分離純化

樣品底泥加無菌生理鹽水重懸浮，1 000 r/min離心2 min，取出上清液6 000 r/min離心5 min，去上清，將沉淀采用無菌富集培養(yǎng)基重懸浮培養(yǎng)，液面加無菌液體石蠟覆蓋，密閉瓶口，于30 ℃，光照強度為2 500～3 000 lx光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)至液體變成紅色或者底部有紅褐色絮狀物出現(xiàn)，將培養(yǎng)液裝入無菌離心管，6 000 r/min離心5 min，沉淀采用富集培養(yǎng)基重懸浮后至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。重復上述培養(yǎng)步驟3次。將富集液梯度稀釋后取培養(yǎng)液在固體分離培養(yǎng)基上涂布，采用雙層平板法[8]多次純化分離出純種菌株。

1.2.2?形態(tài)觀察和生理生化特性分析

將純化的菌株接種于分離培養(yǎng)基培養(yǎng)，參照《伯杰細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9-10]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[11]對菌株進行形態(tài)觀察和生理生化特性分析。

1.2.3?16S rDNA鑒定

取純化的單菌落作為DNA模板，采用16S rDNA通用引物（上海生工生物工程有限公司合成），進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，送華大基因測序。測序結果在GenBank進行比對，下載相似序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4?水質(zhì)凈化能力分析

采用本實驗室自制的對蝦飼料7 g，加入200 mL海水，浸泡1 h，采用濾紙過濾，收集過濾液體。取室內(nèi)對蝦養(yǎng)殖污水與飼料浸出液按9 ∶1比例進行混合，每瓶分裝400 mL，進行高壓滅菌。將提前培養(yǎng)至菌濃度為108個/mL的菌液50 μL加入滅菌培養(yǎng)液中，空白對照組加入50 μL 滅菌培養(yǎng)液，陽性對照組加入50 μL市售光合細菌菌液，然后置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天取樣測定COD、氨氮和亞硝酸鹽含量。

2?結果與分析

2.1?光合細菌形態(tài)及生理生化特性

富集得到棕紅色菌液，采用雙層平板法反復分離，挑單菌落至液體分離培養(yǎng)基中，待液體分離培養(yǎng)基中得到紅色菌液，最終分離出菌株1株，編號為YX-1。該菌株菌落小，卵形或短桿形，邊緣平整，表面光滑濕潤，培養(yǎng)48 h為白色菌落，密封培養(yǎng)至10 d時菌落會長出棕紅色色素（圖1）。經(jīng)檢測為革蘭氏陰性菌，菌液光照足時為棕紅色，光照不足時菌液成棕黃色且菌體下沉。

由YX-1菌株的生理生化特性分析（表2）可知，該菌株為兼性厭氧菌，在缺氧環(huán)境生長更好，能利用大多數(shù)糖類，不能利用甘油作為碳源，淀粉水解陰性，明膠液化陰性，含鳥氨酸脫羧酶，不含賴氨酸和精氨酸脫羧酶，不能利用尿素作為氮源，吲哚試驗陽性，硫化氫、硝酸鹽還原陰性，含有接觸酶、氧化酶。

綜合菌落形態(tài)、培養(yǎng)方式、革蘭氏染色及各項生理生化指標，初步判定該菌株為光合細菌。

2.2?16S rDNA序列分析

測序比對結果（圖2）顯示，YX-1菌株與Rhodopseudomonas紅假單胞菌屬各模式菌株的相似性高達98%以上，在進化樹中與Rhodopseudomonas faecalis聚為1個分支，可判定YX-1 菌株為紅假單胞菌屬的菌株。

2.3?水質(zhì)凈化能力分析

2.3.1?COD去除能力

由圖3可知，空白對照組COD值基本保持穩(wěn)定，隨著時間的延長，YX-1菌株試驗組與陽性對照組的COD值不斷下降;培養(yǎng)5 d 后，由圖4可知，YX-1菌株試驗組COD去除率顯著高于陽性對照組和空白對照組（P<0.05）。

2.3.2?氨氮去除能力

由圖5可知，空白對照組氨氮含量基本保持穩(wěn)定，隨著時間的延長，YX-1菌株試驗組與陽性對照組的氨氮含量不斷下降;由圖6可知，培養(yǎng)5 d后，YX-1菌株試驗組氨氮去除率顯著高于陽性對照組和空白對照組（P<0.05）。

2.3.3?亞硝酸鹽去除能力

由圖7可知，空白對照組亞硝酸鹽含量基本保持穩(wěn)定，隨著時間的延長，YX-1菌株試驗組與陽性對照組的亞硝酸鹽含量不斷下降;由圖8可知，培養(yǎng)3 d后，YX-1菌株試驗組的亞硝酸鹽去除率已達到100%，顯著高于陽性對照組和空白對照組（P<0.05）。

3?討論

從海南西沙群島永興島灘涂淤泥中分離的光合細菌YX-1，經(jīng)細胞形態(tài)、菌落形態(tài)、培養(yǎng)特性、生理生化特性分析及16S rDNA鑒定，判定為紅螺菌科紅假單胞菌屬。通過序列比對發(fā)現(xiàn)其與Rhodopseudomonas faecalis相似性達99%，但YX-1菌株的部分生長特性與文獻報道[12]有一定的差異，因此不排除YX-1為Rhodopseudomonas新種的可能性。

Rhodopseudomonas與深紅紅螺菌（Rhodospirillum rubrum）、球形紅微菌（Rhodomicrobium sphaeroides）等是目前研究較多的產(chǎn)氫光發(fā)酵細菌，普遍存在產(chǎn)氫和固氮作用，已被廣泛應用于有機廢水的生物處理[13]。本研究篩選的YX-1菌株來源于熱帶海水環(huán)境，具有耐高溫、耐鹽、耐堿性等特性，本研究結果表明其具有較強的亞硝酸鹽、COD和氨氮去除能力，作為海南水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的水質(zhì)改良劑，該菌株具有較高開發(fā)應用價值。

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