李響，石萍萍,王甜甜，劉波，吳軍

1.遼寧大學 生命科學學院，遼寧 沈陽 110036；2.軍事醫(yī)學研究院 生物工程研究所，北京 100071；3.安徽大學 物質(zhì)科學與信息技術(shù)研究院，安徽 合肥 230000

歷史上，流感多次在世界各地大規(guī)模流行，給人類帶來了深重災(zāi)難。全球范圍內(nèi)，流感病毒每年導(dǎo)致 300 萬～500 萬例嚴重疾病和 29 萬～65 萬例死亡[1]。當循環(huán)菌株與疫苗菌株匹配時，目前的流感疫苗可提供實質(zhì)性的全體免疫力，然而預(yù)測和實際菌株不匹配時，疫苗效力就會下降。重要的是，菌株特異性免疫疫苗生產(chǎn)過程繁瑣，比如美國2009 年暴發(fā)的流感疫情在實現(xiàn)疫苗配置、批量生產(chǎn)和分發(fā)時已經(jīng)結(jié)束[2]。一些流感病毒的亞型，如H5N1、H7N7 和H9N2 可以以低頻率從動物傳播到人類，是下一次流感流行的潛在因素[3]，為了避免下次流感帶來的災(zāi)難，研發(fā)一種可以對抗多種流感病毒亞型的抗體是一個可選擇的短期預(yù)防和治療方案。CR6261、F16 等通用型抗流感病毒抗體的發(fā)現(xiàn)，為抗病毒藥物的研發(fā)帶來了新的曙光。CR6261 從季節(jié)性流感疫苗接種者的噬菌體庫分離，該抗體對 H1、H2、H5、H6、H8 和H9 等流感病毒血凝素（HA）亞型顯示出廣泛的體外中和活性，可作為新型抗流感病毒藥物[4]。

目前抗體的生產(chǎn)主要依賴哺乳動物表達系統(tǒng)，其生產(chǎn)的糖蛋白類藥物與人體來源相同或相似，但該表達系統(tǒng)生產(chǎn)成本高，生產(chǎn)周期長，影響了抗體類藥物的應(yīng)用和推廣。酵母表達系統(tǒng)具有生長速度快、便于操作、易大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)點，但酵母本身的糖基化修飾區(qū)別于哺乳動物糖基化修飾[5]，因此本研究團隊對酵母的N-糖基化修飾和O-糖基化修飾進行了定向改造，使其具有類似于哺乳細胞復(fù)雜型糖基修飾能力。改造后的酵母名為糖基工程酵母[6]，本研究團隊已經(jīng)多次在糖基工程酵母中表達重組單克隆抗體[7]。研究顯示，CR6261 之所以具有廣譜活性，是因為其抗體結(jié)合部位為HA 的莖部HA2 區(qū)域，與頭部HA1區(qū)域相比較為保守，不易發(fā)生變異。大部分抗莖抗體需要抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用（ADCC）參與體內(nèi)保護，抗莖抗體CR6261 也需要通過ADCC 在體內(nèi)進行保護[8]，抗體去除巖藻糖化后能引發(fā)更高的ADCC 活性[9]，而酵母本身表達的抗體不具有巖藻糖化修飾，酵母表達的CR6261抗體與動物細胞表達的抗體相比可能會在體內(nèi)具有更高的保護活性，這些結(jié)果提示酵母在生產(chǎn)抗莖抗體CR6261 方面具有一定的優(yōu)勢[10]。

1 材料與方法

1.1 材料

糖基工程酵母36-2ΔPA 感受態(tài)細胞由本實驗室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金科技有限公司；質(zhì)粒pPICZα-A 購自Invit?rogen 公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶、蛋白分子量marker 購自NEB 公司；DNA 回收試劑盒購自北京天根科技有限公司；羊抗人IgG（FC）-HRP購自Abcom 公司；測序和引物合成均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2 CR6261單克隆抗體全基因合成

從GenBank 獲得CR6261 抗體基因的氨基酸序列，按畢赤酵母偏好性密碼子進行全基因合成，根據(jù)基因序列分別設(shè)計輕重鏈的引物，PCR分別獲得輕重鏈基因的片段（PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s、72℃延伸 2 min，30 個循環(huán)；72℃延伸 10 min）。產(chǎn)物片段經(jīng)DNA 回收試劑盒回收。

1.3 表達載體的構(gòu)建及鑒定

1.3.1 重鏈克隆表達載體pPICZα-H 的構(gòu)建 將pPICZα-A 空載體及重鏈H 片段分別用BstbⅠ/NotⅠ雙酶切，T4DNA 連接酶16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂LLB-Zeocin 平板，37℃培養(yǎng)過夜，PCR 篩選陽性克隆，對陽性克隆進行測序，并提取pPICZα-H 質(zhì)粒。

1.3.2 輕鏈克隆表達載體pPICZα-L 的構(gòu)建 將pPICZα-A 空載體及輕鏈L 片段分別用BstbⅠ/NotⅠ雙酶切，T4DNA 連接酶16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂LLB-Zeocin 平板，37℃培養(yǎng)過夜，PCR 篩選陽性克隆，對陽性克隆進行測序，并提取pPICZα-L 質(zhì)粒。

1.3.3 輕重鏈表達載體pPICZα-CR6261-H-L 的構(gòu)建 將克隆載體pPICZα-H 用BamHⅠ酶切1 h后加入CIP 酶去磷酸化（圖1A），將克隆載體pPICZα-L 用BglⅡ/BamHⅠ雙酶切（圖1B），膠回收2 個片段并用T4DNA 連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并回收質(zhì)粒，獲得同時含有CR6261 輕重鏈的表達載體pPICZα-CR6261-H-L（圖1C）。

1.4 線性化質(zhì)粒并電轉(zhuǎn)糖基工程酵母

提取質(zhì)粒 pPICZα-CR6261-H-L，經(jīng)BamHⅠ酶切線性化，用DNA 片段回收試劑盒回收并水洗；回收的線性化質(zhì)粒通過電擊方式轉(zhuǎn)入100 μL糖基工程酵母36-2ΔPA 感受態(tài)細胞，加入900 μL 1 mol/L 山梨醇重懸，25℃搖床培養(yǎng)2 h，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂 YPD 平板（Zeocin 濃度為 100 μg/mL），3 d 后挑取單克隆。

1.5 試管培養(yǎng)單克隆酵母菌株

將YPD-Zeocin 平板上長出的單克隆接種到3 mL YPD-Zeocin 液體培養(yǎng)基中，25℃搖床培養(yǎng)3 d，此時菌密度達到最大，取100 μL 接種到3 mL BMGY 培養(yǎng)基中，25℃搖床培養(yǎng)24 h，每只試管加入30 μL 甲醇誘導(dǎo)，每隔24 h 補1%甲醇（每次皆為 30 μL)，誘導(dǎo) 72 h 后，12 000 r/min 離心5 min，收集上清。

1.6 Western印跡篩選陽性克隆

樣 品經(jīng) SDS-PAGE 分離，用 TRANS-BLOT 半干轉(zhuǎn)移膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上（恒壓19 V，1 h），將PVDF 膜置于裝滿5%牛奶封閉液（100 mL PBST 中加入5 g 脫脂奶粉）的培養(yǎng)皿中，搖床輕搖2 h，將PVDF 膜取出，轉(zhuǎn)入羊抗人IgG-HRP 的 PBST 中 ，搖床輕搖 2 h，取出 PVDF膜，PBST 洗 5 次，每次 5 min，曝光。

1.7 搖瓶上清抗體的純化

1.7.1 Protein A 純化 將培養(yǎng)上清pH 值調(diào)至7.0，用Protein A 親和柱進行純化。層析柱先用水沖洗5 倍柱體積除去柱內(nèi)酒精，再用B 緩沖液0.1 mol/L 檸檬酸溶液（pH3.0）沖洗5 個柱體積，接著用 A 緩沖液（100 mmol/L PB7.0）平衡，均以 5 mL/min 的流速上樣。上樣結(jié)束后，先用5 倍體積的A 緩沖液洗柱，再用B 緩沖液洗脫，1 mol/L Tris-base 將洗脫液 pH 值調(diào)到 7.0。

1.7.2 Superdex200 純化 層析柱用水沖洗3 倍柱體積，再用0.5 mol/L NaOH 沖洗3 倍柱體積，緩沖液（1 mol/L PB7.2+150 mmol/L NaCl）沖洗 3 個柱體積，待電導(dǎo)穩(wěn)定后樣品從上樣環(huán)處進樣，開始純化，收取12 min 洗脫峰。

1.8 純化蛋白的SDS-PAGE鑒定

純化的樣品經(jīng)SDS-PAGE（恒壓160 V，1 h），考馬斯亮藍染色。

1.9 酵母表達抗體活性的測定

圖1 pPICZα-CR6261-H-L 表達載體的構(gòu)建

用間接ELISA 方法檢測CR6261 抗體的活性，抗原為本實驗室表達并純化的血凝素HA5、HA7、HA3 以及購買的商品化三價流感病毒裂解苗。將HA5、HA7、HA3、裂解苗分別用抗原包被液進行 1/10 稀釋，各取 200 μL 樣品加入 96 孔酶聯(lián)板第一排，其他排各加入100 μL 包被液，排槍吸取第一排100 μL 液體加到下一行中，倍比稀釋；37℃包被1 h，加入PBST 清洗1 次，每孔加入5%牛奶封閉液；37℃孵育 1 h，PBST 清洗 5 次；每孔各加入純化后的CR6261 抗體（用5%牛奶進行1/500 稀釋，且加入200 μL 酵母裂解液）；37℃溫育1 h，用 PBST 洗 5 次；37℃溫育 1 h，用 PBST 水洗 5次；每孔各加入100 μL 羊抗人IgG-HRP（用5%牛奶進行1/5000 稀釋，且加入200 μL 酵母裂解液）；37℃溫育 1 h，用PBST 洗5 次；每孔各加 100 μL 顯色液，顯色 5～10 min；每孔加入 50 μL 終止液終止顯色；酶標儀讀數(shù)，計算抗體滴度。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒的鑒定

CR6261 單克隆抗體的輕重鏈基因片段PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，與預(yù)期的目的片段長度一致。PCR 產(chǎn)物回收后與pPICZα載體連接并測序，結(jié)果正確。重組質(zhì)粒pPICZα-CR6261-H-L 經(jīng)BamH Ⅰ酶切后條帶大小接近8000 bp，核酸電泳結(jié)果鑒定正確（圖2）。

2.2 CR6261單克隆抗體在糖基工程酵母中的表達

將構(gòu)建的表達載體電轉(zhuǎn)入糖基工程酵母36-2ΔPA，從YPD-Zeocin 平板上隨機挑取8 個菌落進行甲醇誘導(dǎo)表達篩選，對表達上清進行還原SDSPAGE、Western 印跡分析，結(jié)果如圖3。Western 印跡顯示2～8 號CR6261 單克隆均有重鏈蛋白表達，輕鏈蛋白未顯示出明顯條帶；9 號陽性對照與其對應(yīng)的SDS-PAGE 中9 號輕重鏈蛋白濃度相比，IgG 輕鏈只顯示出輕微條帶，可能原因是購買的商業(yè)化IgG 抗體對輕鏈靈敏度不高，因此CR6261抗體未顯示出輕鏈條帶。選取3 號接種培養(yǎng)。

2.3 CR6261蛋白的純化

圖2 重組質(zhì)粒pPICZα-CR6261-H-L 的BamHⅠ酶切電泳圖

1 L BMGY 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液上清經(jīng)Protein A 純化，洗脫樣品進行還原SDS-PAGE 分析，如圖4A 所示，Protein A 純化后的樣品存在大量降解條帶。用Superdex200 對樣品進一步純化，并對洗脫樣品進行還原SDS-PAGE 分析，結(jié)果如圖4B，色譜圖紫外吸收峰為單一吸收峰，說明洗脫樣品分子大小相近，從蛋白條帶位置來看，CR6261 抗體的輕重鏈均有表達且分子大小與陽性IgG 輕重鏈大小一致。經(jīng)2 步純化后獲得了純度較高的抗體蛋白。

2.4 CR6261抗體活性分析

圖3 陽性克隆的篩選

圖4 純化蛋白的還原SDS-PAGE 與純化圖譜

ELISA 分析純化蛋白的活性（圖5），縱坐標抗體滴度表示CR6261 抗體與抗原結(jié)合的能力，純化后的抗體與本實驗室純化的流感病毒血凝素HA7、HA5 有結(jié)合活性，其抗體滴度分別為1∶80與 1∶160，與 HA5 的結(jié)合活性最高，與 HA3 則無結(jié)合活性，這與文獻報道的CR6261 抗體結(jié)合活性相符合。由此可知酵母生產(chǎn)的CR6261 抗體可以與2 種流感病毒血凝素結(jié)合，非單一性結(jié)合符合其廣譜性質(zhì)。此抗體與商業(yè)化三價裂解苗亦有結(jié)合能力，其抗體滴度為1∶640，由于裂解疫苗為混合物，抗體滴度只能作為結(jié)合活性的參考。

圖5 抗體滴度測定

3 討論

本研究首次在糖基工程畢赤酵母中表達單克隆抗體CR6261，經(jīng)過Protein A 親和層析和spu?erdex200 凝膠過濾柱2 步分離純化獲得抗體蛋白，并且輕鏈和重鏈能夠在酵母中自發(fā)通過二硫鍵裝配成正確的結(jié)構(gòu)。糖基工程酵母表達的CR6261 抗體與血凝素HA7 和HA5 有結(jié)合活性，與HA3 則無結(jié)合活性。文獻報道的人單克隆抗體 CR6261 可以與 HA5、HA1、HA9、HA7 蛋白結(jié)合，也能與 H1N1、N5N1 滅活病毒結(jié)合，與 HA3 無結(jié)合活性，此次結(jié)果與文獻報道相符，說明糖基工程酵母表達的CR6261 抗體具有與人單克隆CR6261 抗體相似的活性。此廣譜抗體在病毒早期治療中具有重要的臨床意義，對于防治不同類型的甲型流感以及以后可能出現(xiàn)的甲型流感變異病毒都具有重要意義。

酵母系統(tǒng)近年來已經(jīng)表達了許多外源蛋白，并且取得了滿意的結(jié)果，但由于酵母中存在過度糖基化等問題，國內(nèi)外在畢赤酵母中表達全抗體的報道較少。本實驗進一步表明全抗體蛋白可在糖基工程酵母中表達，并且初步證實了其生物活性。

酵母表達上清中的抗體可利用Protein A 親和層析初步純化，凝膠過濾層析進行精細純化。SDS-PAGE 結(jié)果顯示，在純化的蛋白中，除了輕重鏈，還有降解的蛋白。在后續(xù)工作中，我們將嘗試通過優(yōu)化菌種與培養(yǎng)條件等方法改善蛋白降解情況。