趙振伯，楊怡姝，馬洪濤，盛望

北京工業(yè)大學 生命科學與生物工程學院，北京 100124

據(jù)報道2018 年全球結(jié)腸癌新發(fā)病例超過109萬例，死亡病例超過55 萬例[1]，結(jié)腸癌對人類健康的威脅不容忽視。目前，對于結(jié)腸癌的治療手段仍局限于手術(shù)切除、放療和化療。近年來，免疫治療尤其是以新抗原為靶點的免疫治療在癌癥治療中備受關(guān)注[2]。Adpgk 是從MC-38 小鼠結(jié)腸癌模型中分離并鑒定得到的新抗原[3]，其氨基酸序列由ASMTNRELM 突變?yōu)锳SMTNMELM，可以被MHC-Ⅰ分子遞呈。研究表明，靶向Adpgk 新抗原的癌癥疫苗可以誘導特異性CD8+T 細胞，減緩MC-38 腫瘤細胞的生長[3-4]。病毒樣顆粒（vi?rus-like particles，VLPs）是一類與重組抗原不同的亞單位疫苗，因其可自組裝成高度有序的重復結(jié)構(gòu)，模擬病原體的天然形態(tài)而具有較強的免疫原性[5-9]。乙肝病毒核心抗原（hepatitis B virus core antigen，HBcAg）VLPs 具有 30 nm 的粒徑，容易富集至淋巴結(jié)，從而提高抗原提呈細胞的攝取效率；病毒樣結(jié)構(gòu)賦予其較高的免疫原性和穩(wěn)定性；可以通過大腸桿菌、酵母等多種宿主進行量產(chǎn)從而降低生產(chǎn)成本[10-11]。研究表明，以HBcAg為載體構(gòu)建的嵌合抗原表位的VLPs 能夠在小鼠體內(nèi)誘導出較強的腫瘤特異性的適應(yīng)性免疫應(yīng)答[9,12-13]。本研究中，我們將結(jié)腸癌新抗原Adpgk插入截短型HBcAg 78/79 位殘基之間，構(gòu)建可以融合表達Adpgk 的HBcAg VLPs，為結(jié)腸癌病毒樣顆粒疫苗的臨床前研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌感受態(tài)細胞 DH5α、BL21（DE3）購于擎科生物技術(shù)有限公司；截短型HBcAg cDNA與pET-22b（+）質(zhì)粒由本實驗室保存；Pfu高保真聚合酶、瓊脂糖凝膠回收DNA 產(chǎn)物純化與質(zhì)?？焖傩√嵩噭┖匈徲谔旄萍加邢薰荆幌拗菩詢?nèi)切酶、T4DNA 連接酶購于 NEB 公司；Ni 瓊脂糖凝膠購于康為世紀生物科技有限公司；100 kD超濾柱購于密理博公司；鼠源His 標簽單抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；羊抗鼠熒光標記二抗購于KPL 公司。

1.2 融合基因擴增與重組表達載體構(gòu)建

將結(jié)腸癌新抗原Adpgk 直接或通過RD 連接片段插入截短型HBcAg 78/79 位殘基之間。采用重疊PCR 技術(shù)擴增這2 種Adpgk-HBcAg 融合基因（無 RD 序列與有 RD 序列）。有 RD 序列組的 4 條引物序列分別為 F1（5′-GGGAATTCCATATGGAC ATCGACCCGTACAAA-3′，下劃線處為NdeⅠ酶切位 點）、R1（5′-GTCACGCATCAGTTCCATGTTGGT CATAGAAGCGTCTTCCAGGTTAG-3′，下劃線處為重疊序列）、F2（5′-GCTTCTATGACCAACATGGAA CTGATGCGTGACCCGGCTTCTCGTGAACT-3′，下劃線處為重疊序列）、R2（5′-CCGCTCGAGAACAAC GGTGGTTTCCGGCAG-3′，下劃線處為XhoⅠ酶切位點）。無RD 序列組的4 條引物序列分別為F1（同上）、R1′（5′-CATCAGTTCCATGTTGGTCATAG AAGCGTCTTCCAGGTTAG-3′，下劃線處為重疊序列）、F2′（5′-GCTTCTATGACCAACATGGAACTGA TGCCGGCTTCTCGTGAACT-3′，下劃線處為重疊序列）、R2（同上）。以截短型HBcAg 基因為模板，通過2 輪PCR 擴增，分別得到無RD 序列與有RD 序列的嵌合Adpgk 的HBcAg 融合基因，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并對PCR 產(chǎn)物進行純化。NdeⅠ與XhoⅠ雙酶切后的2 種Adpgk-HBcAg 融合基因或pET-22b（+）載體片段經(jīng)過純化后，在 T4DNA 連接酶作用下于4℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α菌株，涂布于LB 平板（含Amp）并于37℃培養(yǎng)過夜，各挑取10 個單菌落于2 mL LB 培養(yǎng)基（含Amp）中37℃過夜振蕩培養(yǎng)，次日將菌液送北京睿博興科公司測序，測序結(jié)果比對正確的質(zhì)粒保存于-20℃?zhèn)溆茫? 種載體分別命名為Adpgk-HBcAg pET-22b（+）與 Adpgk-RDHBcAg pET-22b（+）。

1.3 嵌合VLPs的誘導表達

測序正確的2 種重組表達載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21（DE3）后涂布于LB 平板（含Amp），37℃過夜培養(yǎng)；挑取單菌落至2 mL LB 液體培養(yǎng)基（含 Amp），37℃、180 r/min 振蕩過夜培養(yǎng)作為種子液；次日，取種子液以1∶100 的比例接種至5 mL LB 液體培養(yǎng)基（含Amp，20 mmol/L 葡萄糖），37℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)至菌液D600nm為 0.8～1.0（培養(yǎng)約 3.5 h）；加入 1 mmol/L IPTG 于 30℃、180 r/min 誘導培養(yǎng) 5 h（陰性對照組：Adpgk-HBcAg 菌體未誘導，并于4℃保存5 h）；13 000 r/min 離心 1 min 收集菌體，用等體積的 PBS 洗滌菌體 2 次，加入 800 μL PBS 重懸，冰浴條件下200 W、1 s/1 s 超聲波破碎菌體2 min；13 000 r/min 離心15 min 后收集上清與沉淀，向沉淀中加入800 μL PBS，取適量上清和沉淀加入 10× SDS-PAGE 上樣緩沖液煮沸 10 min，SDSPAGE 后考馬斯亮藍染色，觀察目的蛋白的表達情況。

1.4 Western印跡

上一步所得未誘導菌體上清與表達Adpgk-RD-HBcAg 的菌體誘導上清，加入10× SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸10 min，SDS-PAGE 后轉(zhuǎn)至PVDF膜，用 5% BSA 室溫封閉1 h，TBST 潤洗后加入一抗稀釋液稀釋的His 標簽小鼠單抗，4℃孵育過夜，次日經(jīng) TBST 潤洗 3 次后加入 1∶10 000 稀釋的羊抗鼠熒光標記二抗，室溫孵育2 h，TBST 潤洗后采用Odyssey 雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描分析目的蛋白的表達情況。

1.5 嵌合VLPs的大量表達、純化與濃縮

取可成功表達目的蛋白Adpgk-RD-HBcAg 的大腸桿菌BL21 甘油菌至20 mL LB 液體培養(yǎng)基（含Amp），37℃、180 r/min 過夜培養(yǎng)，次日取種子液以1∶100 的比例接種至1 L LB 液體培養(yǎng)基（含Amp，20 mmol/L 葡萄糖），37℃、200 r/min 培養(yǎng)至菌液D600nm達 0.8～1.0（約 3.5 h），加入 1 mmol/L IPTG 于 30℃、180 r/min 誘導 5 h，6000 r/min 離心5 min 收集菌體至50 mL 離心管中，加入20 mL PBS 洗滌菌體2 次，加入20 mL PBS，冰浴下330 W、5 s/5 s 超聲波破碎菌體10 min，13 000 r/min離心30 min，收集上清用于后續(xù)純化。取4 mL混勻的Ni 瓊脂糖凝膠組裝重力親和層析柱，加入10 倍柱體積的緩沖液（10 mmol/L PBS，20 mmol/L 咪唑）平衡層析柱，向?qū)游鲋屑尤肷弦徊绞占纳锨宀⒅貜瓦^柱3 次以提高目的蛋白結(jié)合效率，加入20 倍柱體積的洗雜緩沖液（10 mmol/L PBS，40 mmol/L 咪唑）洗去雜蛋白，加入 5 倍柱體積的洗脫緩沖液（10 mmol/L PBS，500 mmol/L 咪唑）洗脫目的蛋白。洗脫后的目的蛋白用100 kD超濾柱重復濃縮5 次，將洗脫緩沖液置換為1×PBS 緩沖液，進行SDS-PAGE 分析，并將蛋白濃縮液分裝保存于-80℃冰箱。

1.6 透射電鏡成像

取適量嵌合病毒樣顆粒濃縮液滴于200 目銅網(wǎng)碳支持膜上吸附1 min，吸去多余樣品后用2%磷鎢酸染色1 min，吸去染色液，在JEM-2100 透射電子顯微鏡下成像。

2 結(jié)果

2.1 融合基因的獲得及重組表達載體的構(gòu)建

圖1 的泳道 1 和 2 分別是第 1 輪 PCR 擴增得到的Adpgk-HBcAg 融合基因上半段（5′段）及下半段（3′段），均為250 bp 左右，與預(yù)期相符；第 2 輪PCR 擴增產(chǎn)物（圖1 泳道 5）大小約 500 bp，與預(yù)期的全長Adpgk-HBcAg 融合基因相符。類似的，泳道3 和4 分別是第1 輪PCR 得到的Adpgk-RDHBcAg 融合基因上半段（5′段）及下半段（3′段），均為 250 bp 左右，與預(yù)期相符；第 2 輪 PCR 擴增產(chǎn)物（圖1 泳道6）大小約500 bp，與預(yù)期的全長Adpgk-RD-HBcAg 融合基因相符。PCR 產(chǎn)物純化后經(jīng)NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切，連接至pET-22b（+）載體，重組載體的酶切及測序鑒定結(jié)果與預(yù)期一致（結(jié)果未顯示）。

2.2 2種嵌合VLPs的誘導表達

圖1 重疊PCR 產(chǎn)物

經(jīng) IPTG 誘導后，Adpgk-HBcAg pET-22b（+）菌體裂解沉淀中相對分子質(zhì)量15×103偏上位置處出現(xiàn)特征條帶；在Adpgk-RD-HBcAg pET-22b（+）菌體裂解上清的同樣位置出現(xiàn)了特征條帶，而其沉淀中未出現(xiàn)該特征條帶，說明RD 的引入增加了目的蛋白的水溶性。未誘導的菌體在該位置出現(xiàn)較淺的特征條帶，應(yīng)為本底表達。見圖2。

2.3 Western印跡檢測Adpgk-RD-HBcAg重組蛋白的表達

采用Western 印跡可在未誘導的菌體裂解上清中檢測到相對分子質(zhì)量大于15×103的蛋白條帶（圖3 泳道 1），與預(yù)期 Adpgk-RD-HBcAg 重組蛋白大小相符；經(jīng)IPTG 誘導后，重組蛋白表達量明顯升高（圖3 泳道2）。

2.4 嵌合VLPs的誘導表達、純化與濃縮

圖2 融合蛋白的SDS-PAGE

圖3 Western 印跡檢測Adpgk-RD-HBcAg 重組蛋白的表達

Adpgk-RD-HBcAg pET-22b（+）重組表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，1 mmol/L IPTG、30℃誘導5 h，菌體超聲波裂解、離心后，通過Ni+親和層析柱純化并超濾濃縮，取菌體裂解上清與蛋白濃縮樣品進行SDS-PAGE 分析。圖4 泳道1 為未經(jīng)IPTG 誘導的菌體裂解、離心后的上清檢測結(jié)果，條帶致密是因菌體內(nèi)雜蛋白所致，而在預(yù)估位置未出現(xiàn)明顯條帶，表明未經(jīng)IPTG 誘導時目的蛋白表達量較低。泳道2 為經(jīng)IPTG 誘導后的結(jié)果，由于蛋白未經(jīng)純化，所以條帶依然非常致密，但在目的蛋白位置15×103偏上處可見一條明顯的粗條帶，表明IPTG 誘導表達的即為目的蛋白Adpgk-RD-HBcAg，且誘導表達量較高。泳道3 為誘導表達的目的蛋白經(jīng)Ni+柱純化與超濾后的結(jié)果，可見條帶致密現(xiàn)象有明顯改善，而且在預(yù)估位置有明顯條帶出現(xiàn)，說明蛋白誘導表達成功且純化效果較好。但在泳道3 中也略微可見一些其他蛋白條帶，這是因為在天然菌體中也會有一些Ni+親和的蛋白。

2.5 VLPs粒徑檢測與透射電鏡成像

取純化濃縮后的蛋白樣品做透射電鏡成像。透射電鏡下可見密集的大小均一、空心的球形病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)（圖5），直徑在30 nm 左右。這一結(jié)果表明Adpgk-RD-HBcAg 通過大腸桿菌表達后，可自組裝形成與天然病毒結(jié)構(gòu)類似的嵌合病毒樣顆粒。

圖4 目的蛋白的親和層析純化及超濾濃縮

圖5 透射電鏡成像

3 討論

由于腫瘤相關(guān)性抗原（tumor associated anti?gens，TAAs）在腫瘤細胞中過表達，并且這種過表達在同種癌癥患者中具有相似性，所以傳統(tǒng)上的癌癥疫苗主要以TAAs 作為靶點進行設(shè)計[14]。但TAAs 在正常細胞中也有表達，因此，受中樞耐受與外周耐受的影響，靶向TAAs 疫苗的免疫效果較差，同時也有一定程度的不良反應(yīng)[15-16]。隨著測序技術(shù)與計算分析技術(shù)的飛速發(fā)展，新抗原概念的出現(xiàn)為癌癥患者帶來了福音。新抗原是一種腫瘤特異性抗原，由腫瘤細胞的基因突變產(chǎn)生，在正常細胞中無表達[17-18]。與自身性抗原不同，新抗原作為一種“非我”的抗原被機體免疫系統(tǒng)識別，進而激發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性、高效且安全的免疫應(yīng)答[14]。很多研究表明，靶向新抗原的細胞毒性T 淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）是殺傷腫瘤細胞的主要T 細胞群體[19-22]。然而，正常情況下，可能由于新抗原在癌細胞中的表達水平較低或抗原提呈效率較低，病人體內(nèi)靶向新抗原的特異性CTLs 數(shù)量很少[23-24]。因此，通過設(shè)計以新抗原為靶點的癌癥疫苗來增強機體對新抗原的免疫應(yīng)答是很有必要的。

VLPs 作為一種外源性抗原的載體，表現(xiàn)出其獨特的優(yōu)勢。與野生病毒相似，高度重復有序的結(jié)構(gòu)賦予了其較高的免疫原性，被抗原提呈細胞（尤其是樹突細胞）攝取加工后，其表位通過交叉提呈機制提呈至樹突細胞表面，進而誘導產(chǎn)生強烈的細胞免疫應(yīng)答[25-27]。因此，通過基因融合，嵌合表達外源蛋白（或多肽）的VLPs 作為一種納米顆粒形式的疫苗具有較好的應(yīng)用前景。外源性多肽和VLPs 的物理性質(zhì)如電荷、等電點與疏水性都會對嵌合VLPs 的組裝與穩(wěn)定性產(chǎn)生較大影響。Abidin 等發(fā)現(xiàn)，在多瘤病毒衣殼蛋白VP1 中插入疏水性表位后，在原核表達過程中會形成難溶性聚集體，并在插入位點側(cè)翼各引入2 個天冬氨酸提高了溶解度，消除了聚集現(xiàn)象[28]。另一項研究中，Bendahmane 等發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒的衣殼蛋白對插入的短肽序列特別敏感，衣殼蛋白正電荷的增多與等電點的升高會導致VLPs 組裝受抑制與功能受損[29]。

本研究中，我們在截短的HBcAg 免疫優(yōu)勢區(qū)插入結(jié)腸癌新抗原Adpgk 后，用大腸桿菌誘導表達時出現(xiàn)了聚集現(xiàn)象。但在Adpgk 的C′端加入1個精氨酸與1 個天冬氨酸后可以解決該聚集問題，并通過親和層析與超濾濃縮制備出了可溶性嵌合VLPs。有趣的是，我們還嘗試在插入位點C′端加入10 個精氨酸，雖然同樣為可溶性表達，但在純化過程中發(fā)現(xiàn)目的蛋白與親和層析柱的結(jié)合率為0（結(jié)果未展示）。我們推測可能由于嵌合VLPs 表面豐富的正電荷導致其吸附了大量宿主蛋白與核酸，從而包埋了組氨酸標簽。因此插入外源序列后，應(yīng)盡量不改變原有VLPs 的電荷、等電點與疏水性。在重組表達載體誘導過程中發(fā)現(xiàn)，未加入IPTG 誘導的菌體有少量的本底表達，可能由于LB 培養(yǎng)基中存在的乳糖被細菌攝取利用，生成的半乳糖啟動了質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄和翻譯。大腸桿菌中存在一些與Ni+親和層析柱親和的雜蛋白，所以在保證目的蛋白濃度的情況下很難通過洗雜過程將雜蛋白完全除去，若想進一步提高目的蛋白純度，可以在VLPs 超濾濃縮后追加分子篩，并且，這些雜蛋白理論上不會影響樹突細胞對VLPs 的攝取與抗原提呈過程，即不會影響其免疫效果。另外，親和層析與超濾法都是去除細菌內(nèi)毒素的方法，所以理論上內(nèi)毒素不會超標。為了驗證嵌合Adpgk-RD-HBcAg VLPs 的免疫效果，我們之后會在C57BL/6 小鼠體內(nèi)研究其對MC38結(jié)腸癌模型腫瘤細胞的殺傷效果。