章雨卉，呂磊磊，陳林杰，魏培蓮

(浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023)

聚蘋果酸(Poly-malic acid，PMA)是以L-蘋果酸為單體脫水聚合形成的一種高分子酯類化合物。聚蘋果酸具有較好的水溶性、生物相容性以及化學(xué)衍生性，在食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景[1-3]。聚蘋果酸的水解產(chǎn)物L(fēng)-蘋果酸也廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療和保健品等領(lǐng)域[4-5]。目前，聚蘋果酸的生產(chǎn)主要有化學(xué)合成[6]和生物發(fā)酵兩種方法[7-9]?；瘜W(xué)合成法生產(chǎn)聚蘋果酸存在生產(chǎn)工藝復(fù)雜、有機(jī)溶劑殘留等問題，不利于工業(yè)化生產(chǎn)；微生物發(fā)酵法工藝簡單，耗能低，又能得到更大分子量的聚合產(chǎn)物，近年來受到廣泛關(guān)注。目前，發(fā)酵產(chǎn)聚蘋果酸的微生物主要是出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)菌株，其主要問題是發(fā)酵周期較長、產(chǎn)量較低，難以滿足商業(yè)化生產(chǎn)的需求。筆者所在實驗室前期從自然界中篩選到了一株高產(chǎn)聚蘋果酸出芽短梗霉菌株。為提高其發(fā)酵產(chǎn)量，筆者考察了培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件對該菌株產(chǎn)PMA的影響，以期為后續(xù)發(fā)酵工藝的優(yōu)化提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌 種

出芽短梗霉(AureobasidiumpullulansZUST-I13)，筆者所在實驗室分離保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：5%葡萄糖，0.1%酵母提取物，0.1%蛋白胨，0.5% KH2PO4，0.04% MgSO4·7H2O，0.1% NaCl，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：12%葡萄糖，0.3% NH4NO3，0.05% KCl，0.01% KH2PO4，0.02% MgSO4·7H2O，3% CaCO3(單獨滅菌)，pH自然。在進(jìn)行碳氮源以及鋅離子實驗時，根據(jù)實驗需要調(diào)整培養(yǎng)基成分。

1.1.3 主要試劑

98% H2SO4、無水乙醇、NH4NO3、NaCl、KCl、KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、NaOH、尿素，分析純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司；CaCO3，天津市北辰方正試劑廠；酵母提取物，生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蛋白胨，生物試劑，上海盛思生化科技有限公司；葡萄糖，分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；PDA培養(yǎng)基，杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

e2695高效液相色譜儀，美國Waters(沃特世)公司；THZ-98A搖床，上海一恒科學(xué)儀器實業(yè)有限公司；752N分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；ME55電子分析天平，瑞士梅特勒；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市江南儀器廠；SW-CJ-1D超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；YXQ-LS-高壓蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TDZ4-WS臺式低速離心機(jī)，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)：用接種環(huán)挑取斜面保藏菌種一環(huán)劃線接種于PDA斜面培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。

種子培養(yǎng)：制備種子培養(yǎng)液，裝液量為250 mL錐形瓶，每瓶50 mL，用6層紗布封口，121 ℃滅菌20 min，挑取斜面菌種兩環(huán)接種于種子培養(yǎng)基中，于180 r/min的搖床中28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：配制發(fā)酵培養(yǎng)基，把50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基裝入250 mL錐形瓶中，用6層紗布封口，121 ℃滅菌20 min，按V(種子液)∶V(發(fā)酵液)=1∶20的接種量將培養(yǎng)好的種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，180 r/min的搖床中28 ℃培養(yǎng)6 d。每組實驗做3個平行對照。

1.3.2 生物量測定方法

取一定量發(fā)酵液于試管中，加入等體積濃度為1 mol/L的HCl溶液充分振蕩除去CaCO3，4 000 r/min離心20 min，棄上清液，取沉淀，60 ℃烘干至恒重，稱重，換算為質(zhì)量濃度(單位為g/L)即為生物量。

1.3.3 聚蘋果酸的測定方法[10-11]

色譜條件：Waters e2695 HPLC色譜系統(tǒng)，Hypersil ODS C18柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，UV檢測器(檢測波長210 nm)，流動相為V(乙腈)∶V(pH為2.5的0.025 mol/L KH2PO4緩沖溶液)=5∶95，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

樣品測定：發(fā)酵液4 000 r/min離心20 min，取一定量上清液于試管中，加入等體積1 mol/L H2SO4溶液，90 ℃水浴水解9 h，取一定量水解液，根據(jù)需要進(jìn)行稀釋，稀釋液用0.22 μm微孔濾膜過濾。取未經(jīng)過水解的發(fā)酵液進(jìn)行蘋果酸質(zhì)量濃度的測定，根據(jù)測定結(jié)果，兩者之差為蘋果酸質(zhì)量濃度，蘋果酸質(zhì)量濃度乘以與聚蘋果酸的換算系數(shù)即為聚蘋果酸的質(zhì)量濃度，即

CPMA=0.864×ΔC蘋果酸

式中：0.864為蘋果酸與聚蘋果酸的換算系數(shù)，ΔC蘋果酸為發(fā)酵液酸水解前后的蘋果酸質(zhì)量濃度差。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源對聚蘋果酸發(fā)酵的影響

菌株對不同碳源的利用能力不一樣，為考察A.pullulansZUST-I13對不同碳源的利用能力，分別選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的葡萄糖、蔗糖、木糖作為碳源進(jìn)行實驗，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同碳源對聚蘋果酸發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on PMA fermentation

由圖1可知：葡萄糖作為碳源時聚蘋果酸產(chǎn)量和菌體量都最高，分別達(dá)到48.08 g/L和23.22 g/L，蔗糖次之，木糖最低，這一結(jié)果與文獻(xiàn)[2，7，9]報道一致。目前出芽短梗霉發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的碳源主要為葡萄糖和蔗糖。

2.2 氮源對聚蘋果酸發(fā)酵的影響

氮源對微生物的生長以及代謝產(chǎn)物的合成有著非常重要的影響[12]，為考察A.pullulansZUST-I13菌株對不同氮源的利用能力，分別選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的硫酸銨、尿素、硝酸銨作為氮源進(jìn)行實驗，結(jié)果如圖2所示。

圖2 氮源對聚蘋果酸發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of nitrogen sources on PMA fermentation

由圖2可知：在所測試的3種氮源中，尿素作為氮源時聚蘋果酸產(chǎn)量最高，為33.22 g/L，硫酸銨和硝酸銨則次之，但三者之間的產(chǎn)量差別不大。目前文獻(xiàn)中報道的出芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)聚蘋果酸的氮源主要有硝酸銨、硫酸銨、尿素、丁二酸銨等無機(jī)氮源[13-14]，這些氮源均能較好地支持聚蘋果酸的生產(chǎn)，說明出芽短梗霉菌株可能對氮源的選擇性不強(qiáng)。

2.3 初始pH對聚蘋果酸發(fā)酵的影響

調(diào)節(jié)發(fā)酵液的初始pH分別至3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0進(jìn)行發(fā)酵實驗，結(jié)果見圖3。

圖3 培養(yǎng)基pH對聚蘋果酸發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of pH of the medium on PMA fermentation

由圖3可知：出芽短梗霉在偏酸性環(huán)境下聚蘋果酸產(chǎn)量較高，在pH為5～7時變化不大，在pH為3時最大產(chǎn)量達(dá)到24.79 g/L。偏堿性環(huán)境有利于出芽短梗霉生長，最終的菌體量也較高，在pH為8時達(dá)到26.83 g/L。對比已有文獻(xiàn)[13，15]發(fā)現(xiàn)A.pullulansZUST-I13產(chǎn)聚蘋果酸的最適pH更低一些，聚蘋果酸的最大產(chǎn)量普遍為pH 4～6時。

2.4 培養(yǎng)溫度對聚蘋果酸發(fā)酵的影響

選擇培養(yǎng)溫度25，28 ℃進(jìn)行發(fā)酵實驗考察溫度對聚蘋果酸發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 培養(yǎng)溫度對聚蘋果酸發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of culture temperature on PMA fermentation

由圖4可知：25 ℃進(jìn)行發(fā)酵時聚蘋果酸產(chǎn)量較高，為32.43 g/L；28 ℃進(jìn)行發(fā)酵時菌體量較高，達(dá)23.67 g/L。出芽短梗霉生長繁殖和產(chǎn)聚蘋果酸的最適溫度有所不同，與殷海松[9]、李睿穎[15]等的研究結(jié)果比較一致。根據(jù)這一特點，在進(jìn)行聚蘋果酸的生產(chǎn)時，可以考慮采用變溫控制的方式，以獲得較高的產(chǎn)量。

2.5 Zn2+對聚蘋果酸發(fā)酵的影響

鋅(Zn2+)對微生物的代謝活動起著重要的調(diào)節(jié)作用，一方面它作為酶的輔基影響多種催化酶的活性；另一方面，它在蛋白質(zhì)中形成鋅指結(jié)構(gòu)參與基因表達(dá)的調(diào)控[16-17]。在培養(yǎng)基中分別加入0.05，0.1，0.15 g/L的ZnSO4·7H2O進(jìn)行發(fā)酵實驗，結(jié)果如圖5所示。

圖5 Zn2+濃度對聚蘋果酸發(fā)酵的影響Fig.5 Effects of Zn2+ concentration on PMA fermentation

由圖5可知：Zn2+對出芽短梗霉產(chǎn)聚蘋果酸有一定的促進(jìn)作用，在Zn2+質(zhì)量濃度為0.05 g/L時聚蘋果酸產(chǎn)量最大，達(dá)31.37 g/L，Zn2+質(zhì)量濃度大于0.05 g/L時聚蘋果酸產(chǎn)量略有下降，但仍高于不添加Zn2+時的產(chǎn)量。目前，Zn2+對出芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)聚蘋果酸的影響還未見報道，其促進(jìn)聚蘋果酸生產(chǎn)的機(jī)理尚有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

對影響出芽短梗霉菌株ZUST-I13發(fā)酵產(chǎn)聚蘋果酸的常見培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：ZUST-I13菌株發(fā)酵產(chǎn)聚蘋果酸最適合的碳源為葡萄糖，其次為蔗糖，木糖最差；在硫酸銨、尿素、硝酸銨3種氮源中最適氮源為尿素；酸性環(huán)境(初始pH 3～4)適宜出芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)聚蘋果酸；發(fā)酵溫度25 ℃適合聚蘋果酸的生產(chǎn)，28 ℃適合菌體的生長；金屬離子Zn2+對出芽短梗霉產(chǎn)聚蘋果酸有一定的促進(jìn)作用，在Zn2+質(zhì)量濃度為0.05 g/L時聚蘋果酸產(chǎn)量最大。以上研究結(jié)果可為出芽短梗霉菌株發(fā)酵產(chǎn)聚蘋果酸的進(jìn)一步優(yōu)化提供基礎(chǔ)。