李慧靈，陳宏基，林育成，葉德曉，周金林

(廣東金駿康生物技術(shù)有限公司，廣東 佛山 528000)

根皮素是一種天然的二氫查爾酮類化合物，主要存在于蔬菜以及蘋果、梨等水果中，具有抗氧化[1-2]、抑菌[3-4]、抑制腫瘤細(xì)胞增殖[5]、抗炎[6]、抑制酪氨酸酶活性[7]等作用，因此在食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用前景[8-10]。目前根皮素的制備方法主要有:1) 植物提取法，此種方法因根皮素在天然植物中的含量相對(duì)較低，提取成本較高[11-12]；2) 傳統(tǒng)的化學(xué)法，利用根皮苷經(jīng)酸(通常是硫酸或鹽酸)水解制備根皮素，此種方法用到了鹽酸或硫酸，給環(huán)境造成很大污染[11,13]；3) 酶法轉(zhuǎn)化，即利用根皮苷為原料，經(jīng)糖苷酶反應(yīng)，得到根皮素，此種方法由于反應(yīng)溫和，操作簡(jiǎn)單，成本低，受到諸多學(xué)者的青睞[14-15]。由于酶的性質(zhì)受很多因素的影響，因此要對(duì)酶以及轉(zhuǎn)化工藝進(jìn)行優(yōu)化。汪瑾雨等[16]利用釀酒酵母發(fā)酵液對(duì)根皮苷進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，通過(guò)單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件，最終的產(chǎn)率為70.97%，換算成轉(zhuǎn)化率只有45%；梅建鳳等[17]從蘋果皮富集培養(yǎng)物中分離篩選出紫變青霉，通過(guò)其發(fā)酵的酶液對(duì)根皮苷進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，并對(duì)轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化研究最終轉(zhuǎn)化率為90.3%，但是酶液的發(fā)酵只是在搖瓶階段，并不能滿足生產(chǎn)的需要。筆者從市售的5種糖苷酶中篩選出一種較優(yōu)的酶，并對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，使根皮素的轉(zhuǎn)化率大大的提高，為工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

90%純度根皮苷，長(zhǎng)沙中仁生物科技有限公司；β-葡萄糖苷酶，夏盛酶制劑有限責(zé)任公司；纖維二糖酶，夏盛酶制劑有限責(zé)任公司；β-葡聚糖酶，安琪酵母酶制劑公司；纖維素酶，山東蔚藍(lán)生物；多糖水解酶，云南睿丹生物技術(shù)有限公司；根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)、根皮素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，購(gòu)自上海金穗生物科技有限公司；一水檸檬酸(純度≥99.5%)和十二水合磷酸氫二鈉(純度≥99%)，購(gòu)自廣東光華科技股份有限公司。

1.2 設(shè) 備

水浴搖床HT-110X30，上海赫田科學(xué)儀器有限公司；液相色譜儀安捷倫1100，安捷倫科技中國(guó)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 根皮苷轉(zhuǎn)化根皮素生物酶的篩選

分別用纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖酶、纖維二糖酶和多糖水解酶作用于根皮苷，分別在2，4，6，8，10 h跟蹤檢測(cè)根皮素轉(zhuǎn)化率，根據(jù)酶廠家提供酶活最高工藝條件，其中緩沖液的倍數(shù)為緩沖液體積與底物質(zhì)量的比值，篩選出最適酶的反應(yīng)條件，見(jiàn)表1。

表1 5種酶的反應(yīng)條件Table 1 The reaction conditions of five enzymes

1.3.2 根皮苷轉(zhuǎn)化根皮素酶解工藝條件優(yōu)化

1) 不同pH對(duì)酶解反應(yīng)的影響

分別在pH 3.5,4.0,4.5,5.0,5.5條件下，以原料根皮苷40倍的緩沖液，溫度50 ℃，m(底物)∶m(酶)=3∶1進(jìn)行酶解反應(yīng)，10 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)化率。

2) 不同溫度對(duì)酶解反應(yīng)的影響

分別在30，40，50，60，70 ℃下，以原料根皮苷40倍的緩沖液，pH 4.0，m(底物)∶m(酶)為3∶1進(jìn)行酶解反應(yīng)，10 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)化率。

3) 不同緩沖液的倍數(shù)對(duì)酶解反應(yīng)的影響

分別在10，20，30，40，50倍的緩沖液的體系下以溫度50 ℃，pH 4.0，m(底物)∶m(酶)=3∶1進(jìn)行酶解反應(yīng)，10 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)化率。

4) 底物與酶比對(duì)酶解反應(yīng)的影響

分別以m(底物)∶m(酶)為2∶1,3∶1,4∶1,5∶1,6∶1，以溫度50 ℃，pH 4.0，原料根皮苷40倍的緩沖液，進(jìn)行酶解反應(yīng)，10 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)化率。

5) 酶解時(shí)間對(duì)酶解反應(yīng)的影響

以原料根皮苷40倍的緩沖液，pH 4.0，m(底物)∶m(酶)=3∶1，溫度50 ℃，進(jìn)行酶解反應(yīng)，分別檢測(cè)2，4，6，8，10，12，14 h后根皮素的轉(zhuǎn)化率。

6) 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝

在單因素的基礎(chǔ)上，以根皮素的轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，采用L9(34)正交表設(shè)計(jì)4因素、3水平的正交實(shí)驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行，因素水平表見(jiàn)表2。

表2 因素水平表Table 2 The table of factors and levels

7) 在最佳工藝下中試規(guī)模驗(yàn)證試驗(yàn)

在100 L規(guī)模下進(jìn)行3批酶轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證最佳工藝。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 轉(zhuǎn)化率的檢測(cè)方法

取一定體積已攪拌均勻的反應(yīng)液，抽濾后將固體在烘箱中干燥，利用DMSO溶解至一定體積，0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾。采用HPLC分析濾液中的根皮素，根據(jù)根皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算根皮素的含量。根皮素的轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式為

式中：C1為轉(zhuǎn)化液中根皮素的質(zhì)量濃度，g/L；C2為轉(zhuǎn)化液中根皮苷的質(zhì)量濃度，g/L。

1.4.2 液相條件

色譜柱：XBridge C18液相色譜柱(10 μm×250 mm×4.6 mm)；V(水相)∶V(乙腈)=75∶25；流速1 mL/min；波長(zhǎng)281 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.4.3 根皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

利用DMSO準(zhǔn)確配制10，50，100，150，200 μg/mL的系列根皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液。0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾后，取10 μL于上述色譜條件下進(jìn)樣分析，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)樣3次，計(jì)算平均峰面積，以根皮素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得根皮素標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為Y=0.769 4X-1.645(R2=0.999 7，其中R為相關(guān)系數(shù))。

2 結(jié) 果

2.1 根皮苷轉(zhuǎn)化根皮素生物酶的篩選

5種酶酶解根皮苷轉(zhuǎn)化根皮素跟蹤反應(yīng)情況見(jiàn)圖1。

圖1 5種酶酶解根皮苷轉(zhuǎn)化根皮素的轉(zhuǎn)化率比較Fig.1 Comparison of the conversion rate of phlorezin to phloretin by five enzymes

由圖1可知：5種酶中，利用纖維素酶酶解根皮苷轉(zhuǎn)化根皮素的轉(zhuǎn)化率最高，10 h后的轉(zhuǎn)化率可達(dá)86%；轉(zhuǎn)化率最低的是纖維二糖酶；β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖酶和多糖水解酶的反應(yīng)結(jié)果相差不大。纖維素酶轉(zhuǎn)化率高，其成本較低，是較理想的酶。

2.2 pH對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

不同pH的緩沖液對(duì)根皮苷轉(zhuǎn)化根皮素的影響見(jiàn)圖2。

圖2 pH對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 The influence of pH to conversion rate

在pH為4時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)最高，為73%，pH高于4或低于4，轉(zhuǎn)化率都會(huì)降低，說(shuō)明緩沖液的pH過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)影響纖維素酶的活性，從而影響轉(zhuǎn)化率。因此筆者選擇pH在3，4，5時(shí)為正交實(shí)驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.3 底物與酶質(zhì)量比對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

底物與酶質(zhì)量比(m(底物)∶(m(酶))對(duì)根皮苷轉(zhuǎn)化根皮素的影響見(jiàn)圖3。

圖3 底物與酶質(zhì)量比對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 The influence of ratio of substrate to enzyme to conversion rate

由圖3可知：隨著加酶量的增大，轉(zhuǎn)化率逐漸提高，當(dāng)酶與底物質(zhì)量比達(dá)到3∶1后，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了90%以上，再增加酶的量，反應(yīng)速率也不會(huì)大幅增加，這是因?yàn)樵诿概c底物質(zhì)量比低于3∶1時(shí)，轉(zhuǎn)化率主要受酶量的影響，而當(dāng)酶與底物質(zhì)量比達(dá)到3∶1以后，轉(zhuǎn)化率主要受底物的影響。從生產(chǎn)成本上考慮，最佳的酶底比為3∶1，因此筆者選擇2∶1,3∶1,4∶1這3個(gè)水平做正交實(shí)驗(yàn)。

2.4 緩沖液倍數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

緩沖液倍數(shù)對(duì)根皮苷轉(zhuǎn)化根皮素的影響見(jiàn)圖4。

圖4 緩沖液倍數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 The influence of multiple of buffer to conversion rate

圖4可知：轉(zhuǎn)化率在緩沖液倍數(shù)為40倍時(shí)達(dá)到最大，在40倍之前，隨著緩沖液倍數(shù)的增加，轉(zhuǎn)化率緩慢提高，達(dá)到40倍以后，再增加緩沖液的倍數(shù)轉(zhuǎn)化率不再增加，這是因?yàn)榫彌_液的倍數(shù)反映的是底物質(zhì)量濃度，在40倍之前，底物濃度可能是酶的限制性因素，當(dāng)達(dá)到一定濃度后，底物濃度不再是限制性因素，而限制性因素可能變?yōu)槊傅奶砑恿炕騪H，溫度等別的因素的影響。從10倍到50倍的反應(yīng)體系，轉(zhuǎn)化率為80%～90%之間，轉(zhuǎn)化率增加不明顯，因此從生產(chǎn)上來(lái)看，緩沖液體系過(guò)小，酶與底物不能夠充分接觸，體系過(guò)大，對(duì)生產(chǎn)量影響很大，因此筆者選定40倍的體系為最佳體系。

2.5 溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

不同的溫度對(duì)根皮苷轉(zhuǎn)化根皮素的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 The influence of temperature to conversion rate

由圖5可知：50 ℃時(shí)根皮素的轉(zhuǎn)化率最高，40 ℃和60 ℃時(shí)轉(zhuǎn)化率都有所下降，特別是在0 ℃，轉(zhuǎn)化率大幅下降，可能此種纖維素酶對(duì)高溫特別敏感，溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)使酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響酶的活性，因此筆者在后續(xù)的正交實(shí)驗(yàn)中加入45 ℃和55 ℃的水平，選擇45，50，55 ℃這3個(gè)溫度水平。

2.6 酶解時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

酶解時(shí)間對(duì)根皮苷轉(zhuǎn)化根皮素的影響見(jiàn)圖6。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 The influence of enzymolysis time to conversion rate

由圖6可知：隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化率逐漸升高，12 h以后酶轉(zhuǎn)化趨于平衡，轉(zhuǎn)化率不再提高。酶解時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)周期都有影響，因此要選擇合適的酶解時(shí)間，時(shí)間太短，根皮苷轉(zhuǎn)化為根皮素不充分，時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)延長(zhǎng)生產(chǎn)周期。筆者選擇8，10，12 h 3個(gè)水平做正交實(shí)驗(yàn)。

2.7 單因素分析結(jié)果

對(duì)溫度、pH、底物與酶質(zhì)量比、緩沖液倍數(shù)、酶解時(shí)間利用SPSS 16.0進(jìn)行單因素的顯著性分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 單因素顯著性分析結(jié)果Table 3 The results of single factor significance analysis

①P<0.01，表示極顯著性差異。

由表3可知：溫度、pH、底物與酶比，酶解時(shí)間，對(duì)根皮素的轉(zhuǎn)化率都有極顯著性的差異，緩沖液的倍數(shù)無(wú)顯著性差異，因此選擇溫度、pH、底物與酶比、酶解時(shí)間做正交實(shí)驗(yàn)。

2.8 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表1因素水平表，按照L9(34)正交表設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 正交實(shí)驗(yàn)條件下的轉(zhuǎn)化率Table 4 Conversion rates under orthogonal experimental conditions

由表4可知：各因素對(duì)根皮素轉(zhuǎn)化率的影響大小順序?yàn)锳(溫度)>D(酶與底物比)>C(酶解時(shí)間)>B(pH)，因此最佳的酶解工藝條件為A2D1C2D1，即溫度50 ℃，m(底物)∶m(酶)=2∶1，酶解時(shí)間為10 h，pH為3。

2.9 最佳工藝的驗(yàn)證

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的工藝條件(溫度50 ℃，m(底物)∶m(酶)=2∶1，酶解時(shí)間10 h，pH 3)，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，工藝優(yōu)化后的平均轉(zhuǎn)化率可達(dá)97.03%，高于正交實(shí)驗(yàn)組的任何一組實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié) 論

筆者以根皮苷為原料，從5種市售的酶中篩選出一種較優(yōu)的酶即纖維素酶進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)化根皮素，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得出了4個(gè)因素對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響順序?yàn)锳(溫度)>D(酶與底物比)>C(酶解時(shí)間)>B(pH)，在溫度50 ℃，m(底物)∶m(酶)=2∶1，酶解時(shí)間為10 h，pH為3的最優(yōu)條件下，平均轉(zhuǎn)化率為97.03%。本研究獲得了利用纖維素酶轉(zhuǎn)化根皮苷生成根皮素的工藝條件，與傳統(tǒng)的化學(xué)法和酸堿法相比，反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)單，效率高。實(shí)驗(yàn)原料根皮苷可以從蘋果、湖北海棠等植物中大量獲取；酶為纖維素酶，在食品、能源、飼料、酒精釀造、紡織等行業(yè)有廣泛的應(yīng)用，是繼糖化酶、淀粉酶以及蛋白酶之后的第四大工業(yè)酶種，其已經(jīng)是大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的產(chǎn)品，成本較低，來(lái)源廣泛。本工藝可為酶法制備根皮素的工業(yè)化提供可靠的參考。