范佳碩，楊 鑫，陳 博，盧宗梅，陳 影，喬龍江，楊 碩，李 義,3，佟 毅,3

(1.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209；2.中糧生物科技股份有限公司，安徽 蚌埠 233010；3.玉米深加工國家工程研究中心， 吉林 長春 130033；4.中糧生物科技(北京)有限公司，北京 102209；5.北京市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全源頭控制工程技術(shù)研究中心，北京 102209)

益生菌是一類能夠?qū)λ拗鳟a(chǎn)生益處的活性微生物，可以定植于人體腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能產(chǎn)生確切健康功效從而改善宿主微生態(tài)平衡，發(fā)揮有益作用[1]。乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌[2]，乳酸在調(diào)味品中應(yīng)用廣泛，是食品工業(yè)中普遍使用的酸味劑[3-4]。這類細(xì)菌在自然界中分布極為廣泛，具有豐富的物種多樣性[5]，它們不僅是研究分類、生化、遺傳、分子生物學(xué)和基因工程的理想材料，在理論上也具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值，在工業(yè)、農(nóng)牧業(yè)、食品和醫(yī)藥等與人類生活密切相關(guān)的重要領(lǐng)域應(yīng)用價(jià)值也極高[6]。植物乳桿菌與我們的生活有著密切聯(lián)系，它可以定植于人體腸道，與腸道微生物有著密切聯(lián)系[7-8]。益生菌對人體的益處包括：維持腸道菌種平衡，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高礦物質(zhì)和鐵的利用率[9-11]；抑制腫瘤細(xì)胞增長，預(yù)防癌變[12-13]；降低血液中膽固醇含量以預(yù)防心血管疾病[14]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)一些乳酸菌具有重要的生物學(xué)功能，如抗衰老、體內(nèi)體外的抗氧化活性[15]，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[16-17]等。筆者從大曲中分離篩選到一株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，通過1 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件，為該菌株的發(fā)酵生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

植物乳桿菌BC00171來源于中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸鎂0.1 g/L，醋酸鈉5 g/L，檸檬酸銨2 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，吐溫80 1 mL/L。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

KG-SX-700蒸汽滅菌鍋，日本ALP公司；2160液相色譜儀，美國安捷倫公司；UV-1750分光光度計(jì)，德國Eppendorf公司；B1-150A恒溫培養(yǎng)箱，施都凱儀器設(shè)備有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基配方

通過單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對培養(yǎng)基碳源氮源進(jìn)行篩選優(yōu)化，碳源選用葡萄糖，質(zhì)量濃度梯度分別為25，20，15，10 g/L；氮源選用酵母浸粉和牛肉膏[18]，酵母浸粉與葡萄糖質(zhì)量濃度比為3∶2，牛肉膏質(zhì)量濃度為0，5 g/L。對比培養(yǎng)20 h后的活菌數(shù)差別。

1.2.2 葡萄糖、酵母浸粉、牛肉膏響應(yīng)面法驗(yàn)證最優(yōu)濃度

通過響應(yīng)面的方法對單因素實(shí)驗(yàn)的碳氮源進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，選取葡萄糖作為植物乳桿菌的唯一碳源，酵母浸粉和牛肉膏作為氮源，質(zhì)量濃度范圍分別是：葡萄糖15～25 g/L，酵母浸粉5～30 g/L，牛肉膏0～5 g/L。應(yīng)用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)三因素響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。并以培養(yǎng)20 h的活菌數(shù)作為響應(yīng)值。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平和編碼如表1所示。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平和編碼Table 1 Response surface experimental design

1.2.3 發(fā)酵罐發(fā)酵工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上對植物乳桿菌BC00171進(jìn)行發(fā)酵罐發(fā)酵工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，對pH調(diào)控方式、接種量等條件進(jìn)行優(yōu)化[19]，得到植物乳桿菌最優(yōu)發(fā)酵工藝。

1) pH調(diào)控方式對植物乳桿菌發(fā)酵的影響

在單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，首先對pH調(diào)控方式進(jìn)行優(yōu)化，分別選擇pH不調(diào)控、加入15 g/L碳酸鈣、加入氨水維持pH為6.8這3種調(diào)控方式進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。每隔2 h取樣，檢測活菌數(shù)及發(fā)酵液上清乳酸含量和葡萄糖剩余量，根據(jù)葡萄糖的消耗速率及乳酸的生成速率對培養(yǎng)基的濃度進(jìn)行相應(yīng)更改。計(jì)算方式為

2) 接種量對植物乳桿菌發(fā)酵的影響

按照優(yōu)化的培養(yǎng)基配方及工藝條件對接種量進(jìn)行優(yōu)化，分別選擇3種接種量(3.0%，1.7%，0.4%)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測發(fā)酵過程中的活菌數(shù)。

1.3 分 析

應(yīng)用高效液相色譜(HPLC)檢測法對實(shí)驗(yàn)過程中消耗的葡萄糖含量及產(chǎn)生的乳酸含量進(jìn)行檢測，并對發(fā)酵不同時(shí)間的樣品進(jìn)行取樣，梯度稀釋法進(jìn)行活菌數(shù)檢測。

2 結(jié)果和分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基配方

選用葡萄糖、酵母浸粉、牛肉膏進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 不同培養(yǎng)基發(fā)酵20 h后活菌數(shù)及乳酸產(chǎn)量Table 2 Number of viable bacteria and yield of lactic acid after fermentation in different medium for 20 h

由表2單因素驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：牛肉膏對植物乳桿菌活菌數(shù)、乳酸產(chǎn)量沒有明顯的影響；同樣的酵母浸粉、葡萄糖比例下，提高牛肉膏質(zhì)量濃度，活菌數(shù)、乳酸產(chǎn)量沒有隨之提高；葡萄糖質(zhì)量濃度為20 g/L、酵母浸粉為30 g/L、牛肉膏不添加時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最高3.9×109CFU/mL，乳酸產(chǎn)量為11 g/L。

2.2 響應(yīng)面法驗(yàn)證葡萄糖、酵母浸粉、牛肉膏最優(yōu)質(zhì)量濃度

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法及結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法及結(jié)果Table 3 Response surface experiment design method and results

以培養(yǎng)20 h的發(fā)酵液活菌數(shù)為響應(yīng)值對響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析葡萄糖、酵母浸粉質(zhì)量濃度對活菌數(shù)的影響，牛肉膏質(zhì)量濃度保持2.5 g/L，如圖1所示。

圖1 葡萄糖、酵母浸粉質(zhì)量濃度對活菌數(shù)影響的曲面圖Fig.1 Surface diagram of the effect of glucose and yeast extract concentration on the viable count

以培養(yǎng)20 h的發(fā)酵液活菌數(shù)作為響應(yīng)值對響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析牛肉膏、酵母浸粉質(zhì)量濃度對活菌數(shù)影響，其中葡萄糖質(zhì)量濃度保持值為20 g/L，結(jié)果如圖2所示。

圖2 牛肉膏、酵母浸粉質(zhì)量濃度對活菌數(shù)影響的曲面圖Fig.2 Surface diagram of the effect of beef extract and yeast extract concentration on the viable count

以培養(yǎng)20 h的發(fā)酵液活菌數(shù)作為響應(yīng)值對響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析牛肉膏、葡萄糖質(zhì)量濃度對活菌數(shù)影響，其中酵母浸粉質(zhì)量濃度保持值為17.5 g/L，結(jié)果如圖3所示?；貧w方程方差分析如表4所示，表中SS為離均差平方和，MS為均方，F(xiàn)為統(tǒng)計(jì)量。由圖1～3及表4可知：酵母浸粉對植物乳桿菌生長是顯著相關(guān)(P=0)，葡萄糖、牛肉膏對植物乳桿菌生長是顯著不相關(guān)(P>0.05)。根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最佳方式為酵母浸粉質(zhì)量濃度30 g/L，葡萄糖質(zhì)量濃度20 g/L，牛肉膏不添加。

圖3 牛肉膏、葡萄糖質(zhì)量濃度對活菌數(shù)影響的曲面圖Fig.3 Surface diagram of the effect of beef extract and glucose concentration on the viable count

表4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equation

① *表示交互作用。

2.3 發(fā)酵罐發(fā)酵工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.3.1 pH調(diào)控方式

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知當(dāng)碳源質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，發(fā)酵終點(diǎn)的乳酸產(chǎn)量為11 g/L，即葡萄糖并沒有完全利用，因此發(fā)酵罐降低碳源濃度選取15 g/L進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對15 g/L葡萄糖在不同pH調(diào)控方式下的活菌數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果見表5。

表5 15 g/L葡萄糖在不同pH調(diào)控方式下的活菌數(shù)比較Table 5 Comparison of viable counts of 15 g/L glucose under different pH control modes

不同PH調(diào)控方式下葡萄糖及乳酸質(zhì)量濃度如圖4所示。15 g/L葡萄糖在發(fā)酵8 h時(shí)消耗完，兩組pH調(diào)控組的乳酸生成速率明顯高于不調(diào)控pH組，因此，pH的調(diào)節(jié)明顯提高了植物乳桿菌對葡萄糖的代謝速率。實(shí)驗(yàn)顯示葡萄糖的耗盡帶來發(fā)酵液pH的上升，添加碳酸鈣調(diào)控pH一組中碳酸鈣隨著植物乳桿菌乳酸的形成轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗徕}，pH維持在5.3左右，不調(diào)控pH組終點(diǎn)pH為4.1，因此，培養(yǎng)基葡萄糖含量不足，將在葡萄糖高濃度下對pH進(jìn)行調(diào)控。對40 g/L葡萄糖在不同pH調(diào)控方式下的活菌數(shù)比較，比較結(jié)果見表6。

圖4 不同pH調(diào)控方式下葡萄糖及乳酸質(zhì)量濃度Fig.4 Glucose and lactic acid contents under different pH regulation modes

表6 40 g/L葡萄糖在不同pH調(diào)控方式下的活菌數(shù)比較Table 6 Comparison of viable counts of 40 g/L glucose in different pH control modes

對40 g/L葡萄糖下不同pH調(diào)控時(shí)葡萄糖及乳酸質(zhì)量濃度進(jìn)行測試，結(jié)果如圖5所示。

圖5 40 g/L葡萄糖下不同pH調(diào)控葡萄糖及乳酸質(zhì)量濃度Fig.5 Glucose and lactic acid contents were regulated by different pH under 40 g/L glucose

由圖5可知：不調(diào)控pH組僅能消耗20 g/L葡萄糖且生長緩慢；碳酸鈣調(diào)控pH組葡萄糖消耗速率為2.5 g/(L·h)，發(fā)酵16 h后將葡萄糖全部消耗完且此時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最高；pH維持6.8的組葡萄糖消耗速率為4 g/(L·h)，發(fā)酵10 h，葡萄糖被消耗完，活菌數(shù)在發(fā)酵12 h時(shí)達(dá)到最高。添加碳酸鈣組延緩了發(fā)酵過程但是活菌數(shù)仍可達(dá)到與pH維持6.8的組同樣的數(shù)量級，故可根據(jù)不同的發(fā)酵需求，選擇不同的pH調(diào)控方式。

2.3.2 接種量對植物乳桿菌發(fā)酵的影響

按照優(yōu)化的培養(yǎng)基配方及工藝條件對接種量進(jìn)行優(yōu)化，分別選擇3.0%，1.7%，0.4% 3種接種量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別檢測培養(yǎng)6，8，10，12，14，16，20 h發(fā)酵過程中的活菌數(shù)，結(jié)果見表7。接種量的降低，直接降低了活菌數(shù)，選擇3%接種量可以保證活菌數(shù)達(dá)到最高。

表7 不同接種量的活菌數(shù)比較Table 7 Comparison of viable counts of different inoculations

3 結(jié) 論

植物乳桿菌在免疫調(diào)節(jié)、降低膽固醇以及對腸道菌群的調(diào)節(jié)、抗衰老等方面有著十分顯著的影響，將其進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)必定能為人類健康問題帶來光明。筆者應(yīng)用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法對葡萄糖、酵母浸粉、牛肉膏的質(zhì)量濃度進(jìn)行了優(yōu)化，并利用1 L發(fā)酵罐對發(fā)酵條件進(jìn)行研究，最終得到植物乳桿菌BC00171搖瓶的最優(yōu)培養(yǎng)基配方，在此培養(yǎng)基配方下發(fā)酵20 h后活菌數(shù)達(dá)到109CFU/mL。通過對發(fā)酵罐發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化后得到發(fā)酵罐最優(yōu)培養(yǎng)基，在此配方條件下，按照接種量3%，發(fā)酵過程中控制pH為6.8，發(fā)酵12 h后活菌數(shù)即可達(dá)到百億，不僅提高了活菌數(shù)還大大縮短了發(fā)酵周期。