夏 青，狄 冉，劉艷琴，劉秋月，王翔宇，胡文萍，馬 琳，儲明星*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京100193；2.內(nèi)蒙古烏拉特中旗動物疫病預(yù)防控制中心，烏拉特中旗015300)

綿羊(Ovisaries)的發(fā)情性狀主要受外界光照時間長度周期性變化的影響，這種影響造成世界上絕大多數(shù)綿羊為季節(jié)性發(fā)情品種[1-2]。綿羊為短日照動物，在短日照條件下進行繁殖活動，這是限制綿羊生產(chǎn)效率的重要因素之一。因此，探究綿羊的季節(jié)性發(fā)情分子機制，找到參與季節(jié)性發(fā)情調(diào)控的基因并將其應(yīng)用于育種實踐，是提高綿羊繁殖力的有效方法之一。

本實驗室前期選取了9個中國本地綿羊品種，將這些綿羊分為常年發(fā)情組(湖羊、小尾寒羊和策勒黑羊)和季節(jié)性發(fā)情組(灘羊、歐拉型藏羊、草原型藏羊、山谷型藏羊、烏珠穆沁羊和巴音布魯克羊)，使用Fst檢驗[3]進行分析，鑒定選擇信號，篩選出135個受選擇的基因。定義顯著位點為Z(Fst) >5[4-5]，曼哈頓圖篩選到可能與季節(jié)性發(fā)情相關(guān)的促甲狀腺激素受體(Thyroid-stimulating hormone receptor, TSHR)基因。

TSHR主要在甲狀腺細胞表達，在控制甲狀腺細胞新陳代謝方面發(fā)揮重要作用。TSHR能夠維持甲狀腺濾泡的正常功能，并促進甲狀腺濾泡生長[6-7]。TSHR還可以在下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal axis, HPGA)中發(fā)揮重要作用，TSHR與下丘腦中的促甲狀腺激素β亞基(thyrotrophin β subunit,TSHβ)結(jié)合，通過cAMP信號通路使下丘腦室管膜細胞中的的Ⅲ型脫碘酶(type Ⅲ thyroid hormone deiodinase,DIO3)轉(zhuǎn)化為Ⅱ型脫碘酶(type thyroid Ⅱ hormone deiodinase,DIO2)，調(diào)控T3與T4的轉(zhuǎn)化，進而調(diào)控光周期應(yīng)答和季節(jié)性繁殖[8-10]。

本研究以常年發(fā)情的小尾寒羊和季節(jié)性發(fā)情的蘇尼特羊為試驗動物，檢測在發(fā)情相關(guān)組織中TSHR基因表達特征以及2個不同品種之間的表達差異，利用SequenomMassARRAY○RSNP技術(shù)對TSHR基因內(nèi)含子上的g.89290286A>G和g.89355312G>A位點突變在季節(jié)性發(fā)情組和常年發(fā)情組共6個品種綿羊中分型，分析上述2個位點的多態(tài)性，并與季節(jié)性發(fā)情性狀進行關(guān)聯(lián)，以揭示TSHR基因g.89290286A>G和g.89355312G>A位點與綿羊季節(jié)性發(fā)情的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 基因表達試驗樣品采集

試驗羊來自天津市畜牧獸醫(yī)研究所畜禽繁育基地飼養(yǎng)的2～3周歲健康的卵巢切除(OVX)母羊。選擇在長光照條件下飼養(yǎng)的小尾寒羊(Small Tail Han sheep, STH)和蘇尼特羊(Sunite sheep, SNT)各3只。屠宰后，迅速采集垂體、下丘腦和大腦共三種新鮮組織樣品，裝入2 mL凍存管，并儲存在-80 ℃冰箱中備用。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中綿羊TSHR基因序列(GenBank登錄號： XM_012180606)，用Primer 3軟件設(shè)計1對熒光定量引物，內(nèi)參基因選用β-actin，引物信息見表1。

表1 熒光定量引物信息Table 1 The information of fluorescent quantitative primer

1.3 組織RNA提取和cDNA合成

利用動物組織總RNA提取試劑盒(天根，北京)加Trizol(Invitrogen，美國)提取各組織總RNA，并用Nanodrop2000檢測提取的RNA濃度和OD值，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。使用PrimerScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，按照說明書進行操作。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋后，用內(nèi)參基因β-actin進行PCR檢測，檢測合格后，-20 ℃保存。

1.4 實時熒光定量PCR(qPCR)

根據(jù)課題組前期設(shè)置的qPCR體系和程序[11-12]，建立和繪制目的基因及持家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測引物擴增效率和熔解曲線狀態(tài)，并進行qPCR反應(yīng)以檢測目的基因的相對表達量。

1.5 基因分型

對TSHR基因g.89290286A>G和g.89355312G>A位點在不同發(fā)情性狀的綿羊品種中進行分型，采用SequenomMassARRAY○RSNP[13-14]技術(shù)對上述2個位點進行基因型檢測。分型樣品選擇：小尾寒羊407只、灘羊22只、蘇尼特羊21只、草原型藏羊161只、湖羊101只、策勒黑羊52只，其中小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊為常年發(fā)情品種，其它3個都是季節(jié)性發(fā)情品種。分型樣品為DNA，每個樣品需要量為20 μL，DNA濃度為40～80 ng/μL。

1.6 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)2-ΔΔCt法[15]計算目的基因相對表達量；借助Microsoft Excel計算TSHR基因g.89290286A>G和g.89355312G>A位點的基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量(PIC)、雜合度(HE)及有效等位基因數(shù)(NE)，并進行Hardy-Weinberg檢測。利用SPSS 19.0 軟件中卡方獨立性檢驗進行常年發(fā)情組和季節(jié)性發(fā)情組間基因頻率與基因型頻率差異顯著性檢驗，所得數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 TSHR基因在不同特征綿羊品種季節(jié)性發(fā)情相關(guān)組織中的表達

通過qPCR檢測長光照下常年發(fā)情的小尾寒羊和季節(jié)性發(fā)情的蘇尼特羊相關(guān)組織TSHR基因的表達，比較常年發(fā)情和季節(jié)性發(fā)情綿羊各組織TSHR基因的表達差異，結(jié)果如圖1所示：TSHR基因主要在小尾寒羊和蘇尼特羊下丘腦中表達，且無論小尾寒羊還是蘇尼特羊，TSHR基因在下丘腦中表達量均極顯著高于大腦和垂體(P<0.01)；蘇尼特羊下丘腦組織TSHR表達量極顯著高于小尾寒羊下丘腦組織(P<0.01)，大腦和垂體TSHR表達量在小尾寒羊和蘇尼特羊之間均無顯著差異(P>0.05)。

2.2 TSHR的多態(tài)性分析

通過基因分型發(fā)現(xiàn)TSHR基因g.89290286A>G和g.89355312G>A位點在常年發(fā)情和季節(jié)性發(fā)情綿羊品種中均存在三種基因型，分別是AA、GA和GG(見圖2)。從表2可知，綿羊TSHR基因g.89290286A>G和g.89355312G>A位點的基因型頻率在常年發(fā)情和季節(jié)性發(fā)情綿羊品種間差異均達到極顯著水平(P<0.01)，而等位基因頻率在常年發(fā)情和季節(jié)性發(fā)情綿羊品種間差異均未達到顯著水平(P>0.05)，就g.89290286A>G位點而言，常年發(fā)情品種和季節(jié)性發(fā)情品種中AA均為優(yōu)勢基因型，A均為優(yōu)勢等位基因。

另外，分析了綿羊TSHR基因g.89290286A>G和g.89355312G>A位點在常年發(fā)情綿羊和季節(jié)性發(fā)情綿羊中的多態(tài)性，結(jié)果如表3所示。綿羊TSHR基因g.89290286A>G位點在小尾寒羊、策勒黑羊和草原型藏羊中表現(xiàn)為中度多態(tài)(0.25A位點在小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊、灘羊、蘇尼特羊和草原型藏羊中表現(xiàn)為中度多態(tài)(0.25

3 討 論

3.1 TSHR基因表達與綿羊發(fā)情之間的關(guān)系

國外研究者通過全基因組重測序發(fā)現(xiàn)TSHR基因在雞和綿羊中作為繁殖性狀候選基因受到強烈選擇[16-19]。目前的研究發(fā)現(xiàn)TSHR主要在甲狀腺細胞表達[6,20]，并且在綿羊腦部的垂體結(jié)節(jié)部、正中隆起、室管膜室旁核和第三腦室等組織中均有表達[21-24]，這與本研究結(jié)果趨勢一致，在本試驗中發(fā)現(xiàn)TSHR主要在下丘腦組織中表達，推測下丘腦可能是綿羊TSHR基因發(fā)揮作用的主要部位，而下丘腦直接參與HPGA的生理調(diào)控過程。已有研究發(fā)現(xiàn)，在長光照下下丘腦中的TSHR與TSHβ相互作用后間接引起T3濃度的上升，高濃度的T3進而抑制綿羊的發(fā)情[25-28]。本研究結(jié)果顯示，在長光照下，蘇尼特羊下丘腦中TSHR基因表達量極顯著高于小尾寒羊，推測蘇尼特羊中高濃度的TSHR可能與更多的TSHβ結(jié)合，間接上調(diào)T3的分泌，高濃度的T3促使蘇尼特羊進入休情狀態(tài)。而小尾寒羊下丘腦中TSHR濃度相對較低，因此T3濃度相對較低，低濃度的T3可使小尾寒羊在長光照下依然保持發(fā)情狀態(tài)。綜上，提示我們TSHR基因的表達對于綿羊的季節(jié)性發(fā)情有一定的調(diào)控作用。

表2 TSHR基因g.89290286A>G和g.89355312G>A位點在常年發(fā)情和季節(jié)性發(fā)情綿羊品種中的基因型頻率和等位基因頻率Table 2 Genotype frequency and allele frequency of the locus of g.89290286A>G and g.89355312G>A of TSHRgene in year-round estrus and seasonal estrus

表3 TSHR基因g.89290286A>G和g.89355312G>A位點在不同綿羊品種中的群體遺傳學(xué)分析Table 3 Population genetic analysis of the locus of g.89290286A>Gand g.89355312G>A ofTSHR gene in different breeds of sheep

注：P<0.05表示位點在該品種中未處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)

Note: P<0.05 indicates that the locus is not in the Hardy-Weinberg equilibrium.

3.2 TSHR基因多態(tài)性及其與綿羊發(fā)情之間的關(guān)系

目前，關(guān)于綿羊TSHR基因的多態(tài)性及其與綿羊季節(jié)性發(fā)情之間關(guān)系的研究鮮有報道。綿羊TSHR基因g.89290286A>G和g.89355312G>A位點在6個綿羊品種中表現(xiàn)為中度多態(tài)或低度多態(tài)，說明上述6個品種的選擇潛力不大，可能由于所選擇的樣本群體存在一定的局限性。TSHR基因2個位點在6個綿羊群體中均不處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)，說明種群可能受到人工或自然選擇、遷移和遺傳漂變的影響，這2個位點在適應(yīng)性方面不具有遺傳優(yōu)勢。2個位點的基因型頻率在常年發(fā)情和季節(jié)性發(fā)情綿羊品種間基本趨于一致，推測以上2個位點與綿羊的季節(jié)性發(fā)情存在一定關(guān)聯(lián)。

4 結(jié) 論

本試驗初步提示,TSHR基因表達可能與綿羊季節(jié)性發(fā)情有關(guān)，該基因表達水平較高時可能促進綿羊進入休情狀態(tài)。g.89290286A>G和g.89355312G>A位點與綿羊季節(jié)性發(fā)情性狀可能存在一定關(guān)聯(lián)。