孫珂欣，郭應(yīng)威，曹 睿，趙海東，孫秀柱

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

選種是動物育種工作的重要環(huán)節(jié)。多數(shù)情況下，人們利用動物的生長性狀作為標(biāo)記、結(jié)合傳統(tǒng)育種方法進(jìn)行選種。資料顯示，豬繁殖力每年的選擇反應(yīng)僅為平均產(chǎn)仔數(shù)的0.06%[1]，采用傳統(tǒng)育種方法很難對其做出改良。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，插入/缺失(Insertion/Deletion，InDel)分子標(biāo)記出現(xiàn)在人們的視野中。InDel突變是指在近源物種或者同一物種基因組同一位點(diǎn)上發(fā)生了長度在5～50 bp左右的插入或缺失的突變，而InDel標(biāo)記則是根據(jù)InDel突變位點(diǎn)而設(shè)計的遺傳標(biāo)記。InDel具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)分布廣泛、密度大、突變率低：Mills等[2]證明，每7.2 kb就會出現(xiàn)一個InDel位點(diǎn)，而InDel的突變率約為10-8；(2)InDel標(biāo)記易于分型：與復(fù)雜的SNP分型系統(tǒng)相比，InDel分型簡單快捷，利用PCR以及電泳平臺即可方便簡潔地進(jìn)行。這些優(yōu)點(diǎn)使InDel成為了優(yōu)秀的新一代分子標(biāo)記，為家畜育種工作提供了新方法[3]。但I(xiàn)nDel位點(diǎn)影響家畜性狀的機(jī)理尚未研究透徹，還需要更加深入的探索，才能為動物育種工作提供更為可靠的依據(jù)。

1 InDel標(biāo)記在家畜育種工作中的應(yīng)用

1.1 InDel標(biāo)記在牛育種工作中的應(yīng)用

1.1.1 InDel標(biāo)記在牛生長性狀選育中的應(yīng)用 配對框(PairedBox，PAX)基因家族的PAX7基因，其表達(dá)產(chǎn)物是強(qiáng)有力的生肌性誘導(dǎo)物，它的表達(dá)在正常的肌衛(wèi)星細(xì)胞中是必要的，在宏觀上影響著中樞神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼肌的發(fā)育。研究表明，對小鼠進(jìn)行PAX7基因敲除，小鼠會出現(xiàn)肌肉畸形，而基因型為純合缺失的小鼠的體型較正常小鼠明顯更小。基于現(xiàn)有的PAX7基因相關(guān)研究成果，Xu等[4]研究發(fā)現(xiàn)，中國黃牛PAX7基因中具有一個10 bp的InDel位點(diǎn)，此位點(diǎn)的多態(tài)性與6月齡牛的體重、身高、體長、心臟周長和平均日增重等生長性狀均具有極顯著相關(guān)的關(guān)系；而對于12月齡牛，此位點(diǎn)與牛的體重、體長和心臟周長密切相關(guān)，同時，基因型呈Del-Del的個體在生長性狀方面的表現(xiàn)明顯優(yōu)于Ins-Ins和Ins-Del基因型的個體。這一研究成果為改良中國黃牛的工作提供了一定的理論依據(jù)。

影響牛肉肉質(zhì)的主要因素是肌間脂肪的沉積情況。而脂肪酸轉(zhuǎn)位酶CD36廣泛存在于骨骼肌，脂肪等多種組織細(xì)胞的細(xì)胞膜，此酶的表達(dá)與機(jī)體脂質(zhì)代謝、肥胖等表型密切相關(guān)。2014年，張松[5]將秦川牛母牛的CD36基因與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1基因作為研究對象，檢測兩者的多態(tài)性，并與秦川牛的肉質(zhì)性狀、體尺性狀做出關(guān)聯(lián)分析。以期研究CD36基因和KEAP1基因?qū)η卮ㄅＩL性狀的影響。研究結(jié)果顯示，在CD36基因上存在一個編號為SV1的8 bp InDel位點(diǎn)，而單個SV1位點(diǎn)的多態(tài)性以及SV1與其他多態(tài)性位點(diǎn)的不同組合，都與肌內(nèi)脂肪含量具有顯著相關(guān)。經(jīng)徐麗[6]對比西門塔爾牛與大連雪龍牛的同樣影響脂肪沉積的SREBP1基因的84 bpInDel位點(diǎn)缺失頻率與兩群體的脂肪相關(guān)性狀，證明SREBP1基因的第五內(nèi)含子區(qū)84 bp插入缺失與大連雪龍牛的背膘厚具有顯著相關(guān)。SREBP1基因可以促進(jìn)細(xì)胞生成脂肪，而此84 bpInDel位點(diǎn)同時顯著著影響棕櫚油酸、硬脂酸含量、SFA和甘油三酯及C16脂肪酸不飽和指數(shù)。這些研究結(jié)果或可在改良中國黃牛性狀，培育高質(zhì)量肉牛的工作中發(fā)揮作用。

1.1.2 InDel標(biāo)記在?？共⌒誀钸x育種的應(yīng)用 牛腦海綿狀病(Bovine spongiform encephalopathy,BSE)是一類慢性致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病，最早在羊、貓身上被人們所發(fā)現(xiàn)。在瘋牛病的致病機(jī)制中，朊蛋白(Prion Protein，PrP)的表達(dá)水平與BSE的易感性密切相關(guān)。PrP蛋白無需DNA或RNA的參與便可以自我復(fù)制，這種蛋白的異常變構(gòu)使得其不能被蛋白酶K分解，從而在腦組織中沉積，引起神經(jīng)細(xì)胞退行性病變[7]?？刂芇RP的PRNP基因中，與瘋牛病易感性相關(guān)的基因多態(tài)主要包括位于PRNP基因啟動子區(qū)域的23 bp InDel多態(tài)與位于內(nèi)含子區(qū)域的12 bp InDel多態(tài)。2007年，Hasee等[8]的研究顯示，當(dāng)對具有相似等位基因和基因型的品種進(jìn)行品種間比對時，23 bp InDel位點(diǎn)的多態(tài)性與BSE的易感性具有顯著相關(guān)。另外，2015年，為研究水牛對瘋牛病的不易感性狀，青麗麗[9]對水牛中的朊病毒基因多態(tài)性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在水牛的PRNP基因23-bp與12-bp的多態(tài)中，與瘋牛病易感密切相關(guān)的缺失型等位基因出現(xiàn)頻率非常低。這一結(jié)果解釋了這兩種非常相近的動物在對瘋牛病易感性的差異。同時也為培育不易患病的黃牛品種、規(guī)避瘋牛病傳染發(fā)生做出了一定的指導(dǎo)。

1.2 InDel標(biāo)記在羊育種工作中的應(yīng)用

1.2.1 InDel標(biāo)記在毛發(fā)性狀選育種的應(yīng)用 羊毛的質(zhì)量與產(chǎn)量都是產(chǎn)毛性能的一部分，產(chǎn)毛量和質(zhì)量又都與毛囊的數(shù)量與發(fā)育情況有關(guān)。羊皮膚毛囊中的細(xì)胞間粘附部分由橋粒蛋白介導(dǎo)，橋粒又由多種蛋白質(zhì)組成，包括橋粒核心糖蛋白和橋粒蛋白。橋粒芯糖蛋白4(desmoglein 4，DSG4)的表達(dá)水平密切影響著哺乳動物毛囊生長和分化。Zhang等[10]確定了位于綿羊DSG4胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的甘氨酸InDel位點(diǎn)，此InDel位點(diǎn)與另外5個氨基酸取代位點(diǎn)共同形成了兩種類型的DSG4。但這些DSG4多態(tài)性是否與羊中的羊毛性狀相關(guān)還有待研究。

1.2.2 InDel標(biāo)記在羊繁殖性狀選育中的應(yīng)用 在各種家畜的養(yǎng)殖工作與遺傳育種工作中，改良家畜繁殖力都是提高生產(chǎn)力的直接途徑。賴氨酸去甲基化酶6A(Lysine Demethylase 6A，KDM6A)是與繁殖力有關(guān)的候選基因，若敲除KDM6A基因，小鼠配子發(fā)育即受到限制，說明KDM6A與動物的繁殖密切相關(guān)。Cui等[11]鎖定陜北白絨山羊KDM6A基因的mRNA表達(dá)譜以確定基因中的InDel變體，發(fā)現(xiàn)了一個16 bp的InDel位點(diǎn)和一個5 bp的InDel位點(diǎn)。其中，16 bp InDel位點(diǎn)呈插入/插入基因型的個體平均首胎產(chǎn)仔數(shù)高于缺失/缺失基因型個體，單羊羔母羊與多羊羔母羊的16 bp indel位點(diǎn)基因型也存在顯著差異，證明此位點(diǎn)與山羊的第一胎產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)，同時影響著山羊的多胎性狀。

生長分化因子-9(Growth differentiation factor-9，GDF-9)基因是家畜高效增殖的候選基因，它參與著雌性動物生殖活動中的幾種關(guān)鍵性顆粒細(xì)胞酶的調(diào)控。Wang等[12]在陜北白絨山羊和關(guān)中奶山羊的GFD-9基因上發(fā)現(xiàn)了一個新的12 bp的InDel位點(diǎn)，陜北白絨山羊群體中同時存在著插入/插入、插入/缺失、缺失/缺失的基因類型，而呈純合基因型的母羊首胎產(chǎn)仔數(shù)明顯大于雜合基因型的母羊，在后續(xù)的跟進(jìn)分析中，單羔母羊與多羔母羊之間的基因型分布也存在著顯著差異。

LIM同源框基因4(LIM Homeobox 4，LHX4)基因影響著動物的垂體發(fā)育與激素分泌，Yan等[13]在陜北白絨山羊的LHX4基因中發(fā)現(xiàn)了一個新的12 bp indel位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)基因型在單羊羔和多羊羔母羊中的分布具有顯著差異，表明該位點(diǎn)可能會影響山羊的產(chǎn)仔數(shù)量，可被選為山羊育種的遺傳標(biāo)記，為山羊的育種提供了一定的理論依據(jù)。

LIM同源框基因是同源框基因家族中的一員，其表達(dá)產(chǎn)物是LIM同源框轉(zhuǎn)錄因子，用以調(diào)控體內(nèi)某些基因的表達(dá)，決定著組織和細(xì)胞的特異性分化，而LIM家族中的LHX3基因表達(dá)產(chǎn)物密切影響著動物的垂體早期發(fā)育以及垂體激素分泌過程[14]。Zhao等[15]研究證實(shí)了同羊等4個地方羊品種的LHX3內(nèi)含子區(qū)內(nèi)包含一個29 bp的indel位點(diǎn)，而高生育力品種與低生育力品種的此位點(diǎn)基因型具有顯著差異，這表明羊生育力的高低與這個indel位點(diǎn)之間具有一定的相關(guān)性；同時，純合的插入/插入基因型是最有利于同羊生長的基因型，這種基因型的個體生長性狀明顯優(yōu)于雜合基因型的個體。

1.2.3 InDel標(biāo)記在羊生長性狀選育中的應(yīng)用 生長激素(growth hormone，GH)是調(diào)節(jié)動物生長發(fā)育等代謝過程的一個重要內(nèi)分泌因子。其與靶細(xì)胞膜表面的生長激素受體(growth hormone receptor，GHR)的結(jié)合是GH在組織中發(fā)揮作用的第一步也是最重要的一步[16]。Yang等[17]研究了山羊的GHR基因，并發(fā)現(xiàn)了一個新的14 bp InDel位點(diǎn)。此位點(diǎn)的插入/插入型個體在身高、體長、胸寬、胸深、髖關(guān)節(jié)高度等性狀上顯著優(yōu)于其他個體，同時，山羊中單羔和多羔的母羊之間基因型也存在著顯著差異。數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析顯示，這個14 bp的InDel位點(diǎn)顯著影響著山羊的體尺性狀及首胎產(chǎn)仔數(shù)。

朊病毒蛋白基因表達(dá)不僅影響動物的海綿狀腦病，同時也影響著反芻動物的表型性狀。為研究PRNP基因多態(tài)性與羊的生長性狀之間的關(guān)系，Li等[18]對中國與蒙古的五個羊品種的健康個體進(jìn)行了鑒定分析。檢測工作包含了三個位于內(nèi)含子，一個位于3'UTR的InDel位點(diǎn)，這些InDel位點(diǎn)的多態(tài)性與13種不同的生長性狀顯著相關(guān)。其中位于內(nèi)含子的15 bp InDel位點(diǎn)與小尾寒羊的胸寬具有極顯著關(guān)聯(lián)；位于3'UTR的7 bp InDel位點(diǎn)又極顯著地影響著湖羊的胸圍。以上研究對綿羊的育種工作具有一定的指導(dǎo)意義；而在山羊的研究工作方面，Lan等[19]發(fā)現(xiàn)了一個新的位于PRNP基因的28 bp indel位點(diǎn)，在內(nèi)蒙古白絨山羊群體中，此位點(diǎn)的多態(tài)性顯著影響著一歲齡羊的體重與三歲羊的羊毛厚度。同時，此位點(diǎn)多態(tài)性還與西農(nóng)薩能羊的產(chǎn)奶量顯著相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)可以幫助人們在進(jìn)行山羊選育工作時選擇較為優(yōu)良的基因組合個體，從而達(dá)到快速提高生產(chǎn)力、改良現(xiàn)有品種的效果。

1.3 InDel標(biāo)記在雞育種工作中的應(yīng)用

1.3.1 InDel標(biāo)記在雞生長性狀選育中的應(yīng)用 雞的腹脂率對其胴體品質(zhì)具有極大的影響，雞腹脂率越低，則胴體品質(zhì)越高。梁浩等[20]對肉雞高、低腹脂雙向選擇品系第十九世代肉雞為研究對象，在低脂系肉雞基因組中挖掘出71個插入/缺失性RNA編輯位點(diǎn)，同時在挖掘出高脂系肉雞基因組中的71個插入/缺失型RNA編輯位點(diǎn)。

Zhang等[21]鑒定了雞的PAX7基因內(nèi)一個新的31 bp InDel位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)顯著影響4、6、8、10、12周齡雞的體重和體長指數(shù)，這些生長性包括胴體重、去內(nèi)臟重、胸肌肌纖維直徑等。這說明位于PAX7基因第3內(nèi)含子中的31 bp InDel位點(diǎn)多態(tài)性與雞生長、胴體、肉質(zhì)性狀相關(guān)，此位點(diǎn)的缺失類型會導(dǎo)致雞的正常生長和胴體性狀產(chǎn)生負(fù)面效果，但對雞的肉質(zhì)性狀具有一定的積極影響。

磷脂酸磷酸水解酶基因，也稱為磷脂酸磷酸水解酶(Lipid Phosphate Phosphohydrolase，LPIN)基因，這個基因家族在雙向調(diào)控機(jī)體脂肪代謝的過程中發(fā)揮著重要作用。LPIN基因家族中的一員--LPIN1基因，其表達(dá)水平影響脂肪沉積，而不正常的不表達(dá)、過量表達(dá)均會引起脂肪沉積的劇烈變化[22]。Wang等[23]鑒定了雞的LPIN1基因外顯子及其側(cè)翼區(qū)域，共檢測到3個InDel位點(diǎn)，其中，6 bp InDel位點(diǎn)多態(tài)性與雛雞的出殼重、2周齡體重均有顯著影響；而3 bp InDel的位點(diǎn)多態(tài)性對4周齡、6周齡體重，盲腸長度等性狀有顯著影響；12 bp InDel位點(diǎn)多態(tài)性又顯著影響著12周齡體重、胴體重、乳酸脫氫酶表達(dá)水平等性狀。3 bp InDel位點(diǎn)與12 bp InDel位點(diǎn)的不同組合基因型也與雞的腿部肌肉重量等生長性狀之間具有顯著相關(guān)。

饑餓激素(Ghrelin)是生長激素促分泌素受體的內(nèi)源性配體，它具有調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)食欲的作用，促進(jìn)雞的采食。雞的Ghrelin基因中存在一個8 bp InDel位點(diǎn)，其多態(tài)性與雞的28日齡體重、56日齡體重、腿肌重量、全凈重等生長指標(biāo)顯著相關(guān)，呈現(xiàn)此indel位點(diǎn)插入類型的雞在生長發(fā)育方面更加迅速，而呈插入/插入基因型的個體在各生長性狀上將表現(xiàn)出最高數(shù)值[24]。

KLF家族的特征性結(jié)構(gòu)是三個Krüppel樣鋅指結(jié)構(gòu)，其與DNA的CACCC元件和富含GC區(qū)連接，可以參與轉(zhuǎn)錄的激活或抑制。而Krüppel-like factor15(KLF15)是KLF家族中的一員，參與著細(xì)胞的增殖分化過程[25]。雞的KLF中含有一個2 bp的InDel突變位點(diǎn)，該位點(diǎn)的多態(tài)性顯著影響著雞的生長及胴體性狀，呈插入/插入基因型的雞在體重等生長指標(biāo)方面顯著優(yōu)于其他基因型的雞[26]。

作為肉雞最重要的生長性狀，雞的產(chǎn)肉量直接影響著肉雞養(yǎng)殖業(yè)創(chuàng)造的經(jīng)濟(jì)效益。Qiu等[27]對雞PIT1基因做出研究，它是重要的阻止特異性轉(zhuǎn)錄因子，參與生長激素、促甲狀腺素β亞單位、催乳素等基因表達(dá)量的調(diào)控。此基因中的一個57 bp InDel位點(diǎn)與雞的生長和屠體性狀呈極顯著相關(guān)，顯著影響著雞的體重、胸角寬、全凈膛等指標(biāo)。

中國地方雞種經(jīng)過長期的進(jìn)化與選擇，具有資源豐富、風(fēng)味較優(yōu)等優(yōu)點(diǎn)，但仍需要改良地方雞種生長較慢、飼料轉(zhuǎn)化率低的缺點(diǎn)。經(jīng)研究，SH3RF2基因中的InDel位點(diǎn)密切影響肉雞的生長性狀，但趙妤娟等[28]在對15個中國地方雞種的研究中尚未見到缺失位點(diǎn)，檢測結(jié)果全為非缺失純合子。這說明若要利用SH3RF2基因來改良中國地方雞品種，我們還需將缺失基因型引入中國地方雞以進(jìn)行雜交，才能獲得一定的育種改良進(jìn)展。

1.3.2 InDel標(biāo)記在雞抗病性狀選育中的應(yīng)用 雞的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)基因是位于16號微小染色體上一組緊密連鎖的基因簇，其表達(dá)產(chǎn)物與細(xì)胞的自我識別密切相關(guān)；而B-G基因位于MHC基因上的B基因座，是家禽特有的基因。它表達(dá)于紅細(xì)胞、血小板表面，積極參與著家禽的免疫反應(yīng)。吳允等[29]在雞的MHC基因中的B-G基因中發(fā)現(xiàn)了327個InDel位點(diǎn)。2017年，吳允等[30]再次對MHC基因中的Brd2基因做出研究，發(fā)現(xiàn)參與研究的25個雞種全部具有插入/缺失現(xiàn)象，這些InDel位于第一或第九內(nèi)含子區(qū)，據(jù)此推測該InDel位點(diǎn)的多態(tài)性與Brd2基因的表達(dá)存在一定關(guān)聯(lián)。

1.4 InDel標(biāo)記在豬育種工作中的應(yīng)用

1.4.1 InDel標(biāo)記在豬生長性狀選育中的應(yīng)用 豬的生長速度與抗逆性都是重要的經(jīng)濟(jì)性狀，與養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益密切相關(guān)。中國地方豬品種抗逆性好，但生長速度不及西方豬品種。劉安[31]對中國豬與西方豬品種進(jìn)行了全基因組水平的比較分析，在全基因組水平上發(fā)現(xiàn)了200萬個InDel位點(diǎn)，其中包括與豬的生長免疫表型等重要性狀相關(guān)的InDel位點(diǎn)。

最初發(fā)現(xiàn)于結(jié)腸腺瘤樣息肉(Adenomatous Polyposis Coli，APC)中的APC基因可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、影響細(xì)胞遷移，1986年被首次在人類身上發(fā)現(xiàn)，它是FAP的致病基因。研究顯示，APC基因控制著細(xì)胞數(shù)量，是一種抑癌基因，在許多組織中均有表達(dá)，但它是唯一一個在結(jié)腸上細(xì)胞增殖中起“看門”作用的基因，研究表明，APC基因的早期突變在結(jié)直腸腫瘤的早期發(fā)展中起著重要的作用[32]。因此，APC基因也是一類與腫瘤生長相關(guān)的基因。何文波[33]對中外豬群APC7的2個SNP位點(diǎn)和2個indel位點(diǎn)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)在中外豬種身上表現(xiàn)出較大的基因頻率差異。啟動子區(qū)域的indel位點(diǎn)構(gòu)成的不同基因型在仔豬的初生重存在著明顯的差異，在斷奶重存在著極顯著差異。這些結(jié)論為提升仔豬體重提供了科學(xué)依據(jù)。

1.4.2 InDel標(biāo)記在豬繁殖性狀選育中的應(yīng)用 八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子-4(Octamer-binding Transcription Factor-4 ，Oct4)基因與哺乳動物生殖細(xì)胞的形成和維持密切相關(guān)，缺失Oct4基因會引起原始生殖細(xì)胞凋亡，影響哺乳動物的繁殖性能。任發(fā)[34]發(fā)現(xiàn)大白豬的Oct4基因上的12 bp InDel位點(diǎn)與大白豬公豬的睪丸重、睪丸長周長、睪丸短周長均具有顯著相關(guān)，這證明Oct4基因上的12 bp indel位點(diǎn)對公豬的繁殖性狀具有顯著影響。這一研究成果為豬品種的選種選育、建立高繁殖力性狀主群提供了科學(xué)依據(jù)。

2 總結(jié)與展望

InDel標(biāo)記數(shù)量大、分型簡單的優(yōu)點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用于動物育種工作中，為改良動物經(jīng)濟(jì)性狀提供原材料與科學(xué)依據(jù)。在傳統(tǒng)的牛、羊、豬、雞養(yǎng)殖業(yè)中均已發(fā)揮重要作用。將InDel位點(diǎn)帶來的基因型頻率差異與家畜家禽的體尺等重要性狀數(shù)據(jù)資料相互關(guān)聯(lián)分析，可以尋找出不同基因型在性狀上造成的表型差異以提高分子標(biāo)記育種的效率。但迄今為止，InDel位點(diǎn)多處于內(nèi)含子區(qū)域，其對表型性狀的影響機(jī)制研究還不是十分透徹，這降低了利用InDel進(jìn)行動物育種的可信度，在實(shí)際生產(chǎn)中常常不被采用。在后續(xù)的研究中，探究InDel位點(diǎn)是如何影響動物性狀將成為研究的重點(diǎn)。