吳 爽，孫 曉，叢斌斌，畢 釗，周鵬鵬，石志強(qiáng)，王永勝

1.濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250200；2.山東省腫瘤防治研究院（山東省腫瘤醫(yī)院）乳腺病中心，山東 濟(jì)南 250117；3.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），山東 濟(jì)南 250062

前哨淋巴結(jié)活檢（sentinel lymph node biopsy，SLN B）已替代腋窩淋巴結(jié)清掃術(shù)（axillary lymph node dissection，ALND）成為早期乳腺癌腋窩淋巴結(jié)處理的常規(guī)術(shù)式，并能降低上肢淋巴水腫、感覺異常及運(yùn)動(dòng)障礙的發(fā)生率［1-4］。指南推薦聯(lián)合使用核素和藍(lán)染料進(jìn)行乳腺癌的SLNB［3，5］，但藍(lán)染料及核素示蹤劑均存在一定缺陷。熒光示蹤劑吲哚菁綠（indocyanine green，ICG），對(duì)比聯(lián)合法（99mTc-硫膠體和亞甲藍(lán)）具有經(jīng)濟(jì)、安全、可視等優(yōu)勢(shì)［6-7］，但I(xiàn)CG屬于小分子示蹤劑，存在示蹤時(shí)間不易控、非前哨淋巴結(jié)（non-sentinel lymph node，n-SLN）顯像率高的缺點(diǎn)。通過將ICG標(biāo)記在利妥昔單抗（rituximab，Rit）表面制備出ICG-Rit，能與前哨淋巴結(jié)（sentinel lymph node，SLN）內(nèi)B淋巴細(xì)胞表面的CD20分子特異性結(jié)合［8-9］，具有SLNB靶向性。本研究將應(yīng)用ICG-Rit對(duì)乳腺癌患者進(jìn)行SLN顯像，并采用對(duì)比聯(lián)合法檢驗(yàn)ICG-Rit作為乳腺癌SLNB示蹤劑的可行性。

1 資料和方法

1.1 一般材料

納入山東省腫瘤防治研究院（山東省腫瘤醫(yī)院）乳腺病中心96例原發(fā)性乳腺癌患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①病理學(xué)檢查結(jié)果為原發(fā)性乳腺癌；②臨床體格檢查和超聲檢查腋窩淋巴結(jié)陰性；③影像學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往接受過新輔助治療；②既往有乳腺癌病史（復(fù)發(fā)）；③既往有腋窩手術(shù)史；④炎性乳腺癌。

1.2 方法

1.2.1 ICG-Rit的制備

1 mL注射器取Rit溶液（10 mg/mL）和ICG溶液（2.5 mg/mL）各0.1 mL混合，用滅菌注射用水稀釋至0.8 mL，取0.3 mL作為注射劑量，質(zhì)量比為93.75 μg∶375 μg，濃度為0.156 25%。

1.2.2 儀器及試劑

試驗(yàn)應(yīng)用儀器與試劑見表1。

表1 儀器與試劑Tab.1 Instruments and reagents

1.2.3 腋窩SLNB

術(shù)前3～18 h于6點(diǎn)、12點(diǎn)位腺體內(nèi)注射99mTc-硫膠體（各0.6 mL 0.5 mCi），患乳外上象限乳暈旁單點(diǎn)皮內(nèi)注射ICG-Rit 0.3 mL（ICG 93.75 μg∶Rit 375.00 μg）。麻醉成功后，應(yīng)用熒光成像儀經(jīng)皮標(biāo)記發(fā)光淋巴管及淋巴結(jié)，應(yīng)用γ探測(cè)儀標(biāo)記淋巴結(jié)“熱點(diǎn)”。在原發(fā)腫瘤表面皮下或活檢后的殘腔壁周圍皮下注射1%亞甲藍(lán)4 mL，10～15 min進(jìn)行SLNB。乳房切除術(shù)：切開皮膚游離皮瓣，沿藍(lán)染淋巴管，解剖藍(lán)染淋巴結(jié)，按識(shí)別順序切除并記錄為染料法檢出SLN，γ探測(cè)儀檢測(cè)其放射性強(qiáng)度并記錄。應(yīng)用γ探測(cè)儀繼續(xù)檢測(cè)放射性淋巴結(jié)（放射性強(qiáng)度大于最高SLN放射性強(qiáng)度的10%）并記錄。對(duì)腋窩進(jìn)行觸診，將觸診腫大質(zhì)硬淋巴結(jié)切除，記為觸診SLN。應(yīng)用熒光成像儀檢測(cè)淋巴結(jié)，記錄ICG-Rit顯像淋巴結(jié)的灰度值。保留乳房者：沿腋窩皮膚皺襞單獨(dú)切口行SLNB。

1.2.4 病理學(xué)檢查

所有SLN接受病理組織學(xué)檢查。宏轉(zhuǎn)移、微轉(zhuǎn)移及孤立腫瘤細(xì)胞均定義為SLN陽性。

1.2.5 藥物安全性

乳房注射ICG-Rit后觀察注射點(diǎn)皮膚紅腫、丘疹、心悸及呼吸道過敏等過敏反應(yīng)癥狀。檢測(cè)術(shù)后第1天血液嗜酸性粒細(xì)胞值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)比ICG-Rit與聯(lián)合法SLNB檢出淋巴結(jié)的一致性，連續(xù)變量間均數(shù)差異使用t檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法分析率之間差異及kappa值評(píng)價(jià)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本研究96例患者中4例為雙側(cè)乳腺癌，行100例次SLNB，注射ICG-Rit后未見過敏反應(yīng)，術(shù)后檢測(cè)嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)未增高。患者一般資料［腫瘤大小分類、腫瘤位置、病理學(xué)類型、手術(shù)方式、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）］見表2。

表2 病例一般特征（N=100）Tab.2 Characteristics of patients and tumor(N=100)

同時(shí)應(yīng)用熒光法、核素法及染料法進(jìn)行SLNB，ICG-Rit顯像97例次、核素法顯像98例次、染料法顯像92例次、聯(lián)合法顯像100例次。ICG-Rit顯像失敗的3例次中2例次SLN轉(zhuǎn)移。SLN總檢出305枚，觸診檢出14枚，其他示蹤方法顯像SLN例次、個(gè)數(shù)及均數(shù)見表3。ICGRit顯像淋巴結(jié)244枚，灰度值最高254，集中在254～220，＜220者熒光不易識(shí)別，數(shù)值缺乏連續(xù)性。不同灰度值淋巴結(jié)見圖1。

在28例次SLNB中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，核素法檢出27例次，染料法檢出24例次，聯(lián)合法檢出28例次，ICG-Rit顯像25例次。據(jù)表4計(jì)算ICG-Rit顯像淋巴結(jié)的準(zhǔn)確率為97.0%（97/100），靈敏度為96.2%（25/26），特異度為100.0%，假陰性率為3.8%（1/26），陰性預(yù)測(cè)值為98.6%（71/72），陽性預(yù)測(cè)值為100.0%（25/25）。熒光法對(duì)比聯(lián)合法的一致性評(píng)價(jià)，kappa值為0.973（P＜0.001），表明有極好的一致性。

表3 各示蹤方法SLN數(shù)目（N=100）Tab.3 SLN number of each tracer method(N=100)

圖1 不同灰度值的ICG-Rit顯像淋巴結(jié)Fig.1 Different gray values of lymph nodes in ICG-Rit imaging

表4 ICG-Rit與聯(lián)合法的SLN檢出率Tab.4 Detection rate of SLN by ICG-Rit and combined method

3 討 論

ICG利用成像儀可觀察到皮下淋巴管引流途徑和SLN位置［6-7］，具有經(jīng)濟(jì)、可視和高檢出率（93.1%～100.0%）的優(yōu)點(diǎn)［10］。但I(xiàn)CG顯像時(shí)間短（5～15 min），n-SLN顯像多，淋巴結(jié)檢出數(shù)多于核素法或藍(lán)染料法［11］，可能會(huì)增加術(shù)后上肢并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)缺乏規(guī)范化操作流程，如最佳濃度、劑量及注射時(shí)間不明確。

Rit可結(jié)合于淋巴結(jié)中B淋巴細(xì)胞膜上的CD20分子，并可與ICG形成偶聯(lián)反應(yīng)［12］。將ICG與Rit以質(zhì)量比為1∶4偶聯(lián)，標(biāo)記率達(dá)到100.0%，可保持抗體分子的完整性和免疫活性，且無菌、無致熱原，也無急性毒性［8-9］。ICG-Rit具有相對(duì)分子質(zhì)量均一、與淋巴結(jié)結(jié)合緊密、n-SLN顯像可控的優(yōu)勢(shì)。本研究嘗試將具有靶向性的新型熒光示蹤劑應(yīng)用于SLNB，效果甚佳。

ICG具有良好的安全性［13］，并被美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)應(yīng)用。Rit不良反應(yīng)以中性粒細(xì)胞減少癥和皮疹為主（≥10%）。本研究中ICGRit劑量為ICG標(biāo)準(zhǔn)劑量的0.5%，Rit標(biāo)準(zhǔn)劑量的0.79‰。試驗(yàn)中ICG-Rit應(yīng)用96例次，未見過敏反應(yīng)，術(shù)后嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)未增高，驗(yàn)證了其安全性。

本研究中，ICG-Rit顯像SLN均數(shù)為2.44，中位數(shù)為2，低于核素法均數(shù)（2.80）和中位數(shù)（3）。12項(xiàng)研究納入1 736例患者對(duì)比ICG與核素法的SLNB診斷效能，ICG的SLN檢出均數(shù)在1.5～3.4，核素法檢出均數(shù)在1.35～2.30，ICG的檢出淋巴結(jié)數(shù)目多于核素法，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［14］。通過上述結(jié)果推斷ICG-Rit淋巴結(jié)顯像數(shù)目低于ICG顯像數(shù)目，減少了n-SLN顯像。

既往ICG研究資料表明，ICG失敗的因素包括患者肥胖（BMI≥30）及SLN宏轉(zhuǎn)移。近期一項(xiàng)對(duì)比核素示蹤劑的研究顯示，ICG顯像率為81.9%，假陰性率為34.7%，其中超重（BMI＞25）或SLN宏轉(zhuǎn)移（＞2 mm）的患者與ICG的低檢出率相關(guān)（P=0.02）［15］。本研究中ICG-Rit出現(xiàn)3例失敗，失敗病例為超重患者，且其中1例核素法檢出的3枚SLN中，計(jì)數(shù)最小的一枚SLN病理學(xué)檢查結(jié)果為宏轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，這與既往研究相似。但本研究入組病例中BMI對(duì)熒光法檢出SLN個(gè)數(shù)的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.292）。Mazouni等［15］的研究中，超重（BMI＞25）病例達(dá)46%；本研究入組患者中，超重病例為29例（29%），肥胖病例為7例（7%）。

本研究28例次SLNB存在SLN轉(zhuǎn)移，核素法、染料法、聯(lián)合法和ICG-Rit各檢出27、24、28和25例次。ICG-Rit顯像失敗的3例次中2例次SLN轉(zhuǎn)移，假陰性率為3.8%（1/26）、對(duì)比聯(lián)合法一致性評(píng)價(jià)，kappa值為0.973（P＜0.001），熒光法對(duì)比聯(lián)合法有極好的一致性。后續(xù)研究將開展ICG-Rit作為主示蹤劑進(jìn)行SLNB，提高其在超重及新輔助治療患者SLNB中的診斷效能。

具有高對(duì)比度及穿透深度特性的光聲成像技術(shù)可能擴(kuò)大熒光示蹤劑的穿透范圍［16］。結(jié)合ICG-Rit可直接探測(cè)腋窩顯像淋巴結(jié)并檢出即可完成SLNB。由于熒光示蹤劑顯像淋巴結(jié)較多，是否為SLN缺乏判定閾值，本研究試圖應(yīng)用顯像淋巴結(jié)的灰度值量化ICG-Rit標(biāo)記強(qiáng)度，但檢出淋巴結(jié)灰度值不具有連續(xù)性，集中在254～220，無法制定灰度閾值區(qū)分SLN和n-SLN。

本研究中，ICG-Rit相對(duì)于ICG能減少對(duì)n-SLN顯像；對(duì)比聯(lián)合法，具有較高的準(zhǔn)確率、特異度、符合率及較低的假陰性率。ICG-Rit作為SLNB示蹤劑，使用安全，具有良好的臨床應(yīng)用前景。