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        ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其在合成生物學(xué)中的應(yīng)用

        2020-04-15 13:32:54曲俊澤陳天華姚明東王穎肖文海李炳志
        生物工程學(xué)報(bào) 2020年9期
        關(guān)鍵詞:跨膜核苷酸細(xì)胞膜

        曲俊澤,陳天華,姚明東,王穎,肖文海,李炳志

        1 天津大學(xué) 系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 教育部合成生物學(xué)前沿科學(xué)中心,天津 300072

        2 天津大學(xué) 前沿技術(shù)研究院,天津 301700

        ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為最大最古老的膜蛋白家族之一廣泛存在于各種生物體中。由于它能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量進(jìn)而將與其結(jié)合的諸如烷烴、氨基酸、抗生素等各種物質(zhì)進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),所以無(wú)論在原核生物還是高等動(dòng)植物中,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均發(fā)揮著重要的生理作用。早在20世紀(jì)70年代,在細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的研究中首次發(fā)現(xiàn)了這類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[1]。隨后,由于其可將外源物質(zhì)以逆濃度梯度的方式排出細(xì)胞外所產(chǎn)生的多藥耐藥性 (Multidrug resistance,MDR) 而被醫(yī)學(xué)工作者在臨床治療領(lǐng)域進(jìn)行了更進(jìn)一步的研究[2]。目前,研究發(fā)現(xiàn)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已經(jīng)超過(guò)了100種,并被證實(shí)在各個(gè)領(lǐng)域 (如生物燃料、生物醫(yī)藥等)中均發(fā)揮著重要作用[3]。

        1 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

        1.1 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究進(jìn)程

        20世紀(jì)70年代,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白首次出現(xiàn)于細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分吸收的研究中,研究發(fā)現(xiàn)該蛋白依賴于ATP水解直接激發(fā)底物與結(jié)合蛋白(Substrate-binding protein,SBP) 結(jié)合,進(jìn)而達(dá)到轉(zhuǎn)運(yùn)的目的[1]。20世紀(jì)80年代早期,研究人員克隆了幾個(gè)編碼這種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因,其中包括編碼鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typhimurium組氨酸滲透酶和大腸桿菌Escherichia coli麥芽糖滲透酶的基因。他們?cè)谶@些蛋白的氨基酸序列間發(fā)現(xiàn)了較強(qiáng)的同源性,并觀察到這些蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)有時(shí)也會(huì)依賴于結(jié)合蛋白與轉(zhuǎn)運(yùn)底物的結(jié)合[4-5]。與此同時(shí),醫(yī)學(xué)研究者也注意到了P-糖蛋白(Permeabilityglycoprotein,P-gp) 在臨床治療上的影響,正是源于它的存在使細(xì)胞具有藥物抗 性[6]。1985年,研究人員成功克隆了不同來(lái)源編碼這類蛋白的基因,并通過(guò)表征發(fā)現(xiàn)了其顯著的保守性特征[7]。研究人員利用cDNA揭示了哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間的保守性體現(xiàn)在高度保守的核苷酸結(jié)合區(qū)域 (Nucleotide-binding domains,NBDs)[8],這也揭示了這些ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能具有共同的進(jìn)化起源 (進(jìn)化關(guān)系如圖1所示)。1986年,人們鑒別了這些ATP結(jié)合的亞基,并依據(jù)這些亞基定義了這一轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超級(jí)家族[9-12]。然而,直到1990年這些蛋白才被正式命名為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[13]。其可利用ATP水解產(chǎn)生的能量將與其結(jié)合的物質(zhì)逆濃度地排出胞外的功能賦予了細(xì)胞多藥耐藥性,因此在腫瘤治療相關(guān)領(lǐng)域中受到了研究者的廣泛關(guān)注[2]。近些年來(lái),隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展,關(guān)于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究也逐漸深入,科學(xué)家們利用其獨(dú)特的轉(zhuǎn)運(yùn)功能將它廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、生物燃料、微生物工業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域中[14]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究進(jìn)程時(shí)間線見表1。

        表1 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究進(jìn)程Table 1 The research process of ABC transporters

        圖1 不同來(lái)源不同亞族的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Phylogeny of ABC transporters of different subfamilies from different species.Different species:Gc:Grosmannia clavigera;Yl:Yarrowia lipolytica;Pp:Pan paniscus;Pa:Pongo abelii;Nl: Nomascus leucogenys;Gg:Gorilla gorilla;Mm:Macaca mulatta (ABCA7),Mus musculus (ABCB12);Pt:Pan troglodytes;Cj: Callithrix jacchus;Mf:Macaca fascicularis;Xl:Xenopus laevis;Oc:Oryctolagus cuniculus;Lv: Lipotes vexillifer;Po:Paralichthys olivaceus;Tr:Takifugu rubripes;Hs:Homo sapiens;Sm: Selaginella moellendorffii;Sp:Strongylocentrotus purpuratus;Fa:Ficedula albicollis;Ph:Pseudopodoces humilis;At: Arabidopsis thaliana;Rb:Rhinopithecus bieti;Rr:Rhinopithecus roxellana;Sb:Saimiri boliviensis;Mu:Meriones unguiculatus;Oo:Orcinus orca;Ps:Pelodiscus sinensis;Bt:Bos Taurus;Cf:Canis familiaris;Tg:Taeniopygia guttata;Cg:Cricetulus griseus;Tg: Toxoplasma gondii.

        1.2 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)與分類原則

        近些年來(lái),研究人員通過(guò)基因組測(cè)序確定了一些編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。并且,隨著生物大分子結(jié)構(gòu)解析技術(shù)的不斷進(jìn)步,幾種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)也已被成功解析,例如:金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus的Sav1866多藥向外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、閃爍古生球菌Archaeoglobus fulgidus的ModBC-A MoO4/WO4向內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及大腸桿菌的BtuCD維他命B12向內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等[30]。基于這些已被解析清楚的晶體結(jié)構(gòu),研究者確定了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu),其核心是兩個(gè)核苷酸結(jié)合域和兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域 (Transmembrane domains,TMDs)。此外,一些ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通常還帶有其他的輔助結(jié)構(gòu)域 (圖2)。這些結(jié)構(gòu)域在原核生物中表現(xiàn)為單個(gè)亞基并通過(guò)將這些亞基組裝到一起的方式發(fā)揮作用;而在真核生物中,它們則被表達(dá)為全轉(zhuǎn)運(yùn)子“full-transporters”(含有兩個(gè)核苷酸結(jié)合域和兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域) 或半轉(zhuǎn)運(yùn)子“half-transporters”(只含一個(gè)核苷酸結(jié)合域和一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域)[31]。

        圖2 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白經(jīng)典結(jié)構(gòu)模型Fig.2 Structure model of ABC transporter.*:not all ABC transporters have SBP.

        研究發(fā)現(xiàn),ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程依賴于保守的耦聯(lián)機(jī)制[32]。核苷酸結(jié)合域作為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域,能夠促使跨膜結(jié)構(gòu)域發(fā)揮作用。它又包含了兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域,其中一個(gè)是結(jié)構(gòu)類似于RecA的亞結(jié)構(gòu)域,另一個(gè)則被稱為“螺旋亞結(jié)構(gòu)域”。而在核苷酸結(jié)合域中存在的一些保守序列基序具有特定的功能,其中最重要的就是位于類RecA亞結(jié)構(gòu)域的P環(huán) (Walker-A motifs) 和位于螺旋亞結(jié)構(gòu)域的LSGGQ基序 (氨基酸序列)。在整個(gè)運(yùn)輸過(guò)程中,兩個(gè)核苷酸結(jié)合域組裝在一起,使這些保守基序以首尾相接的方式暴露。首尾相接的排列方式會(huì)在一個(gè)核苷酸結(jié)合域的P環(huán)和另一個(gè)核苷酸結(jié)合域間產(chǎn)生兩個(gè)ATP結(jié)合和水解位點(diǎn)。在沒有ATP結(jié)合的情況下,核苷酸結(jié)合域間的接口存在間隙,水能夠進(jìn)入ATP結(jié)合位點(diǎn)。ATP結(jié)合后,接口關(guān)閉,使ATP被夾在核苷酸結(jié)合域之間。研究人員通過(guò)研究幾種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中共有的ATP水解反應(yīng)發(fā)現(xiàn),一次轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程會(huì)消耗兩分子的ATP[33]。

        有關(guān)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分類原則,目前最常見的是根據(jù)真核ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域的同源性和蛋白系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,將其大致分為7個(gè)亞族(A–G)[2],但也有人認(rèn)為可以分為8個(gè)亞族 (A–H,H族為暫無(wú)歸類的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)[14]。亦有報(bào)道將這些亞族分別命名為多藥耐藥性蛋白、多向耐藥性蛋白 (Pleiotropic drug resistance,PDR)、多藥耐藥性相關(guān)蛋白 (Multidrug resistance-associated protein,MRP)、腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良蛋白(Adrenoleukodystrophy protein,ALDp)、延伸因子3(Elongation factor-3,EF-3) 以及RNase L抑制因子 (RNase L inhibitor,RLI) 等[34-35]。其他分類方法包括:根據(jù)功能區(qū)域和亞基排列方式的不同,將ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為由一個(gè)或兩個(gè)“核苷酸結(jié)合域-跨膜結(jié)構(gòu)域”形式存在的獨(dú)立肽鏈和4個(gè)功能區(qū)域混合在一起形成的完整肽鏈兩大類;以及根據(jù)核苷酸結(jié)合域和跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)量的不同,將ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為全轉(zhuǎn)運(yùn)子和半轉(zhuǎn)運(yùn)子[36]。值得注意的是,半轉(zhuǎn)運(yùn)子只有與另一個(gè)半轉(zhuǎn)運(yùn)子形成同源或異源的二聚體時(shí)才能發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)作用[21]。

        1.3 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制與生理功能

        ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與生物體中多種重要的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程,其轉(zhuǎn)運(yùn)功能需要核苷酸結(jié)合域和跨膜結(jié)構(gòu)域的共同參與。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的轉(zhuǎn)運(yùn)功能分為向外和向內(nèi)兩種轉(zhuǎn)運(yùn)方式。研究人員[37]詳細(xì)闡述了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中依靠構(gòu)象改變的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。如圖3A所示,在向內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中,首先,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白處于向內(nèi)構(gòu)象(Inwardlyfacing conformation) 的“休息狀態(tài)”,此時(shí)兩個(gè)核苷酸結(jié)合域在跨膜結(jié)構(gòu)域的帶動(dòng)下保持開放狀態(tài)。當(dāng)?shù)孜镞M(jìn)入轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白時(shí),ATP與核苷酸結(jié)合域結(jié)合,跨膜結(jié)構(gòu)域構(gòu)象改變以從結(jié)合蛋白中接收底物,此時(shí)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白變?yōu)橄蛲鈽?gòu)象 (Outwardfacing conformation)。隨后,ATP水解成ADP和磷酸基團(tuán) (Pi),核苷酸結(jié)合域二聚體打開,底物被釋放到細(xì)胞質(zhì)中,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白再次回到“休息狀態(tài)”。

        而向外轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程,如圖3B所示,轉(zhuǎn)運(yùn)首先從底物與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)合開始,此時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白依然是向內(nèi)構(gòu)象的,但核苷酸結(jié)合域是打開的。隨后ATP與核苷酸結(jié)合域結(jié)合并使其關(guān)閉,轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白變?yōu)橄蛲鈽?gòu)象使底物暴露并被釋放到細(xì)胞外。最后,ATP水解,核苷酸結(jié)合域再次打開,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白恢復(fù)到初始構(gòu)象。由此便完成了利用ATP水解產(chǎn)生的能量使底物從膜的一側(cè)向另一側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。另外有報(bào)道[38]從結(jié)構(gòu)層面更為細(xì)致地解析了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。僅以向外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為例,在向外轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程中,底物分子由核苷酸結(jié)合域傳遞到跨膜結(jié)構(gòu)域??缒そY(jié)構(gòu)域中存在一些結(jié)構(gòu)保守的α螺旋,這些α螺旋會(huì)像通道一樣耦合在一起,進(jìn)而與核苷酸結(jié)合域中兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域的邊界形成凹槽并相互作用。當(dāng)ATP結(jié)合時(shí),核苷酸結(jié)合域接口關(guān)閉,使耦合螺旋更加緊密,從而導(dǎo)致跨膜結(jié)構(gòu)域從內(nèi)向外翻轉(zhuǎn)。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白利用這一機(jī)制,將跨膜結(jié)構(gòu)域中的結(jié)合和外排位點(diǎn)暴露在膜的另一側(cè),從而使底物單向移動(dòng)通過(guò)磷脂雙分子層。

        圖3 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制示意圖Fig.3 Transport mechanism of ABC transporter.(A) Import mechanism.(B) Export mechanism.

        ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠?qū)崿F(xiàn)多種物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸,因此無(wú)論在原核生物還是真核生物中都發(fā)揮著重要的生理功能。一些向內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以促進(jìn)氨基酸、糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從胞外環(huán)境中轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胞內(nèi)基質(zhì),從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。最初科研工作者是在研究細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收中發(fā)現(xiàn)了向內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[1],并且在此后很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi),人們普遍認(rèn)為向內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白只存在于原核生物中。直到2003年,植物中ABC向內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的發(fā)現(xiàn)才改變了這一觀點(diǎn)[14]。因此,向內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不僅存在于原核生物中也存在于真核生物中。而向外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同向內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白一樣,共同存在于原核生物和真核生物中,它們具有“排毒”的功能,可將抗生素、脂肪酸等不利于細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)排出胞外,有助于在細(xì)胞內(nèi)將非必需的外源物質(zhì)或次級(jí)代謝產(chǎn)物保持在較低的濃度范圍,進(jìn)而減輕了細(xì)胞的生長(zhǎng)壓力,維持了細(xì)胞的正常生長(zhǎng),極大地提升了細(xì)胞的存活率。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白其他的生理功能還包括:參與真核生物中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)的分泌以及抗原遞呈等[3]?;谶@些生理功能,科學(xué)家們受到了啟發(fā),使得ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在各個(gè)領(lǐng)域中均得到了廣泛的應(yīng)用。

        2 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在合成生物學(xué)中的應(yīng)用

        諸如pH值、溫度、滲透壓、有毒代謝產(chǎn)物等壓力條件會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響并限制代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此,在外界壓力條件下維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)和提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量是微生物工業(yè)生產(chǎn)中最重要的目標(biāo)。而細(xì)胞膜作為將細(xì)胞質(zhì)與外界環(huán)境分隔開的細(xì)胞保護(hù)屏障[39-40],其在壓力條件下的穩(wěn)定性和膜脂質(zhì)與膜蛋白的相互作用極大地影響了工業(yè)菌株的性能[41-43]。雖然由于工業(yè)菌株代謝的復(fù)雜性,改變膜功能以提高其底物耐受性并不會(huì)必然導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的增加[44],但也有一些代謝產(chǎn)物與膜功能之間存在良好的耦合關(guān)系[45-46],增強(qiáng)生產(chǎn)這些物質(zhì)的工業(yè)菌株的魯棒性將會(huì)提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。因此,調(diào)節(jié)微生物膜功能以維持膜內(nèi)穩(wěn)態(tài)可能是一種提高微生物在工業(yè)生產(chǎn)中生產(chǎn)效率的有效方法。研究表明[47],可以通過(guò)增強(qiáng)膜的完整性、調(diào)節(jié)膜的流動(dòng)性和調(diào)節(jié)膜的通透性來(lái)維持膜的穩(wěn)態(tài)。依靠合成生物學(xué)的概念和技術(shù),并結(jié)合基因工程和代謝工程,研究者們開發(fā)出了越來(lái)越多的策略以達(dá)到這一目的。其中,調(diào)節(jié)膜的通透性是指通過(guò)調(diào)節(jié)離子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和有毒物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜對(duì)它們的選擇透過(guò)性。目前主要有3種調(diào)節(jié)膜通透性的策略:(1) 調(diào)節(jié)脂質(zhì)介導(dǎo)的膜通透性[48];(2)調(diào)控膜蛋白功能[49-51];(3) 調(diào)控細(xì)胞膜內(nèi)能量系統(tǒng)[52-53]。而ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,作為一種利用細(xì)胞質(zhì)中ATP水解產(chǎn)生的能量進(jìn)而調(diào)控物質(zhì)出膜/入膜的膜通道蛋白,能夠在膜蛋白功能和細(xì)胞膜內(nèi)能量系統(tǒng)兩方面產(chǎn)生影響,因此可以對(duì)其進(jìn)行修飾以調(diào)節(jié)膜的通透性。研究表明[47],這一策略具有可以同時(shí)改善菌株生長(zhǎng)、提高底物利用率和菌株生產(chǎn)力的潛力。

        2.1 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白用于改善工業(yè)菌株性能

        細(xì)胞膜的通透性主要體現(xiàn)在離子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和有毒物質(zhì)通過(guò)膜孔或膜蛋白進(jìn)入或離開細(xì)胞。據(jù)有關(guān)膜蛋白和膜通透性的研究指出,可以通過(guò)調(diào)控膜蛋白功能來(lái)調(diào)節(jié)膜的通透性[49-51]。而膜蛋白ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以像“泵”一樣,將物質(zhì)“泵入”或“泵出”細(xì)胞,是實(shí)現(xiàn)這一策略較優(yōu)的研究對(duì)象。工程化的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可在微生物工業(yè)生產(chǎn)中用于改善工業(yè)菌株的性能,增強(qiáng)菌株耐受性并提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。

        利用微生物合成游離的脂肪酸使得將可再生糖轉(zhuǎn)化為油脂化學(xué)品具有良好的應(yīng)用前景。然而,大腸桿菌作為這一途徑的主要宿主,游離脂肪酸的產(chǎn)生會(huì)對(duì)其細(xì)胞膜的完整性和細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響。在類似于抗生素等生長(zhǎng)選擇性壓力條件下,合成游離脂肪酸的大腸桿菌會(huì)在傳代過(guò)程中被淘汰,以此來(lái)抵抗游離脂肪酸造成的這種負(fù)面影響,這也導(dǎo)致了工業(yè)生產(chǎn)中的遺傳不穩(wěn)定性[44]。而大腸桿菌內(nèi)源的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AcrB與周質(zhì)融合蛋白AcrA和膜通道蛋白TolC協(xié)同工作,形成一個(gè)跨膜復(fù)合物AcrAB-TolC (圖4),復(fù)合物貫穿細(xì)胞膜并跨越周質(zhì)形成橋,有助于游離脂肪酸的外排[54]。

        圖4 AcrAB-TolC跨膜復(fù)合物Fig.4 Intermembrane AcrAB-TolC complex.(A) The resting state.(B) The transport-state.(A+B) Schematic of transport mechanism.(C) Structure of AcrAB-TolC[54].OM:outer membrane;IM:inner membrane.

        Dunlop等[25]在大腸桿菌中分別表達(dá)了43個(gè)異源ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,并采用一種基于競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制的篩選策略,在分別外加7種物質(zhì)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。除了兩種化合物 (正丁醇和異戊醇) 沒有篩選到可以提高耐受的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白外,其余5種均篩選到了對(duì)應(yīng)的最優(yōu)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。隨后,他們又在檸檬烯生產(chǎn)菌株中表達(dá)了其中一種篩選出來(lái)的泊庫(kù)島食烷菌Alcanivorax borkumensis來(lái)源的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (這一轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在當(dāng)時(shí)還沒有被表征,后來(lái)被證實(shí)為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AcrB),最終使檸檬烯的耐受性提高了8%,產(chǎn)量提高了近60%。這一結(jié)果表明,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以在增強(qiáng)生產(chǎn)菌株耐受性的同時(shí)提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。Chen等[55]也通過(guò)在釀酒酵母中表達(dá)異源的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica來(lái)源) 發(fā)現(xiàn),通過(guò)把細(xì)胞內(nèi)癸烷和十一烷的濃度維持在較低水平的方式,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白顯著提高了釀酒酵母對(duì)于癸烷和十一烷的耐受性。

        除了可以通過(guò)引入異源ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)改善工業(yè)菌株的性能,過(guò)表達(dá)內(nèi)源的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也可以達(dá)到這一目的。有研究發(fā)現(xiàn),在釀酒酵母中,pdr18基因編碼的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)膜的通透性,影響胞內(nèi)的乙醇濃度。研究人員利用強(qiáng)啟動(dòng)子上調(diào)了pdr18的表達(dá),使乙醇產(chǎn)量提高了6%,產(chǎn)率提高了17%[56]。因此,通過(guò)在乙醇發(fā)酵中增強(qiáng)釀酒酵母的乙醇耐受性和抑制質(zhì)膜的滲透能力,pdr18基因的過(guò)表達(dá)能夠有效改善工業(yè)菌株的發(fā)酵性能。Nishida等構(gòu)建了一株pdr1突變的釀酒酵母KK-211,該釀酒酵母中內(nèi)源的4個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (Snq2、Yor1、Pdr10、Pdr15)的表達(dá)水平被上調(diào)。對(duì)這4個(gè)蛋白的功能進(jìn)行研究,表明Pdr10和Snq2負(fù)責(zé)調(diào)控疏水性有機(jī)溶劑正癸烷和正十一烷的耐受性,而Snq2和Yor1則負(fù)責(zé)調(diào)控釀酒酵母對(duì)親水性有機(jī)溶劑的耐受性[57]。后續(xù)的應(yīng)用研究結(jié)果顯示,相比于野生型釀酒酵母,過(guò)表達(dá)內(nèi)源ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Snq2明顯提高了菌株對(duì)于外源癸烷的耐受性并促進(jìn)了菌株生長(zhǎng)[58];過(guò)表達(dá)內(nèi)源ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Yor1有助于釀酒酵母抵御多種抗生素[24]。

        2.2 基于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的負(fù)反饋調(diào)控系統(tǒng)

        任何膜蛋白的過(guò)表達(dá)通常都會(huì)抑制細(xì)胞的正常生長(zhǎng),ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也不例外。因此,為了平衡過(guò)表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白促進(jìn)細(xì)胞毒素外排的同時(shí)又增加了細(xì)胞負(fù)荷所產(chǎn)生的正負(fù)影響,Boyarskiy等[29]在大腸桿菌中開發(fā)了一種自動(dòng)反饋調(diào)控系統(tǒng),調(diào)控機(jī)理見圖5。該系統(tǒng)利用了大腸桿菌本源的應(yīng)激啟動(dòng)子PgntK來(lái)負(fù)反饋調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平。將這一負(fù)反饋調(diào)控系統(tǒng)導(dǎo)入大腸桿菌DH10B中,該系統(tǒng)可自主調(diào)控正丁醇ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變體AcrBv2的表達(dá)水平,從而減輕了由于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過(guò)表達(dá)所造成的細(xì)胞負(fù)擔(dān),同時(shí)也促進(jìn)了正丁醇的外排。最終,利用這一負(fù)反饋調(diào)控系統(tǒng),Boyarskiy等將大腸桿菌的正丁醇耐受性提高了40%,產(chǎn)量提高了35%。因此,自動(dòng)反饋調(diào)控系統(tǒng)在發(fā)揮ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白解毒作用的同時(shí)又避免了由于其過(guò)表達(dá)所導(dǎo)致的細(xì)胞毒性,為改善菌株的生長(zhǎng)和生產(chǎn)提供了一種兩全其美的手段。

        圖5 負(fù)反饋調(diào)控系統(tǒng)機(jī)理Fig.5 Mechanism of negative-feedback system.

        2.3 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在調(diào)節(jié)胞內(nèi)能量系統(tǒng)方面的應(yīng)用

        ATP作為細(xì)胞中最重要的能量來(lái)源,可通過(guò)改變其在細(xì)胞中的含量來(lái)調(diào)節(jié)微生物細(xì)胞內(nèi)的能量系統(tǒng)。有報(bào)道稱[59],ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能利用ATP水解產(chǎn)生的能量將脂質(zhì)從質(zhì)體轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,這有助于維持細(xì)胞膜脂質(zhì)含量的穩(wěn)定。并且通過(guò)參與細(xì)胞內(nèi)膜和外膜的脂質(zhì)翻轉(zhuǎn),ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以調(diào)節(jié)膜脂質(zhì)的不對(duì)稱性,進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的通透性[60]。此外,物質(zhì)可以借助ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將其轉(zhuǎn)運(yùn)活性與ATP水解耦聯(lián),從而完成逆濃度梯度的轉(zhuǎn)運(yùn) (應(yīng)用實(shí)例見圖6)。因此,通過(guò)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)控ATP在胞內(nèi)的含量也被認(rèn)為是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞膜對(duì)底物透過(guò)性的有效策略。

        圖6 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié)胞內(nèi)能量系統(tǒng)的應(yīng)用 (以革蘭氏陰性菌細(xì)胞表面脂多糖的轉(zhuǎn)運(yùn)為例)Fig.6 Application of ABC transporter in tuning intracellular energy system (The transport of lipopolysaccharides on the cell surface of Gram-negative bacteria as an example).(A) Schematic of transport mechanism.(B) Structural overlay of LptB shows conformational changes upon ATP hydrolysis[26].(C) Structural observation of LptB implicates a key binding site[26].OM:outer membrane;IM:inner membrane;LPS:lipopolysaccharides;A:LptA;B:LptB;C:LptC;D:LptD;E:LptE;F:LptF;G:LptG.

        革蘭氏陰性菌細(xì)胞表面含有脂多糖。脂多糖是一種含有多個(gè)脂肪?;湹拇笮吞侵愇镔|(zhì),構(gòu)成細(xì)胞膜外側(cè)的疏水區(qū),正是由于它的存在使細(xì)胞膜可以作為屏障,阻止大部分抗生素進(jìn)入細(xì)胞中。Sherman等[26]通過(guò)使在脂多糖裝配過(guò)程中負(fù)責(zé)將其轉(zhuǎn)運(yùn)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白失活,并利用生化實(shí)驗(yàn)結(jié)合ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在ATP水解前后的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,最終發(fā)現(xiàn)了在大腸桿菌中相關(guān)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的失活會(huì)減緩ATP水解,從而降低了脂多糖從膜內(nèi)向膜外的運(yùn)輸效率,使細(xì)胞膜對(duì)抗生素的抵抗作用減弱。與此類似,May等[52]使用一種對(duì)于新生霉素 (Novobiocin) 敏感的細(xì)胞膜缺陷型大腸桿菌篩選到一株對(duì)新生霉素抗性增強(qiáng)的突變體。對(duì)這一突變體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),抗性增強(qiáng)是由于細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)脂多糖轉(zhuǎn)運(yùn)的ATP酶,即ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)生了改變。共晶體結(jié)構(gòu)、生化和遺傳數(shù)據(jù)表明,新生霉素會(huì)與這種ATP酶直接結(jié)合,但它并不結(jié)合在核苷酸結(jié)合域上,而是結(jié)合在核苷酸結(jié)合域與跨膜結(jié)構(gòu)域之間的接口。這種相互作用增強(qiáng)了負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)脂多糖的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性,進(jìn)而改變了細(xì)胞膜的通透性。這一發(fā)現(xiàn)有助于人們理解ATP水解與脂多糖轉(zhuǎn)運(yùn)之間的關(guān)系。此外,Causey等[61]發(fā)現(xiàn),在大腸桿菌中同時(shí)缺失包括ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在內(nèi)的一些與ATP產(chǎn)生相關(guān)的膜蛋白和其他與丙酮酸氧化有關(guān)的蛋白,導(dǎo)致了細(xì)胞膜對(duì)于葡萄糖的透過(guò)性增加,從而促進(jìn)了葡萄糖的積累,同時(shí)降低了胞內(nèi)ATP的含量,減弱了丙酮酸到乙酸的代謝,最終使丙酮酸的產(chǎn)量增加了2.1倍。這些實(shí)例證實(shí)了,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)能量系統(tǒng)來(lái)改善菌株性能的前景。

        2.4 其他

        除上述應(yīng)用外,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白還因其可將腫瘤治療藥物從腫瘤細(xì)胞中排出胞外,而被作為多藥耐藥性抑制靶點(diǎn)被應(yīng)用在腫瘤臨床治療中[2];在新能源開發(fā)方面,工程化的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可增強(qiáng)微生物對(duì)于生物燃料的耐受性,對(duì)于提高生物燃料的產(chǎn)量具有良好的應(yīng)用前景[62];ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白還可以提高植物和真菌的重金屬耐性,因此在環(huán)境保護(hù)和改善環(huán)境方面也得到了相應(yīng)的應(yīng)用[36,63]。此外,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白還被應(yīng)用于植物栽培、藥理研究以及農(nóng)藥研發(fā)等的工作中[3,64],在此不再一一贅述。

        3 總結(jié)與展望

        近些年來(lái),隨著ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相關(guān)研究逐漸增多,其結(jié)構(gòu)信息和作用機(jī)制也越來(lái)越清晰,這大大加深了研究者們對(duì)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)效關(guān)系的認(rèn)知,豐富了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在各個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用潛力。如今,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不再只是作為降低惡性腫瘤耐藥性的靶點(diǎn)而被應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)和毒理學(xué)領(lǐng)域的研究中。在微生物工業(yè)生產(chǎn)中,如何利用工程化的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,來(lái)提高工業(yè)菌株的特定性能,進(jìn)而提升目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量等的研究也受到研究者們?cè)絹?lái)越廣泛的關(guān)注。但相比于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的龐大家族,目前的研究還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。有關(guān)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物的研究有待補(bǔ)充,比如一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是否具有底物特異性,是否可以同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)多種不同的底物。此外,有關(guān)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的人工設(shè)計(jì)改造也相對(duì)較少。如何通過(guò)一些技術(shù)手段改造ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以提高它的轉(zhuǎn)運(yùn)效率,如何增強(qiáng)它的底物轉(zhuǎn)運(yùn)特異性從而實(shí)現(xiàn)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的“定制化”還有待相關(guān)科研工作者們的進(jìn)一步努力。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展和合成生物學(xué)的興起,將會(huì)有越來(lái)越多新的策略和新的技術(shù)用來(lái)研究ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和擴(kuò)展其應(yīng)用。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也將在合成生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

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