段培楓，尤甲甲，徐美娟，楊套偉，邵明龍，張顯，饒志明

江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122

2-O-α-D-甘油葡糖苷 (2-O-α-D-glu-copyranosylsn-glycerol) 是一種由一個(gè)葡糖基和一個(gè)甘油基通過糖苷鍵連接的糖苷類物質(zhì)[1]，在自然界廣泛存在，特別是在耐鹽的藍(lán)細(xì)菌[2]和南非密羅木中，它是密羅木能在極端環(huán)境中生存和重新激活復(fù)生的最主要的活性物質(zhì)[3]；另外，在日本清酒中也發(fā)現(xiàn)含有活性成分2-O-α-D-甘油葡糖苷[4]。2-O-α-D-甘油葡糖苷對(duì)生物體具有保護(hù)作用，當(dāng)細(xì)胞處在高滲透壓、強(qiáng)紫外線或干旱等惡劣條件下時(shí)，它能在細(xì)胞表面形成保護(hù)膜，從而有效防止蛋白質(zhì)分子變性、失活[5]，因此，2-O-α-D-甘油葡糖苷可作為蛋白質(zhì)和酶的穩(wěn)定劑[6-7]。此外，由于其高保濕性、低吸水性的特點(diǎn)，2-O-α-D-甘油葡糖苷常被用作化妝品原料，以提高皮膚的保濕效果[8-9]；2-O-α-D-甘油葡糖苷還可以作為一種無(wú)致齲性的甜味劑添加到食品中[10]。因此，2-O-α-D-甘油葡糖苷在化妝品、食品、醫(yī)藥[11-12]、保健品[13]等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，具有廣闊的應(yīng)用和市場(chǎng)前景；但截至目前，德國(guó)的Bitop AG公司是唯一一家在工業(yè)規(guī)模上實(shí)現(xiàn)了2-O-α-D-甘油葡糖苷生產(chǎn)的公司[14]，而國(guó)內(nèi)關(guān)于2-O-α-D-甘油葡糖苷的產(chǎn)業(yè)化仍處于起步、探索階段。

2-O-α-D-甘油葡糖苷具有多種合成方式，主要包括化學(xué)法合成、微生物合成和酶轉(zhuǎn)化合成[15]?；瘜W(xué)法合成的產(chǎn)物中由于存在多種同分異構(gòu)體[4]，需多步純化，2-O-α-D-甘油葡糖苷產(chǎn)率較低，工藝復(fù)雜[10]，一般不在工業(yè)上采用。微生物合成法[2]是指利用經(jīng)基因改造后的藍(lán)細(xì)菌等微生物在鹽脅迫條件下進(jìn)行光合作用合成2-O-α-D-甘油葡糖苷[16]，Martin等曾經(jīng)報(bào)道了利用嗜根寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas rhizophilastrainDSM14405合成2-O-α-D-甘油葡糖苷，但產(chǎn)量?jī)H約為29 mg/L[17]。近些年一些學(xué)者通過分子改造和脅迫培養(yǎng)條件的優(yōu)化[18]，提高了生物體內(nèi)合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的產(chǎn)量，但據(jù)報(bào)道最高產(chǎn)量也僅約為0.3 g/L[19]，仍不具工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。酶轉(zhuǎn)化法包括α-葡糖苷酶轉(zhuǎn)化法和蔗糖磷酸化酶轉(zhuǎn)化法[15]。α-葡糖苷酶轉(zhuǎn)化法是以麥芽糖和甘油為底物，通過α-葡糖苷酶的轉(zhuǎn)糖基化，進(jìn)行體外酶促合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的方法，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是包括2-O-α-D-甘油葡糖苷在內(nèi)的3種不同立體異構(gòu)體的混合物[10]，分離純化較為困難，生產(chǎn)成本高，不利于大規(guī)模生產(chǎn)；蔗糖磷酸化酶轉(zhuǎn)化法是奧地利學(xué)者Goedl等將蔗糖磷酸化酶基因在大腸桿菌中克隆表達(dá)，以蔗糖和甘油為底物，建立的一種酶促合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的方法[20]，這種方法具有底物原料低廉、產(chǎn)物簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，但也存在轉(zhuǎn)化時(shí)間長(zhǎng)、體外條件下酶的穩(wěn)定性差、容易失活等問題，同時(shí)大腸桿菌作為宿主菌的安全性問題[21-22]，這都限制了2-O-α-D-甘油葡糖苷在食品、藥品領(lǐng)域的工業(yè)化應(yīng)用。

本研究首先將來(lái)源于腸膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides的蔗糖磷酸化酶基因(gtfA) 在大腸桿菌Escherichia coli中克隆表達(dá)，然后通過Ni-NTA親和柱對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行純化，收集SPase純酶并測(cè)定其酶學(xué)性質(zhì)，再將gtfA基因?qū)胧称钒踩?jí)枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis中，構(gòu)建重組菌株B.subtilis168/pMA5-gtfA，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，改善重組酶在胞內(nèi)的表達(dá)水平，并將重組枯草芽孢桿菌作為全細(xì)胞催化劑以蔗糖和甘油為底物合成2-O-α-D-甘油葡糖苷，反應(yīng)式如圖1所示。這也是首次將枯草芽孢桿菌全細(xì)胞催化的方法應(yīng)用于2-O-α-D-甘油葡糖苷的合成，同時(shí)通過全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化，獲得了較高的蔗糖轉(zhuǎn)化率和2-O-α-D-甘油葡糖苷產(chǎn)量，這為2-O-α-D-甘油葡糖苷的工業(yè)化生產(chǎn)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖1 蔗糖磷酸化酶催化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷[23]Fig.1 Synthesis of 2-O-α-D-glu-copyranosyl-sn-glycerol catalyzed by sucrose phosphorylase[23].

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

高校教師是一流大學(xué)及學(xué)科專業(yè)建設(shè)的主體力量。對(duì)于行業(yè)特色型大學(xué)而言，“雙一流”建設(shè)使命的完成有賴于高素質(zhì)的教師隊(duì)伍。在此背景下，科學(xué)有效地激發(fā)高校教師隊(duì)伍圍繞“雙一流”建設(shè)任務(wù)和目標(biāo)要求，積極投身到“雙一流”建設(shè)大潮之中就顯得非常急迫而重要。高校教師績(jī)效考核評(píng)價(jià)體系是教師行為的“指揮棒”，科學(xué)設(shè)計(jì)能夠反映行業(yè)特色型大學(xué)“雙一流”建設(shè)任務(wù)的考核評(píng)價(jià)機(jī)制就成為實(shí)現(xiàn)“雙一流”建設(shè)目標(biāo)的重要手段。［2］

枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis168、大腸桿菌E.coliBL21(DE3)及質(zhì)粒pMA5、pET-28a均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 酶和試劑

1.2.7 酶的最適pH的測(cè)定

BamHⅠ、XhoⅠ等限制性核酸內(nèi)切酶與DNA聚合酶購(gòu)于TaKaRa公司；小量質(zhì)粒提取試劑盒、同源重組試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)于南京諾維贊生物科技有限公司；2-O-α-D-甘油葡糖購(gòu)于德國(guó)Bitop AG公司；蔗糖、甘油和果糖等分析純?cè)噭┚?gòu)于上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖60 g/L，酵母粉20 g/L，蛋白胨20 g/L，七水合硫酸鎂2 g/L，尿素3 g/L，磷酸二氫鉀5 g/L，磷酸氫二鉀5 g/L，硫酸鋅0.143 g/L，檸檬酸鈉5 g/L；pH 7.0–7.2。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得編碼腸膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶的基因序列，選擇合適的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成兩對(duì)同源臂引物，序列參見表1。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 構(gòu)建重組表達(dá)菌株

酶活測(cè)定體系為1 mL，其中蔗糖0.4 mol/L，甘油1 mol/L，MES緩沖液 (pH 7.0) 50 mmol/L，50 μg純酶，35 ℃下反應(yīng)30 min，煮沸10 min終止反應(yīng)。將反應(yīng)液用0.2 μm濾膜過濾，稀釋后進(jìn)行HPLC檢測(cè)。檢測(cè)條件為[20]：Agilent Hi-Plex Ca色譜柱，RID檢測(cè)器，超純水作流動(dòng)相，柱溫85 ℃，流速 0.6 mL/min。酶活定義為：每1 min生成1 μmol 2-O-α-D-甘油葡糖苷所需的酶量為1個(gè)酶活單位 (U)。

這里還是“甜渣黨”們的天堂，一定得去一趟那些特色的wine shop，里面可謂是“臥虎藏龍”。同行的侍酒師孫昕就偶遇一間natural wine shop，里面竟然有著3000年前米西比亞時(shí)期的墓穴，不過更讓他興奮的是那豐富、獨(dú)特的自然酒和那頗有Geek范的老板。兩人興致勃勃地聊了好一會(huì)，小伙伴果斷花掉身上最后一個(gè)鋼，提著兩箱酒開開心心地走回酒店。

張自立回到五連至今，一直和母親住在一起。他和愛人申學(xué)群于2002年相識(shí)相愛，進(jìn)而走進(jìn)幸福的婚姻生活，兒子張睿健今年也9歲了，上小學(xué)三年級(jí)?，F(xiàn)如今，他們是三世同堂的幸福家庭。

挑重組菌E.coliBL21/pET-28a-gtfA于10 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)11–12 h后，以3% (V/V)的接種量轉(zhuǎn)接100 mL LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600達(dá)0.8–1.0時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)后，25 ℃培養(yǎng)11–12 h，離心收集菌體，緩沖液懸浮后進(jìn)行超聲破碎，將裂解液低溫離心，所得上清即重組菌粗酶液。將粗酶液用0.2 μm濾膜過濾處理，經(jīng)Ni-NTA親和柱純化后收集SPase純酶，測(cè)定其酶學(xué)性質(zhì)。

1.2.4 Spase在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)

挑重組菌B.subtilis168/pMA5-gtfA于10 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)11–12 h后，以2% (V/V)的接種量轉(zhuǎn)接100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)20 h后離心收集菌體，超聲破碎后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

將酶反應(yīng)體系分別在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃的條件下測(cè)定酶活，確定酶反應(yīng)的最適溫度，設(shè)置酶活最高組為100%對(duì)照。

就他本人研究初唐詩(shī)而言，章句家的詩(shī)、類書家的詩(shī)和“詩(shī)中的詩(shī)”，均有眼力判斷。他的《孟浩然》是從孫潤(rùn)夫家藏的王維所畫的“孟浩然像”說(shuō)起，《賈島》開篇勾勒賈島、姚合陰黯的形象，確乎源自性格的考量。定其品第，別其體性，估其價(jià)值，用歷史的眼光來(lái)研究，則已然是“綜合”下一階段的重心了。

以腸膜明串珠菌基因gtfA為模板，pET-28a-SP-F和pET-28a-SP-R為引物，PCR擴(kuò)增，并用BamHⅠ和XhoⅠ酶切質(zhì)粒pET-28a，膠回收酶切產(chǎn)物和PCR產(chǎn)物后用同源重組試劑盒進(jìn)行連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，涂布濃度為50 μg/mL卡那霉素的LB抗性平板過夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，送蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序，若測(cè)序正確，即重組菌株E.coliBL21/pET-28a-gtfA構(gòu)建成功。以基因gtfA為模板，pMA5-SP-F和pMA5-SP-R為引物，PCR擴(kuò)增，并用BamHⅠ和NheⅠ酶切質(zhì)粒pMA5，將酶切產(chǎn)物與PCR產(chǎn)物經(jīng)同源重組連接后轉(zhuǎn)化入E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，涂布濃度為100 μg/mL氨芐青霉素的LB抗性平板過夜培養(yǎng)，挑選測(cè)序正確的菌株，抽提質(zhì)粒pMA5-gtfA，轉(zhuǎn)化到B.subtilis168感受態(tài)細(xì)胞中，涂布濃度為50 μg/mL卡那霉素的LB抗性平板過夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，送蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序，若測(cè)序正確，即重組菌株B.subtilis168/pMA5-gtfA構(gòu)建 成功。

Sensory evaluation of foreign high-end branded creams 7 20

1.2.6 酶的最適溫度的測(cè)定

1.2.5 酶活測(cè)定

1.2.3 Spase在大腸桿菌中的表達(dá)和純化

因此，高校在大學(xué)生生涯規(guī)劃指導(dǎo)中應(yīng)緊密結(jié)合思想政治教育，變思政課程為課程思政，積極創(chuàng)新思政教育新模式，切合大學(xué)生的自主意識(shí)，充分調(diào)動(dòng)學(xué)生的主動(dòng)性、參與性，將教學(xué)重點(diǎn)與學(xué)生的興趣點(diǎn)有機(jī)結(jié)合起來(lái)，以學(xué)生喜聞樂見的方式呈現(xiàn)出來(lái)，讓學(xué)生易于接受。有的高校采用生動(dòng)的展板方式，組織學(xué)生辯論賽，組織學(xué)生拍攝微電影，借助微信平臺(tái)創(chuàng)建特色欄目，如江南大學(xué)的寶哥說(shuō)，內(nèi)容詼諧幽默，深受學(xué)生喜愛。同時(shí)把思政教育層面擴(kuò)展開來(lái)，學(xué)生并不是只在思政課上接受思想政治教育，全校的每一位教職工都應(yīng)肩負(fù)起學(xué)生思想政治教育的責(zé)任與重?fù)?dān)，把思政教育貫穿于課堂、宿舍、實(shí)驗(yàn)室等學(xué)校里的任何一個(gè)角落，與心理輔導(dǎo)、學(xué)生管理有機(jī)結(jié)合。

2.2 下載頻次 54篇高被引論文的總下載頻次為45 839次，單篇最高下載頻次為4 194次（對(duì)應(yīng)的被引頻次為104次），單篇最低下載頻次為81次（對(duì)應(yīng)的被引頻次為20次），平均下載頻次為849次∕篇。其中，下載頻次＞2 000次的論文有3篇，500次＜下載頻次≤2 000次的論文有26篇，100次＜下載頻次≤500次的論文有23篇，下載頻次≤100次的論文有2篇。

將酶反應(yīng)體系分別在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的條件下測(cè)定酶活，確定酶反應(yīng)的最適pH，設(shè)置酶活最高組為100%對(duì)照。其中3種不同的緩沖體系：檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液 (pH 4.0–6.0)、MES緩沖液 (pH 6.0–8.0)和甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液 (pH 8.0–10.0)。

1.2.8 酶的溫度穩(wěn)定性的測(cè)定

“經(jīng)過一段時(shí)間的實(shí)踐，‘聯(lián)合社’三方共贏的優(yōu)勢(shì)逐步顯現(xiàn)。”韓素蘭說(shuō)。農(nóng)業(yè)企業(yè)通過規(guī)模采購(gòu)向家庭農(nóng)場(chǎng)供應(yīng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，獲取差額利潤(rùn)；通過直接與家庭農(nóng)場(chǎng)聯(lián)結(jié)，建立穩(wěn)定的生產(chǎn)基地，既確保了原料穩(wěn)定供給，又減少了原料采購(gòu)中間環(huán)節(jié)，節(jié)約了成本；通過指導(dǎo)監(jiān)督家庭農(nóng)場(chǎng)生產(chǎn)，保障了農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。服務(wù)類農(nóng)民專業(yè)合作社向家庭農(nóng)場(chǎng)提供技術(shù)服務(wù)和作業(yè)服務(wù)，有了穩(wěn)定的服務(wù)面積和集中連片的作業(yè)環(huán)境；產(chǎn)業(yè)類合作社在幫助企業(yè)統(tǒng)一組織生產(chǎn)資料供應(yīng)及產(chǎn)品回收中獲得相應(yīng)的提成。

取純酶分別置于20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃的條件下保溫，定時(shí)取樣測(cè)定殘余酶活，設(shè)置初始酶活為100%對(duì)照。

為了后續(xù)利用構(gòu)建的重組枯草芽孢桿菌作為全細(xì)胞催化劑來(lái)合成2-O-α-D-甘油葡糖苷，通過優(yōu)化菌株培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間，改善SPase在宿主枯草芽孢桿菌的表達(dá)水平，以提高重組菌全細(xì)胞催化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的能力。

2.1.1 心理護(hù)理 術(shù)前關(guān)注患者的心理狀態(tài)至關(guān)重要［7］?；颊邽槟贻p女性，病史2年余，因咳嗽、咳痰、發(fā)熱就診于多家醫(yī)院，口服抗結(jié)核藥物效果不滿意，經(jīng)多次氣管鏡檢查發(fā)現(xiàn)氣管下段狹窄。隨著病情進(jìn)展呼吸困難加重，霧化、平喘、對(duì)癥治療無(wú)效，使患者對(duì)治療信心不足。雖然對(duì)手術(shù)抱有希望，但又擔(dān)心手術(shù)失敗。護(hù)士及時(shí)了解患者心理變化，隨時(shí)了解各種檢查結(jié)果，給予心理疏導(dǎo)。告訴其醫(yī)護(hù)人員及家人正在積極想辦法、做準(zhǔn)備，并列舉成功實(shí)施氣管手術(shù)的病例鼓勵(lì)患者，講解大致手術(shù)過程，增強(qiáng)患者戰(zhàn)勝疾病的信心。在不影響治療、護(hù)理的情況下，盡量讓家屬陪伴，增加患者安全感，使患者能積極配合檢查、治療。

1.2.9 酶的pH穩(wěn)定性的測(cè)定

取純酶分別置于pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的緩沖液中，保持2 h后，測(cè)定殘余酶活，以測(cè)得殘余酶活最高組為100%對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶基因gtfA的克隆與表達(dá)

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到腸膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶的序列，長(zhǎng)度為1 479 bp，合成該序列并作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖2A所示，可見特異性條帶位置與目標(biāo)基本一致。按照方法1.2.2構(gòu)建重組菌株E.coliBL21/pET-28a-gtfA，細(xì)胞破碎后，SDS-PAGE分析結(jié)果見圖2B，重組菌裂解物上清在約56 kDa位置表達(dá)有明顯的蛋白質(zhì)特征條帶，與報(bào)道中的分子量一致[24]，且經(jīng)Ni-NTA親和柱純化后的重組蛋白在相應(yīng)大小位置也有單一條帶，這表明基因gtfA在大腸桿菌中成功表達(dá)。

圖2 gtfA基因的克隆 (A)、表達(dá)及純化分析 (B)Fig.2 The result of gtfA gene cloning (A),expression and purification (B).(A) Lane M:DL 10 000 marker;lane 1–2:Gene gtfA.(B) lane M:protein marker;lane 1:E.coli BL21/pET-28a crude enzyme;lane 2:E.coli BL21/pET-28a-gtfA crude enzyme;lane 3:purified SPase.

2.2 溫度和pH對(duì)SPase酶活力和穩(wěn)定性的影響

2.2.1 溫度對(duì)SPase酶活力和穩(wěn)定性的影響

在不同溫度下測(cè)定SPase的酶活力，結(jié)果如圖3A所示，酶的最適反應(yīng)溫度為35 ℃，在20–45 ℃之間時(shí)具有較高酶活力，當(dāng)溫度超過45 ℃時(shí)，酶活力開始迅速下降。研究溫度對(duì)SPase穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖3B，可以看出，SPase在30 ℃、35 ℃保溫120 min后的殘余酶活力仍然高于80%，而在45 ℃保溫80 min后的殘余酶活力幾乎為零，這表明它在30–35 ℃范圍內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。

圖3 SPase的最適溫度 (A) 和溫度穩(wěn)定性 (B)Fig.3 Optimal temperature (A) and the temperature stability (B) of SPase.

2.2.2 pH對(duì)SPase酶活力和穩(wěn)定性的影響

在不同pH下測(cè)定SPase的酶活力，結(jié)果見圖4A。可以看出，酶的最適反應(yīng)pH為7.0，在pH處于6.0–8.0之間時(shí)具有較高酶活力。研究pH對(duì)SPase穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖4B，SPase在pH 6.0–7.0下保持2 h后的殘余酶活力仍在90%以上，表明其在此pH范圍內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。

圖4 SPase的最適pH (A) 和pH穩(wěn)定性 (B)Fig.4 Optimal pH (A) and the pH stability (B) of SPase.pH 3.0–6.0:citric acid-sodium citrate buffer;pH 6.0–8.0:MES buffer;pH 8.0–10.0:glycine-sodium hydroxide buffer.

2.3 SPase在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)

枯草芽孢桿菌通常被認(rèn)為是一種食品安全級(jí)菌種，因此我們選擇枯草芽孢桿菌作為宿主，用來(lái)開發(fā)2-O-α-D-甘油葡糖苷合成的全細(xì)胞生物催化方法。按照1.2.2中的方法構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌B.subtilis168/pMA5-gtfA，加入溶菌酶后超聲破碎，SDS-PAGE分析結(jié)果如圖5所示，重組菌破壁上清在約56 kDa大小處表達(dá)有清晰的蛋白條帶，即表明SPase在宿主B.subtilis168中成功表達(dá)。

圖5 SPase在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)Fig.5 Expression of SPase in B.subtilis.M:protein marker;lane 1:B.subtilis 168/pMA5 crude enzyme;lane 2:B.subtilis 168/pMA5-gtfA crude enzyme;lane 3:B.subtilis 168/pMA5-gtfA fermentation broth.

2.4 優(yōu)化SPase在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)

在頸椎減壓植骨融合術(shù)中，融合器在前期植骨愈合中起支撐作用，因此有必要對(duì)融合器的應(yīng)力進(jìn)行分析.圖6是融合器模型在各種運(yùn)動(dòng)下的等效應(yīng)力分布.在前屈運(yùn)動(dòng)圖6（a）時(shí)，融合器的應(yīng)力主要分布在上表面前方的鎖定孔的周圍以及下方區(qū)域，最大應(yīng)力為123.1 MPa；后伸運(yùn)動(dòng)時(shí)，主要分布在上表面的前方鎖定孔的周圍及后方區(qū)域，但最大等效應(yīng)力依然位于前方鎖定孔周圍，為115.5 MPa.側(cè)彎運(yùn)動(dòng)時(shí)，應(yīng)力主要分布在融合器的側(cè)面和鎖定孔周圍，最大值為54.09 MPa.軸向旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)時(shí)，應(yīng)力分布比較均勻，不存在應(yīng)力集中，最大值為45.03 MPa.

2.4.1 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

本研究所用pMA5質(zhì)粒搭載的是一種組成型的啟動(dòng)子[25]，不需要其他因子的誘導(dǎo)，外源基因即可穩(wěn)定表達(dá)，但其在宿主菌中表達(dá)水平的高低，會(huì)受環(huán)境因素的影響。按方法1.2.4接種重組菌B.subtilis168/pMA5-gtfA，轉(zhuǎn)接100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，分別在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃下培養(yǎng)16 h后，破碎細(xì)胞進(jìn)行酶活力測(cè)定。結(jié)果顯示 (圖6A)，在30 ℃下培養(yǎng)時(shí)，測(cè)得菌體裂解物的酶活力最高，為1.31 U/mL；溫度低于30 ℃時(shí)，菌株的生長(zhǎng)代謝速度過慢，表達(dá)量較低；而培養(yǎng)溫度高于35 ℃時(shí)，由于酶的熱穩(wěn)定性不佳，在較高溫度下，酶活性會(huì)逐漸喪失，所以測(cè)得的酶活也較低。

2.4.2 培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化

生活中類似的人性之惡與無(wú)恥并不罕見。2011年下半年，因?yàn)樗诖髮W(xué)接受教育部本科合格評(píng)估，我對(duì)學(xué)生的出勤抓得比較嚴(yán)，一有遲到、早退、曠課的行為都登記在冊(cè)，學(xué)生上課講小話什么的，也會(huì)遭到我的批評(píng)。沒想到期末教學(xué)檢查時(shí)，居然有學(xué)生利用匿名向老師書面提意見的機(jī)會(huì)將我說(shuō)得一無(wú)是處，甚至還捏造了我在課堂上的“違規(guī)行為”。好在我所在的文學(xué)院主持正義，當(dāng)年將我推薦為學(xué)校的優(yōu)崗，并公之于眾，才將個(gè)別學(xué)生的這種無(wú)恥之舉壓下去。

按方法1.2.4接種重組菌B.subtilis168/pMA5-gtfA，轉(zhuǎn)接100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基后，30 ℃分別培養(yǎng)12、14、16、18、20、22、24 h后，破碎細(xì)胞進(jìn)行酶活力測(cè)定。結(jié)果顯示 (圖6B)，培養(yǎng)20 h時(shí)菌體裂解物酶活力達(dá)到最高，為1.43 U/mL；繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，酶活力并沒有提高，可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵后期，其他代謝副產(chǎn)物的大量積累，影響了目的酶的表達(dá)。

圖6 培養(yǎng)溫度 (A) 及培養(yǎng)時(shí)間 (B) 對(duì)枯草芽孢桿菌中SPase表達(dá)的影響Fig.6 Influence of culture temperature (A) and time (B) on SPase expression in Bacillus subtilis.

2.5 重組菌B.subtilis 168/pMA5-gtfA全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的條件優(yōu)化

2.5.1 溫度對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的影響

溫度通過影響菌體狀態(tài)和酶促反應(yīng)的效率而影響2-O-α-D-甘油葡糖苷的合成。按方法1.2.4接種重組菌B.subtilis168/pMA5-gtfA，轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)20 h后離心收集菌體，進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷?？刂瞥跏挤磻?yīng)pH 7.0，蔗糖1 mol/L，甘油1 mol/L，菌體OD600為20，反應(yīng)溫度分別為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃的條件下進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)。結(jié)果如圖7A所示，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度為30 ℃時(shí)，蔗糖轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到53.2%，2-O-α-D-甘油葡糖苷產(chǎn)量為134.8 g/L；在45 ℃時(shí)，蔗糖轉(zhuǎn)化率較低，僅為28.4%。

2.5.2 初始pH對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的影響

按方法1.2.4接種重組菌B.subtilis168/pMA5-gtfA，轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)20 h后離心收集菌體，進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷，理論上轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程中pH無(wú)明顯變化，探究初始pH對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的影響?？刂品磻?yīng)溫度為30 ℃，蔗糖濃度1 mol/L，甘油濃度1 mol/L，菌體OD600為20，初始pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的條件下進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)。結(jié)果如圖7B所示，在pH小于7.0時(shí)，蔗糖轉(zhuǎn)化率隨pH的升高而增加，在pH 6.5–7.5時(shí)，產(chǎn)率較高，其中，pH 7.0時(shí)最高為53.5%。

2.5.3 菌體量對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的影響

車輛工程作為機(jī)械行業(yè)的一個(gè)代表產(chǎn)業(yè)和學(xué)科，汽車的設(shè)計(jì)、生產(chǎn)和發(fā)展也代表了機(jī)械行業(yè)的科技能力和一個(gè)國(guó)家制造水平。汽車行業(yè)作為一個(gè)較為成熟的領(lǐng)域，其中的制造技術(shù)和管理技術(shù)也對(duì)其他行業(yè)有著十分重要的借鑒性和啟示性，因此了解汽車方面的專業(yè)詞匯有很強(qiáng)的實(shí)用意義。

在轉(zhuǎn)化反應(yīng)中將菌體濃度控制在適宜的水平，對(duì)滿足生產(chǎn)需要和降低生產(chǎn)成本是至關(guān)重要的。按方法1.2.4接種重組菌B.subtilis168/pMA5-gtfA，轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)20 h后離心收集菌體，進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷?？刂品磻?yīng)溫度為30 ℃，初始pH 7.0，蔗糖濃度1 mol/L，甘油濃度1 mol/L，菌體OD600分別為10、20、30、40、50、60、70、80的條件下進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)。結(jié)果如圖7C所示，轉(zhuǎn)化體系菌體OD600為40時(shí)，蔗糖轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到61.7%，2-O-α-D-甘油葡糖苷產(chǎn)量為156.5 g/L；菌體量繼續(xù)增加，轉(zhuǎn)化率并沒有隨之提高，可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)化體系中，小部分的蔗糖被菌體自身用于維持基本的生命活動(dòng)所消耗。

圖7 溫度 (A)、pH (B)、菌體密度 (C) 及底物濃度 (D) 對(duì)重組菌B.subtilis 168/pMA5-gtfA全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的影響Fig.7 Influence of temperature (A),pH (B),cell density (C) and substrate concentration (D) on the transformation of 2-O-α-D-glu-copyranosyl-sn-glycerol in recombinant B.subtilis 168/pMA5-gtfA whole cells.

2.5.4 底物濃度對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的影響

當(dāng)反應(yīng)體系中沒有磷酸鹽的情況下，蔗糖磷酸化酶催化蔗糖分解為果糖和葡糖基-酶中間體，并以甘油為受體催化轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)合成2-O-α-D-甘油葡糖苷。理論上，蔗糖和甘油合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的摩爾比為1︰1，但以甘油為受體的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)是一個(gè)可逆反應(yīng)，反應(yīng)中使甘油過量，可能會(huì)促使蔗糖得到較高的轉(zhuǎn)化率。所以，控制反應(yīng)溫度30 ℃，初始pH 7.0，菌體OD600為40，蔗糖濃度1 mol/L，設(shè)置不同濃度蔗糖和甘油的摩爾配比的條件下進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷，結(jié)果如圖7D所示，轉(zhuǎn)化體系中的蔗糖和甘油的摩爾配比為1︰2.5時(shí)，蔗糖轉(zhuǎn)化率達(dá)76.3%，繼續(xù)增大甘油濃度，轉(zhuǎn)化率并沒有隨之提高。

2.6 5 L發(fā)酵罐全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷

為驗(yàn)證重組菌B.subtilis168/pMA5-gtfA在大體系中的轉(zhuǎn)化水平，在實(shí)驗(yàn)室5 L發(fā)酵罐進(jìn)行初步測(cè)試。用1 L 50 mmol/L的MES緩沖液懸浮B.subtilis168/pMA5-gtfA菌體，控制反應(yīng)溫度30 ℃，初始pH 7.0，蔗糖1 mol/L，甘油2.5 mol/L，菌體OD600為40的條件下于5 L發(fā)酵罐上進(jìn)行轉(zhuǎn)化，HPLC分析檢測(cè)轉(zhuǎn)化液中各組分含量。結(jié)果如圖8所示，前期的轉(zhuǎn)化速率較快，在24 h后反應(yīng)逐漸減慢，至48 h轉(zhuǎn)化率基本達(dá)到最大，共生成2-O-α-D-甘油葡糖苷189.3 g/L，平均轉(zhuǎn)化速率為15.6 mmol/(L·h)，蔗糖轉(zhuǎn)化率約為75.1%。可以發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)后期繼續(xù)延長(zhǎng)轉(zhuǎn)化時(shí)間，轉(zhuǎn)化率變化不明顯，出現(xiàn)這種情況的原因，一方面可能是由于反應(yīng)趨于平衡，另一方面可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)化時(shí)間較長(zhǎng)，酶活力逐漸喪失。

春節(jié)前后，人們都會(huì)參加大小的餐飲聚會(huì)，不定時(shí)定量的飲食往往會(huì)引起身體代謝系統(tǒng)的紊亂，而使體內(nèi)毒素堆積。其中，肝、腎是人體內(nèi)最重要的兩個(gè)排毒器官。那么，我們?cè)撊绾螢樽约旱纳眢w排毒呢？下面就推薦幾種天然排除人體毒素的食物，供大家選購(gòu)。

圖8 重組菌B.subtilis 168/pMA5-gtfA在5 L發(fā)酵罐全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷Fig.8 The recombinant B.subtilis 168/pMA5-gtfA whole cells catalyze the synthesis of 2-O-α-D-glucopyranosyl-sn-glycerol in 5 L fermenter.

3 討論

本研究將腸膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶基因gtfA在大腸桿菌中進(jìn)行克隆表達(dá)，研究其酶學(xué)性質(zhì)，再將gtfA基因?qū)胧称钒踩?jí)枯草芽孢桿菌，用來(lái)開發(fā)2-O-α-D-甘油葡糖苷合成的全細(xì)胞生物催化方法。成功構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌B.subtilis168/pMA5-gtfA，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，實(shí)現(xiàn)了蔗糖磷酸化酶在重組枯草芽孢桿菌胞內(nèi)的高效表達(dá)，并將重組菌用作全細(xì)胞生物催化劑合成2-O-α-D-甘油葡糖苷，利用優(yōu)化后的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件，在30 ℃、pH 7.0、菌體OD600為40、底物蔗糖濃度1 mol/L、甘油濃度2.5 mol/L的條件下，在5 L發(fā)酵罐進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化48 h后，生成2-O-α-D-甘油葡糖苷189.3 g/L，平均轉(zhuǎn)化速率為15.6 mmol/(L·h)，蔗糖轉(zhuǎn)化率約為75.1%，這是目前報(bào)道的利用重組枯草芽孢桿菌催化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的最高產(chǎn)量。2-O-α-D-甘油葡糖苷是一種在食品、化妝品、保健品及醫(yī)藥領(lǐng)域有著重大應(yīng)用前景的高附加值產(chǎn)品，本研究首次利用枯草芽孢桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法應(yīng)用于合成2-O-α-D-甘油葡糖苷，與酶法合成相比，全細(xì)胞催化發(fā)生在胞內(nèi)，反應(yīng)更穩(wěn)定，可重復(fù)利用率高，而且省去了酶法催化前期所需破碎細(xì)胞的過程，工藝流程更簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)效益更高；另外，將食品安全級(jí)菌株用作表達(dá)宿主，也拓寬了產(chǎn)品在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。然而，在合成2-O-α-D-甘油葡糖苷上，不管是酶法合成，還是全細(xì)胞催化方法，最終轉(zhuǎn)化液中都有一定濃度的蔗糖和果糖存在，雖然有研究報(bào)道過一種從轉(zhuǎn)化液中分離純化出2-O-α-D-甘油葡糖苷的方法，但也僅有63%的產(chǎn)品收率[20]。所以，仍需要通過改進(jìn)下游分離純化工藝[26]，以進(jìn)一步提高2-O-α-D-甘油葡糖苷收率?？傊?，本研究所構(gòu)建的重組枯草芽孢桿菌全細(xì)胞催化方法及其相關(guān)研究結(jié)果，為2-O-α-D-甘油葡糖苷的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用奠定了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。