寧雅茹，丁紅雷

西南大學 動物科技學院 獸醫(yī)傳染病學實驗室，重慶 400715

豬支原體肺炎 (Porcine enzootic pneumonia，PEP) 又名豬喘氣病、豬氣喘病或豬地方性流行性肺炎，是由豬肺炎支原體 (Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp) 感染引起的豬的一種慢性呼吸道傳染病?；疾∝i主要表現(xiàn)為咳嗽、喘氣、生長遲緩，病理剖檢以肺的尖葉、心葉、中間葉和膈葉前緣出現(xiàn)肉樣或蝦肉樣實變?yōu)樘卣鱗1]。

豬支原體肺炎廣泛存在于世界各地，我國超過99%的豬場存在Mhp感染。對該病的防控主要采取生物安全控制、疫苗免疫和投喂抗菌藥物3種措施[2]，但現(xiàn)有的商品化疫苗免疫保護效果較差，停止使用抗菌藥物后臨床癥狀又會再次出現(xiàn)，生物安全措施難以奏效。對該病的致病機理了解較少是阻礙切斷病原傳播途徑和研發(fā)有效疫苗和藥物的瓶頸?，F(xiàn)階段科學家難以建立支原體的基因操作平臺、基因組中色氨酸由終止密碼子TGA編碼等特性，給Mhp致病機制研究增加了極大的困難。雖然存在上述種種難題，支原體學家仍然在Mhp與宿主細胞互作方面取得了一定進展。本文結(jié)合筆者實驗室相關工作，對Mhp致病機制研究進行了綜述，并對今后Mhp致病機理研究方向進行了展望，以期為后續(xù)的Mhp-宿主互作研究提供借鑒，為有效疫苗和藥物開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 豬肺炎支原體對宿主細胞的黏附

黏附是病原菌與宿主相互作用的第一步。Mhp進入呼吸道后，黏附于氣管、支氣管和細支氣管纖毛上皮細胞，從而完成在呼吸道的定殖，進一步導致纖毛脫落、上皮細胞死亡[3]。參與黏附的主要是膜蛋白，目前已經(jīng)鑒定的Mhp膜蛋白超過60個[4-6]。其中，如Mhp107、Mhp108 (P116)、Mhp182 (P102)、Mhp183 (P97)、Mhp271、Mhp384、Mhp390 (P68)、Mhp493 (P216)、Mhp494 (P159)、Mhp540 (EF-Tu)、Mhp683、Mhp684 (P146) 等參與了Mhp對宿主細胞的黏附。各黏附蛋白及其已經(jīng)鑒定的黏附細胞及細胞外基質(zhì)蛋白見表1。

1.1 P97蛋白家族蛋白

P97蛋白家族蛋白是最早發(fā)現(xiàn)的與黏附相關的Mhp蛋白。該家族共包括7個蛋白，分別為Mhp107、Mhp183、Mhp271、Mhp280、Mhp385、Mhp483、Mhp684[7]。最早發(fā)現(xiàn)Mhp183蛋白一個分子量為97 kDa的片段與黏附相關，后來發(fā)現(xiàn)其家族的大部分成員也參與Mhp對宿主細胞的黏附。

1.1.1 P97

P97蛋白是最早發(fā)現(xiàn)的Mhp黏附素，它于1995年在Zhang等鑒定一株單抗F2G5時被發(fā)現(xiàn)[8]。F2G5能識別一個97 kDa的Mhp蛋白，該蛋白根據(jù)其分子量被命名為P97。當P97蛋白與纖毛結(jié)合后，抑制了Mhp與纖毛的結(jié)合；但這種抑制不是100%，所以他們認為應該還有其他的黏附素在Mhp與纖毛的結(jié)合中發(fā)揮作用[8]。Hus等[9]克隆了P97蛋白的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)P97蛋白由一個124.9 kDa的蛋白在其第195位氨基酸切割下來后形成。在大腸桿菌中表達的重組P97蛋白也能與豬的呼吸道纖毛結(jié)合，且被肝素 (Heparin)和褐藻多糖 (Fucoidan) 阻斷；結(jié)合部位位于P97蛋白羧基端，該區(qū)域有兩個重復區(qū)，分別命名為R1區(qū)和R2區(qū)。該研究小組進一步發(fā)現(xiàn)纖毛結(jié)合部位位于R1區(qū)，該區(qū)域包含“AAKPV(E)”重復序列；R1區(qū)至少要有7個“AAKPV(E)”重復才能完成與纖毛的結(jié)合[10]。單獨的R1區(qū)也能與纖毛結(jié)合，但需要包含8個“AAKPV(E)”重復[11]。這說明R1區(qū)的“AAKPV(E)”重復及其數(shù)量對P97與纖毛的結(jié)合至關重要。在不同的菌株中P97蛋白的分子量不同，在J菌株中，其分子量為94 kDa。原蛋白前體的前195個氨基酸則形成一個22 kDa的蛋白；P97的氨基端和羧基端可被進一步切割成66 kDa和28 kDa的兩個蛋白[12]。后來發(fā)現(xiàn)P97和22 kDa的蛋白是由mhp183基因編碼的一個126 kDa的前體蛋白裂解而成[7,13]。

病原菌與宿主細胞外基質(zhì) (Extracellular matrix，ECM) 成分的結(jié)合在啟動致病過程時具有重要作用。這些ECM包括纖連蛋白 (Fibronectin)、玻連蛋白 (Vitronectin)、層黏連蛋白 (Laminin) 和膠原蛋白 (Collagen) 等。ECM蛋白是葡萄糖胺聚糖 (Exogenous glycosaminoglycan)，如肝素、硫酸乙酰肝素 (Heparan sulfate) 和硫酸軟骨素B(Chondroitin sulfate B) 的連接蛋白。一些病原菌也能夠通過招募外源性葡萄糖胺聚糖到其表面，以方便病原與宿主ECM成分的相互作用。Jenkins等[13]研究發(fā)現(xiàn)，P97蛋白的N端 (653個氨基酸)和C端 (301個氨基酸) 都能與肝素以劑量依賴性的方式連接，且R1區(qū)和R2區(qū)在C端與肝素的連接中都是必不可少的。進一步研究發(fā)現(xiàn)P97蛋白除了能與肝素連接，還能與纖連蛋白和纖溶酶原 (Plasminogen) 連接；其羧基端裂解形成的28 kDa蛋白也能單獨直接與這3個蛋白結(jié)合[14]。

1.1.2 Mhp107

Mhp107蛋白是一個含1 032個氨基酸的104 kDa的P97蛋白家族成員?？梢苑譃榇笮?2.7 kDa、42.1 kDa和44.8 kDa的N端片段(F1Mhp107)、中間片段 (F2Mhp107) 和C端片段(F3Mhp107)。這3個片段都能和豬呼吸道上的纖毛結(jié)合。F1Mhp107片段還能和肝素及纖溶酶原結(jié)合；F3Mhp107片段除了能與纖連蛋白結(jié)合，還負責與豬腎傳代細胞系PK15的黏附[15]。

1.1.3 Mhp271

Mhp271是另一個含重復序列的P97家族蛋白，在其羧基端有3個重復序列，分別為R1A271、R1B271和R2271。該蛋白在不同菌株間序列同源性超過99%，主要變化在其重復序列，特別是R1B271和R2271區(qū)域。在R1A271區(qū)只有很少的序列變化，R1B271區(qū)的重復序列數(shù)從3–8個不等。以232菌株基因組為模板克隆的R2271–R1B271片段含9個R1重復和5個R2重復，能夠結(jié)合肝素、纖連蛋白和豬呼吸道纖毛，R1A271由于重復序列太少不能與這些成分結(jié)合[16]。

1.1.4 Mhp385

Mhp385有988個氨基酸，分子量為115 kDa。在其“761L-N-V↓A-V-S766”位點可被半胰肽(Semitryptic peptide) 切割成大小為88 kDa (P88385)和27 kDa (P27385) 的兩個蛋白。P88385能被肝素和纖毛結(jié)合位點識別，與之結(jié)合；P27385雖然有4個R1重復，但不能與肝素和纖毛結(jié)合[17]。

1.1.5 P216

Mhp493蛋白分子量為216 kDa，因此也稱P216蛋白，它可以分解為120 kDa (P120，N端)和85 kDa (P85，C端) 的兩個蛋白，切割位點為“1072T?N-F↓Q-E1076”[18]，這兩個蛋白均能和肝素與豬呼吸道纖毛結(jié)合[19]。在大腸桿菌表達的P216的3個片段F1P216(35–491位氨基酸)、F2P216(464–908位氨基酸)、F3P216(903–1 444位氨基酸)能夠與PK15細胞結(jié)合，而F2P216和F3P216則能和纖毛結(jié)合[19]。

1.1.6 P146

Mhp683蛋白分子量為147 kDa，因此也稱P146蛋白。該蛋白在兩個“S/T-X-F↓X-D/E”樣位點被切割為3個片段，分別是50 kDa、40 kDa和85 kDa的P50P146(N端片段)、P40P146(中間片段)和P85P146(C端片段)，這3個蛋白均位于Mhp表面，特異性地與豬呼吸道纖毛和肝素結(jié)合；此外，P85蛋白還能與纖溶酶原結(jié)合[20]。

1.2 P102蛋白家族蛋白

P102蛋白家族也包括7個成員，分別為Mhp108、Mhp182、Mhp272、Mhp274、Mhp275、Mhp384、Mhp683，已經(jīng)證明Mhp182、Mhp108、Mhp384、Mhp683參與了黏附過程，且Mhp182和Mhp108與黏附密切相關。

1.2.1 P102

Mhp182蛋白是一個含904個氨基酸的102 kDa的蛋白，因此也稱P102。該蛋白基因與mhp183位于同一個操縱子，在mhp183基因下游[7]。P102可自身水解為60 kDa和42 kDa的兩個蛋白，稱為P60和P42。這3個蛋白均位于細菌表面，且能與纖溶酶原結(jié)合。P102可使纖溶酶原被組織特異性的纖溶酶原激活劑 (Tissue-specific plasminogen activator，tPA) 激活，使其獲得降解纖維蛋白原(Fibrinogen) 的能力。此外，P102和P42還能與纖連蛋白結(jié)合；P102具有黏附于PK15細胞的能力[21]。

1.2.2 P116

P116蛋白由mhp108基因編碼。該蛋白羧基端的含311個氨基酸的39.6 kDa片段 (F4P116) 在與Mhp表面分子結(jié)合過程中發(fā)揮重要作用，可與纖連蛋白、纖溶酶原以劑量依賴性方式結(jié)合，其羧基端的賴氨酸殘基在與纖溶酶原結(jié)合過程中發(fā)揮重要作用。其37–295位的33.5 kDa (F1P116) 和542–699位的21.8 kDa (F3P116) 片段能與PK15細胞結(jié)合；所有4個片段 (F2P116：296–541位氨基酸，32.5 kDa；F4P116：700–1 010位氨基酸，39.6 kDa)均能與豬呼吸道纖毛結(jié)合，但與其他3個片段相比，F(xiàn)3P116的結(jié)合能力稍弱[22]。因此，P116通過多種途徑與宿主細胞黏附。

1.2.3 Mhp384

Mhp384含957個氨基酸，理論分子量為109.2 kDa。在Mhp內(nèi)找不到完整的Mhp384蛋白，其在“S/T-X-F↓X-D/E”樣位點被切割成大小為60 kDa (P60384) 和50 kDa (P50384) 的兩個蛋白。P60384和P50384均能被肝素和纖毛結(jié)合位點識別并結(jié)合[17]。

1.2.4 Mhp683

Mhp683蛋白大小為135 kDa，可自身水解為P45683(N端片段)、P48683(中間片段) 和P50683(C端片段) 3個蛋白，均位于Mhp表面。這3個蛋白之間的切割位點為“TTKF↓QE”。將Mhp683分段表達，分為F1683(42–308位氨基酸，37.3 kDa)、F2683(306–597位氨基酸，41.1 kDa)、F3683(595–803位氨基酸，30.5 kDa)、F4683(801–1 017位氨基酸，31.2 kDa)、F5683(1 017–1 194位氨基酸，27.3 kDa) 5段，這5個片段均能與肝素和豬呼吸道纖毛結(jié)合，說明Mhp683的3個自身水解片段也能與肝素和豬呼吸道纖毛結(jié)合[23]。

1.3 其他黏附蛋白

1.3.1 Fba

在232菌株中，果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(Fructose-1,6-bisphosphate aldolase，F(xiàn)ba) 由mhp014基因編碼；在168菌株中，其編碼基因為MHP168_014。該蛋白位于Mhp表面，能黏附于豬氣管上皮細胞 (Swine tracheal epithelial cells，STEC)。Fba重組蛋白制備的抗體可特異性阻斷Mhp對STEC的黏附；經(jīng)表面等離子共振研究發(fā)現(xiàn)其也能與纖連蛋白結(jié)合[24]。

1.3.2 Mhp036

Berry等發(fā)現(xiàn)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH) 也能位于Mhp表面，該蛋白由232菌株的mhp036基因編碼。親和層析結(jié)合試驗結(jié)果表明，Mhp的GAPDH蛋白能與肌動蛋白、纖連蛋白、肝素和纖溶酶原結(jié)合[25]。

1.3.3 Eno

Mhp烯醇化酶 (Enolase，Eno) 由232菌株mhp129基因編碼，在168菌株和J菌株中分別由MHP168_271和MHJ_0242編碼。類似于Fba，Eno也是一種菌體表面蛋白，可以黏附在STEC上，Eno抗體可特異性阻斷Mhp對STEC的黏附。免疫印跡和表面等離子共振證明，Eno還能與纖溶酶原以劑量依賴性方式結(jié)合[26]。

1.3.4 MHJ_0125

MHJ_0125蛋白由J菌株的MHJ_0125基因編碼，在232菌株中對應Mhp252蛋白，分子量為440 kDa，是一種氨肽酶，能形成十二聚體聚合物結(jié)構。MHJ_0125也是一個菌體表面的多功能黏附素，能與肝素和纖溶酶原結(jié)合。其與纖溶酶原的結(jié)合是劑量依賴性的，結(jié)合之后能促進tPA對纖溶酶原的激活[27]。

1.3.5 P68

P68蛋白在232菌株和168菌株中分別由mhp390和MHP168_418編碼。Liu等研究發(fā)現(xiàn)，P68位于Mhp菌體表面，以劑量依賴性方式與豬氣管纖毛結(jié)合，最佳結(jié)合濃度為0.1 μg/L[28]。

1.3.6 MHJ_461

MHJ_461是一種亮氨酸氨基肽酶，在232菌株和J菌株中分別由mhp462和MHJ_462編碼，單體分子量為51.4 kDa。在菌體表面形成由超過10個單體聚集而成的分子量分別為500 kDa和800 kDa的多聚蛋白。MHJ_461能與肝素結(jié)合，也能結(jié)合纖溶酶原，且在tPA存在時，幫助纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白酶[29]。

1.3.7 P110

P110是一種糖蛋白，能與豬氣管上皮細胞結(jié)合。P110能水解為1個P54蛋白和2個P28蛋白，這兩個蛋白也分別能與STEC結(jié)合[30]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，P110蛋白由159 kDa的Mhp494蛋白 (也稱為P159蛋白) 水解而來，該蛋白也能與肝素結(jié)合[31]。

1.3.8 P159

P159蛋白能被內(nèi)源性蛋白酶分別在“233F↓Q234”和“981F↓Q982”位點切割，形成P27、P110和P52三個蛋白[32]。這3個蛋白均能與PK15細胞結(jié)合[31-32]，也能與肝素以劑量依賴性方式結(jié)合[31-32]；P159的分段重組蛋白F2P159(31–264位氨基酸)和F4P159(958–1 405位氨基酸)能與纖毛結(jié)合，這2個區(qū)段分別包含在P110和P52蛋白中[32]。

1.3.9 EF-Tu

熱不穩(wěn)定延伸因子 (Elongation factor thermo unstable，EF-Tu) 在232菌株、168菌株和J菌株分別由mhp540、MHP168_533和MHJ_0524基因編碼，位于Mhp表面。研究發(fā)現(xiàn)該蛋白在Mhp中也可以作為一種黏附因子與細胞表面的纖連蛋白、肌動蛋白和纖溶酶原結(jié)合[33-34]，用EF-Tu抗體阻斷EF-Tu的功能后，Mhp與STEC的結(jié)合能力減弱[34]。

雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了近20種黏附相關蛋白，且估計將來還會有新的黏附蛋白被發(fā)現(xiàn)，但哪個黏附蛋白及宿主細胞表面的哪種ECM在Mhp對宿主細胞的黏附中發(fā)揮主要作用？此外，哪個黏附蛋白可作為下一代Mhp疫苗的保護性抗原？這是今后黏附蛋白研究中需重點解決的問題。

2 豬肺炎支原體對宿主細胞的損傷

不同毒力的Mhp菌株對宿主細胞的損傷程度不一。強毒菌株和中等毒力菌株感染STEC，能造成纖毛變粗、破損和脫落，而弱毒菌株對纖毛影響較??；與弱毒菌株相比，強毒菌株和中等毒力菌株感染細胞后能顯著降低細胞活性，促進STEC分泌MUC5B黏蛋白、一氧化氮 (Nitric oxide，NO) 和內(nèi)源性活性氧 (Reactive oxygen species，ROS)，引起細胞的氧化應激反應，且STEC的損傷程度與菌株的毒力呈正相關[35]。

細胞凋亡是細胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的有序性的細胞死亡過程。細胞凋亡可被細胞內(nèi)NO、ROS、促炎細胞因子、激素等激活[36-37]。在許多動物細胞中，過量的NO、ROS和Caspase-3是細胞凋亡的關鍵介質(zhì)。過量的NO與超氧陰離子自由基反應形成過氧亞硝酸鹽；線粒體產(chǎn)生的過量的ROS能突破細胞抗氧化防御系統(tǒng)發(fā)生氧化應激，激活細胞凋亡級聯(lián)反應；Caspase-3是膜受體調(diào)節(jié)和線粒體調(diào)節(jié)的凋亡通路中Caspase級聯(lián)反應的下游效應因子。脂相關膜蛋白 (Lipidassociated membrane proteins，LAMP) 是Mhp的重要致病因子，它能引起豬肺泡巨噬細胞 (Porcine alveolar macrophage，PAM)系3D4/21的凋亡，這種凋亡是通過產(chǎn)生NO、超氧陰離子和激活Caspase-3實現(xiàn)的[38]。LAMP也能通過p38 MAPK和Bax/Bcl-2信號通路造成豬外周血淋巴細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)[39]和St.Jude豬肺上皮細胞系 (St.Jude porcine lung epithelial cell line，SJPL)[40]的凋亡。已經(jīng)鑒定出多個與凋亡相關的LAMP蛋白，這些蛋白可以作為毒力因子促進細胞凋亡的發(fā)生。Mhp的Fba蛋白能刺激STEC產(chǎn)生丙酮酸，導致細胞凋亡[41]。Ⅰ型信號肽酶 (TypeⅠ signal peptidase，SPaseⅠ)則通過Caspase-3級聯(lián)信號途徑促進Mhp誘導的細胞凋亡[42]。Mhp390蛋白除了與豬氣管纖毛結(jié)合，還能刺激PBMCs中單核細胞和淋巴細胞及PAMs凋亡[28]，從而降低宿主的免疫反應。最近，Mhp597蛋白也被證明能導致PK15細胞凋亡[43]。

除了LAMP蛋白，膽固醇在Mhp導致的宿主細胞凋亡和損傷中也發(fā)揮重要作用。膽固醇含量高的豬肺組織，Mhp的感染也更加嚴重。其原因是膽固醇能加快Mhp的生長，并促進Mhp對PAMs的黏附，進而促進了Mhp導致的細胞凋亡[44]，這種凋亡也是通過增加過氧化氫 (Hydrogen peroxide，H2O2) 和產(chǎn)生NO，上調(diào)腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α) 表達水平和激活Caspase-3級聯(lián)信號途徑實現(xiàn)的。

Mhp在代謝過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物有時也能成為Mhp的重要致病因子。H2O2屬于ROS的一種，易穿透細胞膜，與細胞內(nèi)的還原型鐵離子通過芬頓反應生成高毒性的羥自由基，對多種細胞造成毒性。高毒力Mhp菌株能利用甘油生成H2O2，從而造成對細胞的毒性[45]。開始認為該過程是甘油-3-磷酸氧化酶 (Glycerol-3-phosphate oxidase，GlpO) 將甘油-3-磷酸 (Glycerol-3-phosphate) 轉(zhuǎn)化為磷酸二氫丙酮 (Dihydroxyacetone-phosphate，DHAP)，DHAP產(chǎn)生有細胞毒性的H2O2[46]；后來發(fā)現(xiàn)不同毒力菌株之間glpO基因轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有差異[45]。因此，在Mhp中，甘油通過何種途徑最終生成H2O2還需進一步研究。

除了對宿主細胞的直接損傷，Mhp的兩個表面蛋白酶，Xaa促氨肽酶PepP (232菌株中由mhp680基因編碼，J菌株中由MHJ_0659基因編碼) 和寡內(nèi)肽酶F-PepF (232菌株中由mhp520基因編碼，J菌株中由MHJ_0522基因編碼) 能降解促炎肽，其中PepP能降解緩激肽 (Bradykinin，BK)、P物質(zhì) (Substance P)和神經(jīng)肽Y (Neuropeptide Y，NPY)，PepF能降解BK、P物質(zhì)和神經(jīng)激肽(Neurokinin A，NKA)。BK能促進支氣管收縮，是一種促炎肽；NPY是一種炎癥介質(zhì)，P物質(zhì)和NKA有抗菌肽功能，能促進氣管支氣管內(nèi)黏液分泌和增加纖毛擺動頻率。破壞這4種蛋白就降低了纖毛擺動頻率和黏液纖毛清除效率，降低呼吸道纖毛對Mhp的清除，從而有利于Mhp在呼吸道纖毛的定殖[47]。

3 豬肺炎支原體刺激機體導致的炎癥反應

Mhp感染豬只后，能刺激機體的PBMCs產(chǎn)生一系列炎癥因子，如白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、IL-8、IL-18和TNF-α，這些炎癥因子也存在于支氣管肺泡灌洗液(Broncho-alveolar lavage fluids，BALF)[48]。Mhp刺激豬的骨髓來源樹突狀細胞 (Bone-marrowderived dendritic cells，BM-DCs) 產(chǎn)生IL-6、IL-8、IL-10、IL-12和TNF-α[49]。此外，Mhp能刺激鼠PAMs細胞產(chǎn)生IL-1β、IL-6和TNF-α；NF-κB在調(diào)控這些細胞因子的產(chǎn)生中具有重要作用[50]。Mhp刺激機體產(chǎn)生高水平炎癥因子可能是Mhp造成肺部病理損傷的重要原因。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Mhp390蛋白在Mhp刺激機體產(chǎn)生IL-1β和TNF-α中具有重要作用[28]。此外，Mhp597在Mhp感染細胞導致的炎癥反應中也能上調(diào)炎癥因子IL-1β、IL-8和TNF-α基因的表達。Toll樣受體4 (Toll-like receptor 4，TLR4) 在Mhp597誘導的炎癥反應中發(fā)揮重要作用，將TLR4沉默，能顯著降低Mhp597誘導的上述炎癥因子的表達；該反應通過TLR4下游的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路實現(xiàn)[43]。

4 宿主的免疫反應

Mhp感染機體引起的免疫反應包括體液免疫、黏膜免疫、細胞免疫和天然免疫。Mhp感染機體后通常要8–24周才能檢測到血清IgG抗體[51-52]，也有研究報道Mhp感染后21 d有不超過10%的豬只能檢測到血清IgG[53]；全菌抗原制備的滅活疫苗免疫后6周[54]甚至到14周[55]才能檢測到IgG，這與經(jīng)典免疫學理論中病原感染或疫苗免疫后1周左右即可檢測到IgG相比大大延遲。其主要原因應是血清抗體產(chǎn)生時間較晚；通過改變ELISA試劑盒的包被抗原，也可能會使IgG的檢測時間點提前。Garcia-Morante等[53]研究發(fā)現(xiàn)，在Mhp感染后21 d，超過90%的豬只在肺部均能產(chǎn)生IgG，說明IgG在呼吸系統(tǒng)產(chǎn)生較早。此外，IgG水平，特別是IgG2水平與肺部病理損傷呈正相關，抗體水平高則肺部病變嚴重[53]，這說明血清抗體不能提供免疫保護。Mhp滅活疫苗主要刺激機體產(chǎn)生體液免疫，但滅活疫苗既不能阻止Mhp在呼吸道的定殖，也不能阻斷Mhp在豬群內(nèi)和豬群之間傳播，有試驗證實已免疫Mhp滅活疫苗的豬群和未免疫豬群之間Mhp的感染率無顯著性差異[56-59]，這些研究進一步說明血清抗體在免疫保護中幾乎沒有作用。

吃初乳仔豬的斷奶體重顯著高于不吃初乳仔豬的斷奶體重，且與初乳攝入量呈正相關[60]。那Mhp初乳抗體是否能發(fā)揮免疫保護作用，降低或避免Mhp對仔豬的感染？通過文獻分析發(fā)現(xiàn)，在Mhp流行嚴重的豬群中，獲得Mhp母源抗體 (主要為IgM)的仔豬不出現(xiàn)豬支原體肺炎臨床癥狀，當母源抗體消失后，斷奶仔豬的臨床癥狀就會出現(xiàn)[61]。雖然免疫Mhp滅活疫苗不能阻止Mhp在母豬呼吸道的定殖，但其哺乳仔豬呼吸道中Mhp的定殖率遠遠低于未經(jīng)Mhp疫苗免疫母豬所產(chǎn)仔豬哺乳期內(nèi)呼吸道中Mhp的定殖率，且哺乳仔豬Mhp的感染率和母源抗體水平呈負相關[55,63]。這表明Mhp滅活疫苗產(chǎn)生的母源抗體在對仔豬的免疫保護中發(fā)揮了作用。因此，初乳抗體在免疫保護中的作用應是今后Mhp抗感染免疫的一個重要研究方向。

Mhp感染后刺激機體產(chǎn)生的IgA存在于外周血血清、支氣管肺泡灌洗液、鼻黏膜、氣管、肺門淋巴結(jié)和肺部[63]。黏膜抗體IgA產(chǎn)生時間要遠遠早于IgG的產(chǎn)生時間，以P97蛋白為抗原制備ELISA試劑盒，在Mhp感染后4 d即可檢測到鼻腔分泌物中的IgA[64]。因此，可以把IgA作為Mhp感染的早期檢測抗體。SIgA可能在Mhp感染中發(fā)揮免疫保護功能，當SIgA水平升高后，Mhp導致的臨床癥狀減輕，肺部病理損傷程度和氣管纖毛損傷程度降低，Mhp的負載量顯著下降[65]。Mhp弱毒疫苗經(jīng)鼻腔和胸腔免疫能產(chǎn)生高水平SIgA[66]，經(jīng)氣霧免疫也能產(chǎn)生相同的效果[67]。因此弱毒疫苗的免疫效果可能優(yōu)于滅活疫苗。IgA的產(chǎn)生受TLR2和TLR4的調(diào)控，Mhp感染后，TLR2和TLR4的表達量升高；抑制TLR2和TLR4的表達，IgA的分泌明顯降低[63]。因此，增強IgA的分泌應是下一代Mhp疫苗研發(fā)應考慮的問題。

早期研究認為，細胞免疫在Mhp的免疫保護中可能發(fā)揮主要作用[68]，但通過對Mhp感染后豬血清及肺泡灌洗液中IgG1和IgG2的檢測，Garcia-Morante等認為Th1細胞調(diào)節(jié)的免疫反應在Mhp感染中占主導地位，且Th1細胞產(chǎn)生IgG2的水平與肺部病理損傷嚴重程度呈正相關[53]。由于缺少合適的動物模型及相應的商品化試劑，關于細胞免疫在Mhp感染中的作用研究較少?？紤]到現(xiàn)在普遍使用的滅活疫苗免疫效果不佳且其主要刺激機體產(chǎn)生體液免疫，因此，應盡快建立合適的Mhp感染動物模型，加快相應試劑開發(fā)，加強對細胞免疫的研究，并評價其在免疫保護中的地位。

Trueeb等報道，Mhp能誘導不同類型的細胞產(chǎn)生天然免疫反應，如能刺激PMBCs和傳統(tǒng)樹突狀細胞2 (Conventional dendritic cells 2，cDC2)產(chǎn)生TNF，也能誘導豬血液中單核細胞、cDC1、cDC2和漿細胞樣樹突狀細胞 (Plasmacytoid dendritic cells，pDC) 上調(diào)CD40、CD25的表達，刺激了B細胞的增殖和IgM的產(chǎn)生[69]。自噬(Autophagy) 也是一種天然免疫反應，是細胞質(zhì)中非特異性蛋白質(zhì)被具有雙層膜結(jié)構的自噬體(Autophagosome) 包裹，與溶酶體融合形成自噬溶酶體 (Autolososome)，最終將自噬溶酶體中包裹的物質(zhì)降解的過程。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，Mhp能進入豬的傳代細胞系，如Che[70]和Raymond[71]等分別在2014年和2018年報道Mhp能進入PK15細胞；另一項研究證明Mhp也能進入豬肺泡巨噬細胞[72]。筆者實驗室從采集的豬肺泡巨噬細胞中檢測到了Mhp，進一步說明Mhp能進入細胞內(nèi)。我們還發(fā)現(xiàn)Mhp感染豬肺組織的臨床樣本中，與Mhp陰性樣品相比，自噬標志蛋白LC3-Ⅱ的表達量明顯升高，且與Mhp形成共定位；Mhp感染PK-15細胞能顯著增加自噬標志蛋白的表達，說明Mhp感染PK-15細胞也能導致自噬發(fā)生。此外還發(fā)現(xiàn)自噬體與溶酶體不能融合形成完整的自噬流，這造成Mhp在細胞內(nèi)隨著感染時間延長大量增殖，表明自噬促進了Mhp在細胞內(nèi)的增殖，但這種自噬反應是通過哪條信號通路介導還需進一步明確。自噬體與溶酶體的融合需要可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子黏附蛋白受體 (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors，SNARE) 復合物 (包括syntaxin 17、SNAP29、VAMP8等蛋白) 和Rab7、LAMP2的參與，SNAP47、ATG14也參與了這一融合過程。Mhp如何與這些蛋白相互作用阻斷自噬體與溶酶體的融合是本實驗室下一步要開展的工作。

5 總結(jié)與展望

Mhp感染宿主細胞的首要步驟是對宿主細胞的黏附，已經(jīng)有十幾個與黏附相關蛋白被鑒定出來，其黏附機制大部分也已經(jīng)被闡明。Mhp黏附之后對宿主細胞的直接損傷包括對纖毛的破壞、細胞毒性作用、宿主細胞的凋亡與死亡等，這些直接損傷是由哪些毒力因子導致的，如何實現(xiàn)與宿主細胞的互作及互作機制是什么，仍需進一步闡明。由于難以對Mhp開展基因操作，這給毒力基因的鑒定及其功能研究造成了很大的困難。建立Mhp基因操作系統(tǒng)應是今后Mhp致病機制研究需要攻克的重要技術平臺。

由于尚未建立Mhp感染的動物模型，使得Mhp相關的免疫學研究較為滯后，特別是其引起的初乳體液免疫、細胞免疫及天然免疫研究；另一方面就是Mhp如何逃避免疫系統(tǒng)攻擊，實現(xiàn)其在宿主細胞內(nèi)的增殖。此外，哪些蛋白，特別是哪些膜蛋白和分泌蛋白在免疫保護中扮演重要角色需要明確。筆者實驗室已經(jīng)鑒定了36個血清體液免疫顯性蛋白和8個只在體內(nèi)表達而體外無細胞培養(yǎng)不表達的血清體液免疫顯性蛋白[73](部分研究結(jié)果相關論文尚在審稿中)，這些蛋白的免疫學功能及免疫保護作用仍需要細胞學和動物試驗來證明。

加強Mhp與宿主互作及免疫機制研究將是今后Mhp基礎研究的重要方向，這有助于Mhp致病機制的闡明，同時對預防性生物制品和小分子靶向抗菌藥物的開發(fā)具有重要的理論指導意義。