張 輝，胡懷遠(yuǎn)

肺癌是全球范圍內(nèi)惡性腫瘤相關(guān)死亡首位原因[1]。據(jù)相關(guān)調(diào)查[2-4]，全世界每年新發(fā)病例約180萬，病死病例約159萬，我國新發(fā)與病死病例分別占65萬、59萬，是危害國民生命健康重要疾病類型。肺癌早期確診病人通過手術(shù)治療可獲得良好預(yù)后，但75%以上病人確診時處于疾病晚期，即使接受規(guī)范化放化療，5年生存率仍低于15%，預(yù)后較差[5-6]。表皮生長因子受體(EGFR)是首個于肺癌中篩查出的重要驅(qū)動因子，其下游通路參與腫瘤細(xì)胞的侵襲、增殖與轉(zhuǎn)移[7]。近年來隨著肺癌驅(qū)動基因?qū)W發(fā)展，針對EGFR酪氨酸激酶抑制劑分子靶向技術(shù)已成為不能手術(shù)EGFR基因突變肺癌一線治療手段，眾多病人受益于此，疾病控制率得到提高，但由于個體差異，存在部分病人EGFR基因突變檢測無法實(shí)施，不能為藥物靶向治療提供指導(dǎo)[8-9]。本研究選取70例晚期或局部晚期不能手術(shù)肺癌病人，分析EGFR基因突變與臨床病理特征關(guān)系，以期為不能獲取組織標(biāo)本進(jìn)行檢測病人合理應(yīng)用靶向藥物提供理論依據(jù)?，F(xiàn)作報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2018年7月我院收治的70例晚期或局部晚期不能手術(shù)肺癌病人，其中男37例，女33例，年齡43～91歲；吸煙史34例；肺穿刺活檢組織標(biāo)本29例，支氣管鏡活檢組織標(biāo)本41例；鱗癌34例，腺癌36例；未分化10例，低分化16例，中分化23例，高分化21例。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核通過，符合《世界醫(yī)學(xué)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：符合肺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]；腫瘤TNM分期Ⅳ期病人；入組前4周未接受過相關(guān)治療；自愿簽署知情同意書；無白血病。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：正在參與其他研究者；合并休克病人；認(rèn)知功能、精神異常者；預(yù)估生存期<3個月者；依從性較差者；伴有自身免疫類疾病者；不能耐受活檢者；臨床資料不完整者；不能獲得足夠組織標(biāo)本者。

1.3 方法

1.3.1 EGFR基因突變檢測方法

1.3.1.1 主要儀器 耐高溫塑料染色架(福州邁新，RAK-2001)；實(shí)時熒光定量PCR儀(Roche，Cobas Z480)；基因分析儀ABI3100型(美國ABI公司)；核酸蛋白定量儀(NanoDrop 2000)；電熱恒溫水箱CU600型(海門市其林貝兒公司)；RM2135型石蠟組織切片機(jī)、ST5020型染色機(jī)、EG1140H型包埋機(jī)、DM1000型顯微鏡、PELORISⅡ型脫水機(jī)，均購于德國Leica。

1.3.1.2 主要試劑 血清/血漿游離DNA試劑盒(武漢海吉力生物科技有限公司)；EGFR基因突變檢測試劑盒(武漢海吉力生物科技有限公司)；石蠟標(biāo)本組織DNA提取試劑盒(杭州迅捷生物技術(shù)有限公司)；蘇木精、中性樹膠、伊紅(北京索萊寶科技有限公司)；枸櫞酸組織抗原修復(fù)液(福州邁新MVS-0100/0101，0.01 mol/L，pH=6.0±0.01)；Taq DNA聚合酶與陽性質(zhì)控品(南京歐凱生物)。

1.3.1.3 外周血標(biāo)本采集、DNA提取、檢測 采集病人10 mL外周靜脈血標(biāo)本，置于抗凝管中，2 h內(nèi)按照兩級離心法離心，以血清/血漿游離DNA試劑盒抽提DNA，以核酸蛋白定量儀測定抽提DNA濃度，OD260/OD230>2.0，OD260/OD280：1.8～2.0。以EGFR基因突變檢測試劑盒檢測EGFR基因突變情況。

1.3.1.4 病理學(xué)切片制作 活檢組織標(biāo)本切片應(yīng)用乙醇進(jìn)行脫水，石蠟包埋，切片，厚度控制在4～5 μm，中性樹膠封片。

1.3.1.5 DNA提取 取10片石蠟切片，按臨床樣品基因組DNA小量提取試劑盒提取DNA，應(yīng)用分光光度計(jì)測量濃度，要求DNA樣本濃度>20 ng/mL，總量>200 ng。

1.3.1.6 PCR擴(kuò)增與檢測 (1)取出Taq DNA聚合酶與陽性質(zhì)控品，震蕩混勻待用；(2)取42.3 μL待測DNA樣品，加入42.3 μL純化水、2.7 μL Taq DNA聚合酶、42.3 μL陽性質(zhì)控品，漩渦器混勻，快速離心15 s；(3)取5 μL混勻的DNA樣品，靠PCR管上管壁加入8聯(lián)反應(yīng)條中，蓋好管蓋，離心處理；(4)置于實(shí)時熒光定量PCR儀，若不能及時上機(jī)，可在4 ℃冰箱或冰水混合物中保存PCR反應(yīng)條，12 h內(nèi)上機(jī)；(5)應(yīng)用套式PCR擴(kuò)增EGFR基因第19、21號外顯子，第19號外顯子上下游外、上下游內(nèi)引物序列分別為：5′-AAT ATC AGC CTT AGG TGC G-3′、5′-CCA GTA ATT GCC TGT TTC C-3′、5′-CTG GGC AGC ATG TGG CA-3′、5′-ATG TGG AGA TGA GCA GGG TCT-3；第21號上下游外、上下游內(nèi)引物序列分別為：5′-GTT CGC CAG CCA TAA GTC C-3′、5′-TCA TTC ACT GTC CCA GCA AG-3′、5′-TTC CCA TGA TGA TCT GTC CCT C-3′、5′-CAG CCT GGT CCC TGG TGT C-3′。第1～3階段擴(kuò)增條件分別為：1個循環(huán)、95 ℃ 5 min；15個循環(huán)、72 ℃ 20 s、95 ℃ 25 s、64 ℃ 20 s；31個循環(huán)、60 ℃ 35 s、93 ℃ 25 s、72 ℃ 20 s。第三階段60 ℃時收集HEX、FAM熒光信號，反應(yīng)結(jié)束實(shí)時熒光定量PCR儀自動輸出擴(kuò)增結(jié)果。

1.3.1.7 質(zhì)控 每次檢測最多30個樣本，均加入EGFR陰性對照與突變對照，兩者均有效則運(yùn)行有效，若其一與工作液反應(yīng)結(jié)果無效，整輪結(jié)果均視為無效，重新進(jìn)行檢測。

1.3.1.8 結(jié)果判讀 分為在EGFR檢測區(qū)域存在突變與無突變2種結(jié)果(見表1)。

表1 結(jié)果判讀

-示不適用b

1.3.2 治療方法 所有入組病人均給予尼妥珠單抗與多西紫杉醇+順鉑化療聯(lián)合治療：(1)75 mg/m2多西紫杉醇(廣東星昊藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20178012)與500 mL 5%葡萄糖混合后靜滴3 h左右，d1、d8；75 mg/m2順鉑(廣東嶺南制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20143124)與250 mL 0.9%氯化鈉溶液混合后靜滴1 h左右，d1～3。(2)化療同期予以尼妥珠單抗(百泰生物藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字S20080001)，第1～6周為1次/周靜滴，第7周起2次/周靜滴，劑量均為200毫克/次，3周為1個周期。2組均為2個治療周期。

1.4 療效評價 治療后根據(jù)實(shí)體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)劃分療效為完全緩解(病灶完全消失，CR)、部分緩解(病灶縮小>30%，PR)、穩(wěn)定(病灶縮小≤30%或增大<20%，SD)、進(jìn)展(病灶增大≥20%，PD)。疾病控制率(DCR)=(SD例數(shù)+PR例數(shù)+CR例數(shù))/總例數(shù)×100%。

1.5 觀察指標(biāo) (1)EGFR基因突變情況。(2)根據(jù)EGFR基因突變情況分為突變組、無突變組，分析2組年齡、性別、吸煙史、分化程度、組織學(xué)分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑等特征信息。(3)比較2組DCR。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用χ2檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)和logistic回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因突變情況 外周血與活檢組織標(biāo)本均檢測到EGFR基因突變30例，兩者EGFR基因突變率均為42.86%(30/70)，具有良好一致性。其中活檢組織標(biāo)本檢測發(fā)現(xiàn)15例第19號外顯子突變，17例第21號外顯子突變，第19與21號外顯子均存在突變2例。

2.2 EGFR基因突變與相關(guān)病理 突變組與無突變組在年齡、性別、吸煙史、分化程度、組織學(xué)分型分布方面差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑分布方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。年齡>50歲肺癌病人EGFR基因突變率高于≤50歲者(P<0.01)；女性肺癌病人EGFR基因突變率高于男性(P<0.01)；無吸煙史肺癌病人EGFR基因突變率高于有吸煙史者(P<0.01)；無分化、低中分化、高分化肺癌病人EGFR基因突變率差異明顯，且分化程度越高，突變率越高(P<0.01)；腺鱗癌、腺癌肺癌病人EGFR基因突變率高于大細(xì)胞癌、鱗癌(P<0.01)。

表2 EGFR基因突變與相關(guān)病理[n；百分率(%)]

續(xù)表2

變量 突變組 (n=30) 無突變組 (n=40)χ2P組織學(xué)分型 大細(xì)胞癌2(6.67)12(30.00) 鱗癌 腺鱗癌1(3.33)14(46.67)20(50.00)5(12.50)11.69<0.01 腺癌13(43.33)3(7.50)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有 無3(10.00)27(90.00)7(17.50)33(82.50)0.29>0.05腫瘤直徑/cm ≥3 <3 5(16.67)25(83.33)14(35.00)26(65.00)2.91>0.05

2.3 多因素分析 以單因素分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量為自變量進(jìn)行多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示，EGFR基因突變與分化程度、組織學(xué)分型獨(dú)立相關(guān)(P<0.05和P<0.01)(見表3)。

表3 預(yù)測EGFR基因突變的多因素分析

2.4 臨床療效 EGFR突變組療效明顯優(yōu)于無突變組(P<0.01)(見表4)。

表4 2組臨床療效比較[n；百分率(%)]

3 討論

EGFR位于7號染色體上，基因長約110 kb，屬于人EGFR家族中一個跨膜酪氨酸激酶受體，其編碼分為3個區(qū)域：細(xì)胞內(nèi)、跨膜區(qū)酪氨酸激酶活性區(qū)、細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)[11-12]。EGFR與細(xì)胞外配體于結(jié)合區(qū)結(jié)合后，可激活下游一系列信號通路，從而促進(jìn)細(xì)胞分化、生長，對正常細(xì)胞存活與功能發(fā)揮具有重要調(diào)控作用[13]。但既往研究[14-15]發(fā)現(xiàn)，肺癌病人體內(nèi)存在EGFR過表達(dá)現(xiàn)象，且與EGFR基因突變有關(guān)。而EGFR共有26個外顯子，目前已發(fā)現(xiàn)18～21外顯子為主要基因突變點(diǎn)：18外顯子突變，19外顯子缺失堿基，20外顯子堿基插入或突變，21外顯子突變[16]。突變可造成EGFR下游信號通路異常，細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡失去調(diào)控，最終發(fā)生腫瘤[17-18]。ANTONICELLI等[19]研究指出，EGFR基因突變90%左右發(fā)生于第19、21外顯子上。楊長紹等[20]研究顯示，第18、20號外顯子突變發(fā)生率較低，分別為3.2%、2.2%。本研究結(jié)果顯示，30例EGFR基因突變均發(fā)生于第19號、21號外顯子，與以上報(bào)道主要基因突變點(diǎn)相符。且本研究還發(fā)現(xiàn)，外周血與活檢組織標(biāo)本檢測到EGFR基因變率均為42.86%，均有良好一致性，這可為晚期不能耐受組織活檢病人EGFR基因突變的檢測提供一種思路。

影響EGFR基因突變因素較多，如吸煙史、年齡、組織分型、性別等，國內(nèi)外學(xué)者對此進(jìn)行了大量研究。如DASGUPTA等[21]報(bào)道顯示，從未吸煙肺癌病人EGFR基因突變率較高。LI等[22]對中國208例肺癌病人進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，女性、非吸煙者、腺癌病人EGFR基因突變率較高。張著學(xué)等[23-24]報(bào)道指出，高分化程度肺癌病人EGFR基因突變率高于未分化或低分化病人。本研究結(jié)果顯示，年齡>50歲、女性、無吸煙史、分化程度較高肺癌病人EGFR基因突變率較高，與以上研究結(jié)果相符。在惡性腫瘤生物學(xué)行為方面，組織病理學(xué)研究較分子生物學(xué)研究經(jīng)濟(jì)性高，且更有效率，因此EGFR基因突變與組織學(xué)分型關(guān)系始終是臨床研究熱點(diǎn)。丁昊等[25]報(bào)道顯示，EGFR基因突變多見于腺鱗癌。楊寧等[26]研究指出，肺腺癌EGFR基因突變率高于其他類型肺癌。SHOLL等[27]指出，EGFR基因突變多見于微乳頭腺癌，浸潤性黏液腺癌、實(shí)體狀腺癌較低。本研究結(jié)果顯示腺鱗癌EGFR基因突變率最高。推測不同組織學(xué)分型肺癌可能受基因突變機(jī)制影響而存在異質(zhì)性。梁穎等[28]研究對此進(jìn)行進(jìn)一步探討，發(fā)現(xiàn)肺癌病人EGFR基因突變不一致率較高。因此臨床進(jìn)行EGFR基因突變檢測時，應(yīng)盡量避免應(yīng)用含有實(shí)性或黏液成分較多腺癌標(biāo)本，以提高EGFR基因突變檢出率。以往大多學(xué)者研究多局限于此，本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)行深入分析發(fā)現(xiàn)，EGFR基因突變與年齡、性別、吸煙史無明顯相關(guān)性，而與分化程度、組織學(xué)分型獨(dú)立相關(guān)(P<0.05)，提示肺癌病人腫瘤分化程度、組織學(xué)分型才為預(yù)測EGFR基因突變有價值參考指標(biāo)。

此外，以往研究[29]表明，EGFR絡(luò)氨酸激酶抑制劑對EGFR基因突變病人有效，而對EGFR未突變病人基本無效，這是臨床制定靶向性治療方案重要依據(jù)。劉冰等[30]研究發(fā)現(xiàn)，肺癌病人應(yīng)用EGFR-TKI類藥物治療時，突變陽性者DCR明顯優(yōu)于突變陰性者，其原因與EGFR基因突變對酪氨酸激酶抑制劑敏感性較高有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，突變組DCR(93.33%)高于無突變組(55.00%)(P<0.05)，提示以EGFR基因突變?yōu)橐罁?jù)，選用針對性EGFR絡(luò)氨酸激酶抑制劑能提高疾病控制率。但EGFR表達(dá)在預(yù)測靶向治療對病人生存率方面的價值仍存在爭議。張旭剛等[31]研究指出，EGFR基因突變是肺腺癌病人遠(yuǎn)期生存率獨(dú)立影響因素。張童童等[32]對比了肺癌常見驅(qū)動基因指導(dǎo)下靶向治療的效果，發(fā)現(xiàn)靶向治療對EGFR基因突變病人無進(jìn)展生存期無顯著影響。目前普遍認(rèn)同的是，EGFR基因突變是EGFR絡(luò)氨酸激酶抑制劑應(yīng)用指征，能提高短期療效，但對疾病長遠(yuǎn)影響尚需長期隨訪進(jìn)行驗(yàn)證。另臨床確診肺癌病人TNM可分為Ⅰ～Ⅳ期，Ⅰ～Ⅲ期常采用以手術(shù)為主綜合治療方案，Ⅳ期主要采用保守治療方法，故本研究僅探析TNM Ⅳ期肺癌病人EGFR基因突變相關(guān)情況，而TNM Ⅰ～Ⅲ期病人是否存在此規(guī)律，有待擴(kuò)大樣本量深入分析。

綜上所述，EGFR基因突變多發(fā)于第19號、21號外顯子，且多見于年齡>50歲、女性、無吸煙史、分化程度較高、腺鱗癌、腺癌肺癌病人，腫瘤分化程度、組織學(xué)分型與EGFR基因突變獨(dú)立相關(guān)，存在EGFR基因突變病人DCR較高，有利于臨床靶向治療的篩選。