簡(jiǎn)小朋 張怡春 王雨青 李淼 詹曉平 史慧穎 夭建華 高茜

摘要?為了方便、高效地模擬口含煙煙堿的體內(nèi)吸收行為，采用PEG改性的聚丙烯酸酯薄膜模擬人口腔黏膜，研究了聚合物薄膜控制口含煙煙堿的體外釋放性能。結(jié)果表明，聚合物薄膜控制口含煙煙堿的體外釋放符合零級(jí)釋放方程，降低薄膜的厚度或增加薄膜中PEG的分子量，可以增大煙堿的滲透速率，DSC和SEM表征結(jié)果說明PEG和PAL互混后形成了均相的IPN-1D薄膜，接觸角表征說明PEG增強(qiáng)了薄膜的親水性，薄膜控制煙堿體外釋放的滲透速率與煙堿的體內(nèi)吸收速率值相近。因此，PEG改性的聚丙烯酸酯薄膜可用于口含煙煙堿的體外釋放評(píng)價(jià)。

關(guān)鍵詞?口含煙，口腔黏膜，煙堿，聚丙烯酸酯薄膜，體外釋放

中圖分類號(hào)?TS45文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2020）06-0170-05

Abstract?In order to simulate the in vivo absorption behavior of nicotine in snus，a PEGmodified polyacrylate film was used to simulate human oral mucosa，and the in vitro release of nicotine from the polymer film was studied.The results showed that the in vitro release behavior of nicotine from the polymer film accorded with a zeroorder release equation，the permeation rates of nicotine reduced with the increase of the thickness of the film or the molecular weight of PEG，DSC and SEM results indicated the IPN1D film mixing PEG and PAL was homogeneous，the contact angle characterization indicated that PEG enhanced the hydrophilicity of the film，the permeation rates of nicotine from the film were similar to the in vivo absorption rate of nicotine.Therefore，the PEGmodified polyacrylate film could be used for in vitro release evaluation of nicotine in snus.

Key words?Snus，Oral mucosa，Nicotine，Polyacrylate film，In vitro release

口含煙是將磨碎的煙草顆粒經(jīng)過加工后直接放在口腔中消費(fèi)的一種無煙氣煙草制品[1]。相比于傳統(tǒng)卷煙，口含煙不發(fā)生燃燒和裂解，因此不產(chǎn)生燃燒產(chǎn)物和裂解產(chǎn)物，被認(rèn)為對(duì)人體的危害性更小[2-7]。近年來，隨著世界反吸煙運(yùn)動(dòng)的不斷發(fā)展，口含煙作為煙草消費(fèi)的補(bǔ)充形式日益受到關(guān)注，國(guó)內(nèi)也已開展口含煙的各項(xiàng)研究工作[8-10]，其中包括了評(píng)價(jià)口含煙效力的研究。由于人類吸食煙草制品行為的個(gè)體差異，煙草制品標(biāo)示的煙堿量并不能準(zhǔn)確反映人體攝入的煙堿量。若要準(zhǔn)確評(píng)價(jià)口含煙的效力，需要監(jiān)測(cè)煙堿的血藥濃度和持續(xù)時(shí)間，但如果每批次的口含煙制品都要依賴體內(nèi)試驗(yàn)獲得這些數(shù)據(jù)，不僅操作繁瑣，增加成本，還對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和實(shí)驗(yàn)環(huán)境的要求較高。因此，使用體外釋放試驗(yàn)的數(shù)據(jù)來預(yù)測(cè)煙堿的體內(nèi)吸收，建立體外釋放和體內(nèi)吸收的相關(guān)性是評(píng)價(jià)口含煙效力更簡(jiǎn)單、更高效的方法。目前，研究口含煙體外釋放的方法主要包括：①開發(fā)模擬口腔環(huán)境的新裝置，比如中國(guó)專利CN109030398A的新裝置是通過人工唾液淋洗口含煙收集待測(cè)組分，使用改良的藥物溶出儀即時(shí)檢測(cè)待測(cè)組分中的煙堿濃度[11]，中國(guó)專利CN205352766U的新裝置是將口含煙置于兩層薄膜之間，薄膜內(nèi)部導(dǎo)入的人工唾液浸潤(rùn)口含煙后，檢測(cè)導(dǎo)出液中的煙堿濃度[12]。這些裝置的作用都是在模擬口含煙在口腔中的溶出情況，但溶出的煙堿量并不能準(zhǔn)確反映吸收的煙堿量，該方法無法評(píng)價(jià)口含煙的效力，②使用動(dòng)物皮膚來模擬人口腔黏膜，比如口含煙煙堿滲透穿過豬口腔黏膜的體外透皮試驗(yàn)[13]，但由于離體的動(dòng)物皮膚易喪失生物活性，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性差，也無法準(zhǔn)確評(píng)價(jià)口含煙的效力。筆者開發(fā)出一種既能復(fù)原人口腔黏膜的生物活性又具有穩(wěn)定性能的材料，其可用于評(píng)價(jià)口含煙的體外釋放行為，并且體外釋放行為能用于模擬煙堿體內(nèi)吸收，這對(duì)于口含煙的體外評(píng)價(jià)具有重要作用。

口含煙在使用時(shí)，由于口腔黏膜的上皮細(xì)胞被厚度為40～300 μm的黏液覆蓋，黏液不僅快速溶解釋放出口含煙中的煙堿，還將煙堿運(yùn)載到黏膜的各個(gè)位置，其中部分的煙堿被直接吞咽，剩余的煙堿被口腔黏膜吸收進(jìn)入體循環(huán)?？谇火つな菬焿A吸收的主要屏障，煙堿在口腔的吸收是個(gè)被動(dòng)擴(kuò)散的過程，但同時(shí)口腔黏膜因其滲透性好，血流量豐富，被口腔黏膜吸收后的煙堿會(huì)快速進(jìn)入體循環(huán)。因此開發(fā)的新材料應(yīng)該具有以下的特點(diǎn)：親水性好，能模擬水溶性煙堿在口腔黏膜上的快速分布，表面結(jié)構(gòu)致密，能模擬口腔黏膜的屏障作用，對(duì)煙堿具有良好的滲透性能，能模擬煙堿被口腔黏膜吸收的過程。由于聚丙烯酸酯薄膜對(duì)小分子藥物具有良好的滲透性能[14]，筆者將對(duì)這類薄膜進(jìn)行改性，使其能用于口含煙的體外釋放評(píng)價(jià)。

1?材料與方法

1.1?試劑與儀器

1.1.1?試劑?？诤瑹煟?017年產(chǎn)金鹿牌口含煙，上海新型煙草制品研究院有限公司），丙烯酸酯單體（Aldrich（USA）公司，分析純），過氧化二苯甲酰（上海國(guó)藥試劑有限公司），聚乙二醇（PEG，購(gòu)自上海國(guó)藥試劑有限公司），煙堿（98.54%，購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司），磷酸氫二鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），三乙胺（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司），磷酸（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司），甲醇（上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司）。

1.1.2?儀器。Waters高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），RYJ-6B藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀（上海黃海藥檢儀器有限公司），Valia-Chien擴(kuò)散池（上海交通大學(xué)藥學(xué)院制備，擴(kuò)散面積0.785 cm2），紫外光固化儀（總功率3 000 W，北京埃士博機(jī)械電子設(shè)備中心），電子天平（梅勒特-托利多儀器（上海）有限公司）。

1.2?方法

1.2.1?口含煙體內(nèi)吸收的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的建立。

由于該研究中使用的這款國(guó)產(chǎn)口含煙還未有血藥濃度方面的數(shù)據(jù)，參考了國(guó)外幾款口含煙的藥時(shí)曲線數(shù)據(jù)[15]，對(duì)煙堿在第一個(gè)半衰期內(nèi)（小于2 h）的藥時(shí)曲線數(shù)據(jù)用Origin Lab軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并對(duì)曲線進(jìn)行調(diào)零（即0 h時(shí)的血藥濃度值為零），得到表1中的濃度欄的數(shù)據(jù)。根據(jù)正常人的血液總量約相當(dāng)于體重的7%～8%，成年男性體重約70 kg，估算出一個(gè)成年人的血液量約5 L。文獻(xiàn)報(bào)道試驗(yàn)時(shí)每次采血5 ?mL，可以估算出血液中的煙堿量，結(jié)果見表1。

1.2.2?聚合物薄膜的制備。鏈狀丙烯酸酯聚合物（PAL）的合成方法參考文獻(xiàn)[14]，將2-丙烯酸-2-羥基-3-苯氧基丙酯、4-羥基丁基丙烯酸酯、馬來酸二乙酯按照質(zhì)量比4∶4∶2混合，再加入3%（m/m）過氧化二苯甲酰（BPO），攪拌至BPO完全溶解，得到單體溶液。取適量單體溶液置于不銹鋼模具內(nèi)，進(jìn)行紫外光固化反應(yīng)，全功率3 kW，反應(yīng)時(shí)間4 min，得到鏈狀丙烯酸酯聚合物（PAL）。

為了增強(qiáng)薄膜的親水性，用PEG來改性PAL薄膜，1D鏈狀聚丙烯酸酯/PEG互穿聚合物（IPN-1D）的合成方法：將2-丙烯酸-2-羥基-3-苯氧基丙酯、4-羥基丁基丙烯酸酯、馬來酸二乙酯按照質(zhì)量比4∶4∶2混合，再加入3%（m/m）過氧化二苯甲酰（BPO），攪拌至BPO完全溶解，得單體溶液A，將不同分子量的PEG混合，如果PEG是固體，則加熱助溶，得PEG溶液B，將單體溶液A與PEG溶液B按質(zhì)量比9∶1混合，得到混合物溶液C，取適量混合物溶液C置于不銹鋼模具內(nèi)，進(jìn)行紫外光固化反應(yīng)，全功率3 kW，反應(yīng)時(shí)間4 min，得1D鏈狀聚丙烯酸酯/PEG互穿聚合物（IPN-1D）。

1.2.3?聚合物薄膜的表征。

（1）FTIR表征。儀器Thermo，NICOLET iS10（美國(guó)）。聚合物薄膜冷凍干燥，厚度控制在20 μm以下，采用ATR法直接掃描薄膜，掃描波數(shù)700～4 000 cm-1，分辨率1 cm-1。

（2）DSC表征。儀器PerkinElmer，DSC8500差示掃描量熱儀（美國(guó)）。氮?dú)獗Ｗo(hù)，以10 ℃/min的速度從-60 ℃升溫到120 ℃，2次加熱升溫。

（3）SEM表征。儀器FEI/Philips，Sirion 200高分辨場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡SEM（美國(guó)）。薄膜表面需噴金后進(jìn)行檢測(cè)。

（4）接觸角（θ）表征。儀器Biolin Scientific，ThetaLite 101（瑞典）。在聚合物薄膜表面滴10 μL水滴，測(cè)量左接觸角和右接觸角，取平均值。

1.2.4?聚合物薄膜控制口含煙中煙堿的體外釋放的研究。

磷酸緩沖液的配制：取85 mL 0.33 mol/L的Na2HPO4·12H2O水溶液，15 mL 0.33 mol/L的KH2PO4水溶液，混勻即得0.33 mol/L磷酸緩沖液，pH為7.5，取0.33 mol/L磷酸緩沖液 100 mL，加入0.9%NaCl溶液2 900 mL，混勻即得0.01 mol/ L的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）[9]。

將聚合物薄膜固定在Valia-Chien水平擴(kuò)散池之間，Valia-Chien水平擴(kuò)散池的示意圖見參考文獻(xiàn)[16]。擴(kuò)散試驗(yàn)參數(shù)設(shè)置如下：水浴溫度37 ℃，攪拌速度200 r/min。供給池內(nèi)放置1袋口含煙樣品，供給液和接收液均為10 mL的磷酸緩沖液。分別在1、2、3、4、5、6、7、8 h取1 mL樣品，同時(shí)補(bǔ)充等量磷酸緩沖液。每組平行試驗(yàn)3次，樣品檢測(cè)參考文獻(xiàn)報(bào)道的HPLC方法[13]。

1.2.5?數(shù)據(jù)處理。單位面積的薄膜上煙堿釋放量（Q）的計(jì)算公式：

式中，V為接受池體積（mL），Vi為每次取樣體積（mL），Cn和Ci分別為第n次和第i次取樣時(shí)接受液的濃度（μg/mL），A為擴(kuò)散面積（cm2）。

滲透速率（J）：將累積釋放量Q對(duì)時(shí)間（t）的曲線圖，用直線進(jìn)行擬合，擬合得到的直線斜率即為滲透速率（J），單位為μg/（cm2·h）。

1.2.6?口含煙中煙堿體外釋放的數(shù)學(xué)模型。采用Origin Pro 2016 軟件對(duì)體外滲透試驗(yàn)數(shù)據(jù)分別進(jìn)行零級(jí)、一級(jí)、Higuchi方程擬合。

2?結(jié)果與分析

2.1?口含煙中煙堿體內(nèi)吸收速率

使用口含煙時(shí)，每袋口含煙標(biāo)示的煙堿量（W0）減去使用后殘留在口含煙中的煙堿量（W1），可以得到消耗的煙堿量（W2），即W2=W0-W1。在消耗的煙堿量（W2）中，部分煙堿隨唾液被吞咽后在胃腸道中被快速清除，其余煙堿被人口腔黏膜吸收后進(jìn)入體循環(huán)。以10.19 cm2的人上唇面積[17]，估算表1中的數(shù)據(jù)得到煙堿透過單位面積的口腔黏膜的速率從1.22 μg/（cm2·h）至3.45 μg/（cm2·h）不等（表2）。表2還表明，煙堿體內(nèi)吸收速率與口含煙中煙堿標(biāo)示量（W0）和消耗的煙堿量（W2）均不存在正相關(guān)，這也從側(cè)面說明用標(biāo)示量（W0）和消耗量（W2）不能預(yù)測(cè)體內(nèi)吸收情況。目前已開發(fā)的幾款模擬口腔環(huán)境的新裝置[11-12]檢測(cè)的就是煙堿消耗量（W2），并不能真實(shí)反映口含煙煙堿的體內(nèi)吸收。

2.2?聚合物薄膜控制口含煙中煙堿的體外釋放的研究

2.2.1?PAL薄膜控制口含煙中煙堿的體外釋放。

考察了厚度為30和40 μm的PAL薄膜控制口含煙中煙堿的體外釋放的行為（表3），分別用零級(jí)、一級(jí)和Higuchi方程來擬合體外釋放結(jié)果，擬合時(shí)以相關(guān)系數(shù)（r）最接近1為最好擬合結(jié)果。通過比較各擬合方程的相關(guān)系數(shù)可看出，零級(jí)方程較好地?cái)M合了PAL薄膜控制煙堿的體外釋放行為（表4）。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PAL薄膜的厚度從40 μm降至30 μm時(shí)，滲透速率從1.363 9 μg/（cm2·h）增至2.033 4 μg/（cm2·h），此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[15]的結(jié)果相一致，即降低了薄膜厚度，可以增大滲透速率。

2.2.2?IPN-1D薄膜控制口含煙中煙堿的體外釋放。

分別考察了PEG200、PEG600、PEG4000與PAL組成的1D鏈狀聚丙烯酸酯/PEG互穿聚合物（IPN-1D）薄膜控制口含煙中煙堿的體外釋放行為（表5），并用零級(jí)、一級(jí)和Higuchi方程來擬合體外釋放結(jié)果（表6）。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雖然Higuchi方程對(duì)IPN-1D∶PEG600（膜厚30 μm）組呈現(xiàn)出更好的擬合效果，但其對(duì)IPN-1D∶PEG4000（膜厚30 μm）組的擬合效果較差，一級(jí)方程無法對(duì)IPN-1D∶PEG200（膜厚40 μm）組進(jìn)行擬合，零級(jí)方程對(duì)三組薄膜擬合的r大于0.95，說明零級(jí)方程能較好地?cái)M合IPN-1D薄膜控制煙堿體外釋放的行為。

PAL（膜厚40 μm）對(duì)煙堿的滲透速率為1.363 9 μg/（cm2·h），當(dāng)PAL中加入PEG200后，得到的IPN-1D∶PEG200（膜厚40 μm）的滲透速率為1.598 μg/（cm2·h）。該結(jié)果表明PEG可以增大薄膜的滲透速率。此外，隨著PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，薄膜的滲透速率增大，比如PAL（膜厚30 μm）、IPN-1D∶PEG600（膜厚30 μm），IPN-1D∶PEG4000（膜厚30 μm）的滲透速率分別是2.033 4、2.854 6和5.150 7 μg/（cm2·h）。

2.3?人工生物膜的表征

2.3.1?FTIR表征。比較IPN-1D∶PEG200、IPN-1D∶PEG600、IPN-1D∶PEG4000 3種薄膜的FTIR數(shù)據(jù)（圖1），發(fā)現(xiàn)這3種薄膜的FTIR數(shù)據(jù)非常相似，這是因?yàn)?種薄膜的單體成分一樣，區(qū)別在于聚乙二醇的聚合度不同，因此FTIR的特征吸收峰相同。以IPN-1D∶PEG200薄膜為例，進(jìn)行FTIR吸收峰的歸屬：3 100～3 600 cm-1 （νOH），2 936 cm-1 （νCH），1 599，1 495和1 448 cm-1 （νC=C，aromatic ring），755 cm-1 （δCH，aromatic ring），1 724 cm-1 （νC=O），1 160和1 241 cm-1 （νC-O-C ），1 041 cm-1 （νC-OH）。

2.3.2?DSC表征。IPN-1D∶PEG200、IPN-1D∶PEG600、IPN-1D∶PEG4000薄膜的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）依次為-6.9、-10.2和-13.4 ℃（圖2）。在每種IPN-1D薄膜中僅觀察到一個(gè)Tg值，說明IPN-1D是均相體系。結(jié)合Zhan等[14]報(bào)道的PAL的Tg值為8.819 ℃，發(fā)現(xiàn)隨著PEG分子質(zhì)量的增加，薄膜的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度降低，聚合物的分子鏈越柔軟，因此煙堿分子越易滲透穿過薄膜，這與滲透速率的結(jié)果一致。

2.3.3?SEM表征。

IPN-1D∶PEG200薄膜在2萬(wàn)倍、40萬(wàn)倍和80萬(wàn)倍下均未觀察到納米級(jí)孔洞（圖3），說明IPN-1D薄膜具有致密的表面結(jié)構(gòu)，也從側(cè)面說明PEG與PAL形成了均相結(jié)構(gòu)。

2.3.4?接觸角（θ）。

聚丙烯酸酯薄膜的接觸角均小于90°，說明這些薄膜表面都具有良好的親水性，而且PEG能有效改善PAL薄膜的親水性能。

3?結(jié)論與討論

聚丙烯酸酯薄膜控制煙堿體外釋放的速率會(huì)隨著薄膜厚度和PEG的不同而表現(xiàn)不同，比如PAL薄膜，厚度從40 μm到30 μm時(shí)，煙堿體外釋放速率從1.36 μg/（cm2·h）到2.03 μg/（cm2·h）不等。經(jīng)PEG改性后的PAL薄膜又表現(xiàn)出不同的控釋性能，比如厚度40 μm的 IPN-1D∶200薄膜對(duì)煙堿的體外釋放速率為1.60 μg/（cm2·h），厚度30 μm的IPN-1D∶4000薄膜對(duì)煙堿的體外釋放速率為5.15 μg/（cm2·h）。

該研究參考的國(guó)外幾款口含煙煙堿的體內(nèi)吸收速率為1.22～3.45 μg/（cm2·h）。該研究中開發(fā)的幾款聚合物薄膜對(duì)口含煙煙堿的體外釋放速率的范圍已基本覆蓋了體內(nèi)吸收速率的范圍。在今后的研究中，通過對(duì)這款國(guó)產(chǎn)口含煙的血液濃度的監(jiān)測(cè)，得到其體內(nèi)吸收速率，通過調(diào)節(jié)聚丙烯酸酯膜的成分和厚度等參數(shù)，得到與體內(nèi)吸收速率相匹配的體外釋放速率，再用篩選出的聚合物薄膜進(jìn)行口含煙的質(zhì)量控制和新配方的開發(fā)。這不僅會(huì)提高體內(nèi)和體外的相關(guān)性，而且會(huì)提高口含煙新工藝開發(fā)的效率。

目前已開發(fā)的模擬口腔的裝置[11-12]檢測(cè)的只是口含煙中煙堿的消耗量，不能代表煙堿體內(nèi)吸收的情況。而使用豬口腔黏膜模擬口含煙煙堿的體外吸收時(shí)，煙堿的體外滲透速率高達(dá)85.88 μg/（cm2·h）[13]，遠(yuǎn)高于煙堿的體內(nèi)吸收速率值。因此，用PEG改性后的PAL聚丙烯酸酯薄膜來模擬人口腔黏膜，提供了一種更接近口含煙煙堿體內(nèi)吸收情況的體外評(píng)價(jià)方法。

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