李宗平

（湖北省煙草科學(xué)研究院/中國(guó)煙草白肋煙試驗(yàn)站，武漢 430030）

不同雜交方式對(duì)白肋煙煙堿轉(zhuǎn)化率的影響

李宗平

（湖北省煙草科學(xué)研究院/中國(guó)煙草白肋煙試驗(yàn)站，武漢 430030）

采用白肋煙B37的高煙堿轉(zhuǎn)化品系（HC）和低轉(zhuǎn)化品系（LC）進(jìn)行正、反雜交試驗(yàn)，分析比較雙親與正、反交F1的煙堿、降煙堿含量及煙堿轉(zhuǎn)化率的平均值、群體分布頻率特點(diǎn)和雜種優(yōu)勢(shì)的大小。結(jié)果表明：低轉(zhuǎn)化材料作母本F1（正交）煙堿含量表現(xiàn)出24.58%的正向平均優(yōu)勢(shì)，降煙堿和煙堿轉(zhuǎn)化率則為49.79%和57.43%的負(fù)向平均優(yōu)勢(shì)；以高轉(zhuǎn)化率材料作母本，F(xiàn)1（反交）表現(xiàn)出同樣的趨勢(shì)，但雜種優(yōu)勢(shì)小于正交F1。為此認(rèn)為，雄性不育雜交一代優(yōu)勢(shì)利用是選育低煙堿轉(zhuǎn)化、低煙草特有亞硝胺（TSNA）含量新品種的有效方法，其中選擇純合的低煙堿轉(zhuǎn)化品系作雜交母本尤為主要。

白肋煙；正交；反交；生物堿；轉(zhuǎn)化率；雜種優(yōu)勢(shì)

煙草生物堿主要包括煙堿、降煙堿和微量的新煙堿和假木賊堿。降煙堿，亦稱(chēng)去甲基煙堿，可由煙堿脫甲基形成，正常情況下降煙堿含量不超過(guò)生物堿總含量的3.5%。由于降煙堿屬仲胺類(lèi)的降煙堿，在煙葉調(diào)制和陳化過(guò)程中代謝比較活躍，極易發(fā)生亞硝化反應(yīng)生成煙草特有亞硝胺（TSNA）中具有強(qiáng)致癌作用的N-亞硝基降煙堿（NNN），從而嚴(yán)重影響到煙葉的安全性和人類(lèi)健康。同時(shí)降煙堿還易于氧化、?；磻?yīng)生成麥斯明（α-氧基煙堿）和一系列的酰化降煙堿，直接改變煙葉和煙氣化學(xué)成分的組成和含量，對(duì)煙葉的香味品質(zhì)產(chǎn)生不利影響[1-3]。美國(guó)已將降煙堿作為考核新品種的主要指標(biāo)，并制定了降煙堿含量不超過(guò)總生物堿15%的標(biāo)準(zhǔn)[1，3]。普通煙草是純合雙隱性基因型（ctctcscs），不具有煙堿去甲基能力，但在栽培品種的煙株群體中，一些煙株往往會(huì)因?yàn)榛蛲蛔?，形成煙堿轉(zhuǎn)化能力，導(dǎo)致煙堿含量顯著降低，降煙堿含量大幅增加[3]。史宏志等[4]通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)不同煙草類(lèi)型降煙堿及煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化研究后認(rèn)為，白肋煙降煙堿含量及煙堿轉(zhuǎn)化率較高，問(wèn)題突出。史宏志等[5]、李進(jìn)平等[6]在對(duì)白肋煙鄂煙1號(hào)煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化的遺傳改良研究中發(fā)現(xiàn)，母本的MSB21和保持系B21的群體中都含有極高比例的轉(zhuǎn)化株，而作為父本的B37轉(zhuǎn)化株較少，認(rèn)為鄂煙1號(hào)的高轉(zhuǎn)化株比例主要由母本引起。本研究的目的在于通過(guò)相同親本進(jìn)行正反交測(cè)驗(yàn)，分析雜交親本對(duì)其F1生物堿及煙堿轉(zhuǎn)化率的影響，為以降低煙草特有亞硝胺（TSNA）含量為目標(biāo)的白肋煙新品種選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 P1：白肋煙B37 低煙堿轉(zhuǎn)化率品系（LC），P2：B37高煙堿轉(zhuǎn)化率品系（HC）。正交P1×P2（F1）和反交P2×P1（F1），共4份。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間試驗(yàn) 2011年對(duì)白肋煙B37原種群體進(jìn)行連續(xù)選擇4代的低煙堿轉(zhuǎn)化株（LC）和高煙堿株（HC）單株選擇，2014年在恩施煙草良種繁殖基地種植性狀穩(wěn)定的P1（LC）、P2（HC）材料，配制正交（P1×P2）、反交（P2×P1）雜交組合。2015年進(jìn)行P1、P2，及正、反交雜交F1等4份材料的田間試驗(yàn)，其中P1、P2各種植60株，取樣55株，正、反交雜交F1各種植30株，取樣20株。田間種植方法同白肋煙大面積生產(chǎn)。

1.2.2 轉(zhuǎn)化率誘導(dǎo)鑒定 煙株團(tuán)棵期取9~10葉位（由下至上）煙葉2片，樣品按H.Z.Shi等〔7〕的誘導(dǎo)方法進(jìn)行煙堿轉(zhuǎn)化率化學(xué)誘導(dǎo)。即摘取煙葉后，噴施2-氯乙基磷酸水溶液后保濕晾制，待煙葉變黃后，測(cè)定煙葉的煙堿和降煙堿含量。煙堿轉(zhuǎn)化能力用煙堿轉(zhuǎn)化率表示，即降煙堿含量占煙堿和降煙堿含量之和的百分比，可由下式計(jì)算。

煙堿轉(zhuǎn)化率（%）＝[降煙堿含量/（煙堿含量+降煙堿含量）]×100

根據(jù)煙堿轉(zhuǎn)化率將煙株分為非轉(zhuǎn)化株（煙堿轉(zhuǎn)化率低于3%）、低轉(zhuǎn)化株（煙堿轉(zhuǎn)化率3%~20%）、中轉(zhuǎn)化株（煙堿轉(zhuǎn)化率20%~50%）和高轉(zhuǎn)化株（煙堿轉(zhuǎn)化率大于50%）[3]。

1.2.3 生物堿測(cè)定 生物堿測(cè)定采用氣相色譜法。樣品經(jīng)烘干后粉碎，每樣品稱(chēng)取100mg，用三氯甲烷提取生物堿。氣相色譜儀為Agilent-6890，檢測(cè)器為FID，具體操作和參數(shù)設(shè)定按H.R.Burton等[8]的方法進(jìn)行。

1.2.4 雜種優(yōu)勢(shì)分析 雜種優(yōu)勢(shì)是指雜交一代的某些性狀優(yōu)于雙親的現(xiàn)象。分為平均優(yōu)勢(shì)和超親優(yōu)勢(shì)[9]。

平均優(yōu)勢(shì)，雜種一代（F1）超過(guò)雙親平均值（MP）的百分比。

超親優(yōu)勢(shì)，雜種一代（F1）超過(guò)其最好親本（HP）的百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 群體平均生物堿含量及煙堿轉(zhuǎn)化率比較 從表1可以看出，P1、P2的煙堿、降煙堿含量及煙堿轉(zhuǎn)化率存在較大差異，其中P1（B37LC）煙堿含量較高在17.08~24.92mg/g之間，降煙堿含量、煙堿轉(zhuǎn)化率較低，分別在1.02~1.55 mg/g和4.09%~6.68%之間；P2（B37HC）煙堿含量較低在1.33~12.57mg/g之間，降煙堿含量、煙堿轉(zhuǎn)化率較高，分別為6.66~ 15.55mg/g和41.51%~87.56%。正交F1煙堿含量較高為14.36~19.08mg/g，降煙堿含量、煙堿轉(zhuǎn)化率較低，分別為1.79~3.45 mg/g和9.33%~16.80%；反交F1煙堿含量在12.11~16.73mg/g之間，降煙堿含量、煙堿轉(zhuǎn)化率分別在3.35~5.20 mg/g和17.00%~ 29.08%之間；正交F1和反交F1的煙堿、降煙堿和煙堿轉(zhuǎn)化率均在P1和P2之間，但均偏向P1，且正交F1平均煙堿含量高于反交F1，而降煙堿、煙堿轉(zhuǎn)化率則反交F1高于正交F1（表2）。

表1 P1、P2生物堿含量及煙堿轉(zhuǎn)化率比較

表2 正、反交F1的生物堿含量及煙堿轉(zhuǎn)化率比較

2.2 分布頻率分析 進(jìn)一步分析煙株群體的煙堿、降煙堿含量及煙堿轉(zhuǎn)化率的分布頻率，結(jié)果如圖1~3所示。煙堿含量P1的頻率高峰在23mg/g位點(diǎn)，P2的在7mg/g，正交F1在19mg/g，反交F1在15mg/g；降煙堿則P1的頻率高峰在1.5mg/g，P2在12mg/g，正交F1在3.5mg/g，反交F1在5mg/g；P1的煙堿轉(zhuǎn)化率頻率高峰在4%；P2在70%；正交F1在15%；反交F1在25%。因此得知，正交F1和反交F1的煙堿、降煙堿和煙堿轉(zhuǎn)化率的頻率高峰位點(diǎn)均在P1、P2之間，但均向P1偏移，且以正交F1更明顯。

圖1 雙親及正反交F1群體煙堿分布頻率

圖2 雙親及正反交F1群體降煙堿分布頻率

圖3 雙親及正反交F1群體煙堿轉(zhuǎn)化率分布頻率

2.3 雜種優(yōu)勢(shì)分析 在前述平均值比較及分布頻率分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析正、反交F1的雜種優(yōu)勢(shì)大小。結(jié)果表明（表3）：正、反交F1的煙堿含量均存在正向的平均優(yōu)勢(shì)，且正交F1大于反交F1；而降煙堿含量、煙堿轉(zhuǎn)化率均表現(xiàn)為負(fù)向優(yōu)勢(shì)，尤以煙堿轉(zhuǎn)化率的負(fù)向優(yōu)勢(shì)更明顯，且正交F1優(yōu)勢(shì)的絕對(duì)值大于反交F1。煙堿、降煙堿及轉(zhuǎn)化率均無(wú)超親雜種優(yōu)勢(shì)。

表3 正、反交F1的雜種優(yōu)勢(shì)分析

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，不同煙堿轉(zhuǎn)化率類(lèi)型的品系雜交，雜交F1的煙堿、降煙堿含量及煙堿轉(zhuǎn)化率均大幅度偏離雙親平均值，其中煙堿含量表現(xiàn)出正向平均優(yōu)勢(shì)，降煙堿和煙堿轉(zhuǎn)化率則為負(fù)向平均優(yōu)勢(shì)。與筆者之前白肋煙生物堿和煙堿轉(zhuǎn)化率的配合力及遺傳力的研究結(jié)果[10]基本一致。

目前人們普遍認(rèn)為栽培品種煙堿含量由2對(duì)獨(dú)立的顯性Nic1Nic1Nic2Nic2基因控制，鮮葉煙堿含量一般較高，但晾制和陳化過(guò)程中由于存在煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化問(wèn)題，導(dǎo)致煙堿轉(zhuǎn)化為降煙堿。煙堿轉(zhuǎn)化由顯性CtCtCsCs基因控制，2個(gè)位點(diǎn)均為隱形基因型即ctctcscs不具備煙堿轉(zhuǎn)化能力[3-5]。由此推斷，同為栽培品種的不同煙堿轉(zhuǎn)化類(lèi)型品系的煙堿基因型均為Nic1Nic1Nic2Nic2，只是轉(zhuǎn)化率基因型不同，低轉(zhuǎn)化品系的轉(zhuǎn)化率基因型為ctctcscs，高轉(zhuǎn)化品系為CtCtCsCs，雜交F1的基因型應(yīng)是CtctCscs，性狀表現(xiàn)應(yīng)為顯性，即低煙堿、高降煙堿含量、高轉(zhuǎn)化率，煙堿含量低于雙親平均值為負(fù)向雜交優(yōu)勢(shì)，降煙堿和轉(zhuǎn)化率大于雙親平均值，具有正向雜種優(yōu)勢(shì)，這顯然不能解釋本研究結(jié)果。本研究中的材料為同一品種經(jīng)人為選擇后的不同轉(zhuǎn)化率類(lèi)型品系，遺傳背景除煙堿、降煙堿及轉(zhuǎn)化率外，其他性狀應(yīng)完全一致，從而排除了其他基因的連鎖與干擾，但煙堿、降煙堿及轉(zhuǎn)化率的煙株群體分布頻率結(jié)果表明，高轉(zhuǎn)化親本P2的轉(zhuǎn)化率在41.51%~87.56%之間，平均值62.77%，據(jù)前人研究結(jié)果 ctcs基因型的轉(zhuǎn)化率3%~9%，Ctcs基因型17%~51%，CtCs基因型73%~94%[3]推測(cè)，本研究中的P2可能尚屬雜合基因型，且Ctctcscs存在較大的比例，由于雜交F1基因型中ctctcscs的大量積累，從而導(dǎo)致降煙堿及轉(zhuǎn)化率的表現(xiàn)型產(chǎn)生負(fù)向雜種優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，在本研究中煙堿、降煙堿及轉(zhuǎn)化率均無(wú)超親雜種優(yōu)勢(shì)。由此推斷，一是白肋煙煙堿、降煙堿及轉(zhuǎn)化率的遺傳主要受微效多基因控制，且基因?qū)?shù)可能不止已知的2對(duì)，雜種優(yōu)勢(shì)的產(chǎn)生是隱性多基因累加的結(jié)果；二是在白肋煙雄性不育雜交一代優(yōu)勢(shì)利用過(guò)程中，P1是純合的低轉(zhuǎn)化率材料，P2只要不是純合的高轉(zhuǎn)化率材料，均可獲得轉(zhuǎn)化率低于雙親平均值的雜交F1；三是目前劃分非、低、中、高轉(zhuǎn)化株，特別是非和高轉(zhuǎn)化株的界定值的合理性有待進(jìn)一步商榷。

從原理上講，正交F1和反交F1的基因型應(yīng)該是完全一致的，但在本研究中發(fā)現(xiàn)正交F1的雜種優(yōu)勢(shì)大于反交F1的現(xiàn)象，初步推測(cè)可能與廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)中的各種功能酶有關(guān)，同時(shí)亦排除其他遺傳物質(zhì)參與的可能。

綜上所述認(rèn)為：在白肋煙新品種選育中，充分利用雜交F1具有較大的煙堿含量正向雜交優(yōu)勢(shì)、降煙堿和煙堿轉(zhuǎn)化率負(fù)向雜交優(yōu)勢(shì)的特點(diǎn)，是目前選育低煙堿轉(zhuǎn)化、低TSNA含量新品種的主要途徑和方法，其中選擇純合的低或非煙堿轉(zhuǎn)化品系作雜交母本尤為關(guān)鍵。

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2017-02-20）

湖北省煙草專(zhuān)賣(mài)局項(xiàng)目（027Y2011-055）