鄧漢超 劉玉琛 鄧國(guó)標(biāo)，4 劉 晉 陳惠芳 楊啟鵬 周向陽(yáng)

（1深圳市農(nóng)業(yè)科技促進(jìn)中心，深圳 518040；2農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（深圳），廣東深圳 518040；3深圳市作物分子育種研究院，深圳 518107；4廣東省龍門縣衛(wèi)生和計(jì)劃生育局，惠州 516800）

抗旱水稻種子轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)技術(shù)研究

鄧漢超1，2劉玉琛3鄧國(guó)標(biāo)3，4劉 晉1，2陳惠芳1，2楊啟鵬1，2周向陽(yáng)1，2

（1深圳市農(nóng)業(yè)科技促進(jìn)中心，深圳 518040；2農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（深圳），廣東深圳 518040；3深圳市作物分子育種研究院，深圳 518107；4廣東省龍門縣衛(wèi)生和計(jì)劃生育局，惠州 516800）

利用組織研磨儀快速處理水稻種子樣品，采用高通量的磁珠純化系統(tǒng)提取樣本DNA，提取的核酸通過紫外吸收檢測(cè)其純度，應(yīng)用普通PCR檢測(cè)方法和實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)水稻內(nèi)源基因SPS、靶基因ATAF1進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，普通PCR方法和實(shí)時(shí)熒光PCR方法均表現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、特異性高的特點(diǎn)。

普通PCR；實(shí)時(shí)熒光PCR；轉(zhuǎn)基因

轉(zhuǎn)基因作物的大量種植和推廣同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因生物的檢測(cè)技術(shù)提出要求，發(fā)達(dá)國(guó)家的轉(zhuǎn)基因及相關(guān)檢測(cè)技術(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過發(fā)展中的國(guó)家。美國(guó)、加拿大等國(guó)已有近百種轉(zhuǎn)基因食品上市，并且他們的目標(biāo)是把大量的轉(zhuǎn)基因食品出口到發(fā)展中國(guó)家[1-3]。在這些正式獲批進(jìn)行生產(chǎn)和貿(mào)易的產(chǎn)品之外，更有數(shù)目眾多的品種處于試驗(yàn)階段或未經(jīng)正常手續(xù)進(jìn)入市場(chǎng)，我國(guó)已經(jīng)加入WTO，正在面臨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品貿(mào)易和安全監(jiān)測(cè)的挑戰(zhàn)。同時(shí)隨著商品化轉(zhuǎn)基因生物的種類不斷增加，轉(zhuǎn)基因生物本身的安全性以及它們對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境的潛在威脅成為國(guó)際社會(huì)和廣大民眾廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一[4-6]；包括我國(guó)在內(nèi)的越來越多的國(guó)家制定并實(shí)施了轉(zhuǎn)基因食品的強(qiáng)制標(biāo)識(shí)制度。因此，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的科學(xué)管理和應(yīng)用需要得到轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及其成分檢測(cè)技術(shù)的支持。追蹤轉(zhuǎn)基因生物研發(fā)動(dòng)態(tài)，研發(fā)相適應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)，制定相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，是轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管的重要措施。本文以轉(zhuǎn)抗旱基因ATAF1水稻種子為材料，初步建立外源基因的普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)室獲得的轉(zhuǎn)ATAF1基因水稻70株，種子保存于本實(shí)驗(yàn)室種子低溫低濕儲(chǔ)藏庫(kù)中備用。

主要儀器和試劑：MP組織研磨儀（24樣）、Themo磁珠核酸自動(dòng)提取純化儀（96樣）、Omega核酸提取試劑盒、Premix Ex Taq酶、Neno1000紫外分光光度計(jì)、BIO-RAD iCycler PCR擴(kuò)增儀、ABI7500實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀、RAININ edp3 plus排槍（12通道）等。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 水稻種子取5粒，置于2mL離心管中，放入1粒陶瓷珠，加入500μ L Buffer SLX Minus裂解液（Omega 核酸提取試劑盒）或500μL 2% CTAB 裂解液，浸泡數(shù)小時(shí)后采用MP組織研磨儀設(shè)置震蕩速度4.0 M/s、震蕩時(shí)間30s，震蕩粉碎5~6次，備用。

1.2.2 DNA的提取 磁珠自動(dòng)提取法：粉碎樣品在65℃水浴1h，其間上下顛倒2~3次。12000r/min離心10min。取上清200μ L于深孔96平板、800μL Buffer PHB于深孔96平板、800深孔96平板、100深孔96平板、一個(gè)Tip按照表1依次加入Omega 核酸提取試劑盒中的試劑。啟動(dòng)Themo磁珠核酸自動(dòng)提取純化系統(tǒng)，根據(jù)系統(tǒng)提示依次放入上述試劑板。當(dāng)DNA提取完畢，取出5號(hào)板，將DNA保存在-20℃下備用。

表1 磁珠核酸自動(dòng)提取純化系統(tǒng)物品

1.2.3 核酸濃度及純度測(cè)定 采用Neno1000紫外分光光度法測(cè)定所提取的核酸的純度和濃度。

1.2.4 引物設(shè)計(jì) 水稻內(nèi)源基因SPS基因引物設(shè)計(jì)分別參考文獻(xiàn)[7]。F：5′-ttgcgcctgaacggatat-3′，R：5′-ggagaagcactggacgagg-3′，產(chǎn)物大小277bp；ATAF1引物F：5′-TAGCCCTGCCTTCATACGCT-3′，R：5′-CGGCAGAGAACCCAATCATC-3′，產(chǎn)物大小580bp。特異性引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.5 PCR擴(kuò)增檢測(cè) 普通PCR反應(yīng)體系：20μ L反應(yīng)液中含有10μ L Primex Ex Taq，0.4μ L Forward primer（10μmol/L），0.4μ L Reverse primer（10μ mol/L），2μ L模板DNA（10~50 ng/μ L），補(bǔ)ddH2O至20μ L。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 40s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸 2min；15℃ 2min。取PCR產(chǎn)物5μ L加1μ L點(diǎn)樣液混合后點(diǎn)入上樣孔，于90V電壓電泳30~40min。電泳結(jié)束后，采用自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)。

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系：20μ L反應(yīng)液中含有10μ L BIO-RAD Supermix with low ROX，0.4μ L Forward primer（10μ mol/L），0.4μ L Reverse primer（10μ mol/L），2μ L模板DNA（10~50ng/μ L），補(bǔ)ddH2O至20μ L。反應(yīng)條件：95℃ 10s；95℃ 5s，60℃ 34s，40個(gè)循環(huán)；15℃ 2min。

2 結(jié)果與分析

2.1 核酸質(zhì)量檢測(cè)

2.1.1 紫外吸收檢測(cè) 提取的水稻種子DNA通過Neno1000紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，均有明顯的OD260檢測(cè)峰，OD260/OD280均在1.8~2.1之間，濃度在10~100ng/μ L之間，提取核酸能滿足PCR需求。

2.1.2 內(nèi)源基因PCR電泳檢測(cè) 以水稻內(nèi)源基因SPS為參照基因?qū)悠稤NA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，70個(gè)樣品均能擴(kuò)增出明顯的277bp大小條帶，并且陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照均正常。

2.1.3 內(nèi)源基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè) 隨機(jī)挑取部分水稻種子樣品對(duì)內(nèi)源基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，各樣品檢測(cè)閾值和Tm值見表2，從結(jié)果可知，所有檢測(cè)樣品在實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)中均有抬頭，檢測(cè)閾值在24~30之間，樣品溶解曲線均在同一個(gè)位置有高峰，樣品Tm值為88.8。

圖1 樣品SPS基因擴(kuò)增凝膠電泳分析結(jié)果

表2 部分樣品SPS基因EvaGreen熒光檢測(cè)閾值和Tm值

2.2 目的基因ATAF1檢測(cè)

2.2.1 ATAF1基因PCR電泳檢測(cè) 以外源ATAF1基因?qū)悠稤NA進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，70個(gè)樣品部分樣品能檢測(cè)到明顯的580bp大小條帶，并且陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照均正常。

圖2 樣品ATAF1基因擴(kuò)增凝膠電泳分析結(jié)果

2.2.2 ATAF1基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè) 對(duì)隨機(jī)挑取的部分水稻種子樣品同時(shí)進(jìn)行ATAF1基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)，從結(jié)果可知，所有檢測(cè)樣品在實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)中均有抬頭，其中部分檢測(cè)閾值在16~22之間，部分大于34（表3），樣品溶解曲線均在同一個(gè)位置有高峰，樣品Tm值為85.2/84.8。

表3 部分樣品ATAF1基因EvaGreen熒光檢測(cè)閾值和Tm值

3 結(jié)論與討論

本研究采用磁珠自動(dòng)提取法大規(guī)模地提取水稻種子的DNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量，結(jié)果表明大部分提取的DNA濃度（大于10ng/μL）和純度（OD260/OD280在1.8~2.1之間）均滿足一般要求，而部分樣品的濃度和純度未落在上述范圍內(nèi)，濃度僅有2~3ng/μL，OD260/OD280有的小于1或大于2.5。同時(shí)利用內(nèi)源基因檢測(cè)方法檢測(cè)提取DNA質(zhì)量時(shí)，這部分樣品DNA均能非常清晰地檢測(cè)到內(nèi)源條帶。因此在PCR擴(kuò)增檢測(cè)中，評(píng)價(jià)提取DNA的質(zhì)量不單單僅考慮紫外吸收檢測(cè)的結(jié)果，同時(shí)結(jié)合內(nèi)源基因檢測(cè)信息，更好地保證PCR擴(kuò)增所需DNA的質(zhì)量。

通過設(shè)計(jì)外源ATAF1基因引物對(duì)研發(fā)中的轉(zhuǎn)基因水稻種子進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，初步建立普通PCR篩選檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分的方法。同時(shí)挑選部分樣品初步研究實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，以EvaGreen作為熒光染料，對(duì)內(nèi)源基因和外源基因進(jìn)行實(shí)時(shí)擴(kuò)增，結(jié)果與普通PCR檢測(cè)基本一致，在外源基因檢測(cè)上，實(shí)時(shí)熒光PCR具有更高的靈敏度，如表2中Ct值＞34的樣品在實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)中能看到擴(kuò)增曲線有抬頭，但是在普通PCR電泳檢測(cè)方法上未能見到條帶，說明這些樣品的轉(zhuǎn)基因成分含量很低，普通PCR未能檢測(cè)到，而用實(shí)時(shí)熒光PCR方法能檢測(cè)較為微量的成分。

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2017-02-21）

轉(zhuǎn)基因新品種培育重大專項(xiàng)（2009ZX08001－023B）；深圳市技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目（CXZZ20120614165508810）

劉晉