何林楓，李燕濤，李誠(chéng)，曾珍，李?yuàn)檴?，劉韞滔，胡濱，劉愛平，王彩霞

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014)

干酪素又名乳酪素、酪素或酪蛋白，是一種性能獨(dú)特的天然蛋白類基礎(chǔ)原料，可以作為食品添加劑或品質(zhì)改良劑廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、輕工等領(lǐng)域[1]。國(guó)外干酪素的生產(chǎn)原料主要是鮮乳，但國(guó)內(nèi)由于乳源不足，用鮮乳生產(chǎn)干酪素相對(duì)較少[2]。目前，我國(guó)干酪素生產(chǎn)的主要原料是來自藏族地區(qū)的“曲拉”，“曲拉”(藏語，指奶干渣)是牧民將牦牛乳提取酥油后進(jìn)行凝固沉淀，再經(jīng)過自然發(fā)酵、風(fēng)干而成的蛋白質(zhì)含量豐富的產(chǎn)品，因其價(jià)格低廉、來源方便，是制備干酪素的理想原料[3]。與酸法生產(chǎn)的干酪素相比，酶法干酪素具有持久的乳香味和良好的凝膠性，還具有較好的染色附著力，用途較廣泛[4-5]。小牛皺胃酶是最常用的凝乳酶，用其生產(chǎn)的干酪素出品率較高、品質(zhì)較好，但我國(guó)小牛皺胃酶的生產(chǎn)還沒有實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，目前主要依靠國(guó)外進(jìn)口，單純依靠屠宰小牛提取凝乳酶無法滿足市場(chǎng)的需要[6]。

目前以曲拉為原料，利用酸法生產(chǎn)干酪素已有大量報(bào)道[7-8]，但采用凝乳酶制備食品級(jí)干酪素的報(bào)道依然相對(duì)較少。凝乳酶干酪素制備過程中，由于單一酶的凝乳效果有限，本實(shí)驗(yàn)擬采用混合酶進(jìn)行凝乳試驗(yàn)，但不同酶的混合比例是研究的難點(diǎn)?；炝显O(shè)計(jì)是一種特殊的回歸設(shè)計(jì)，是研究混合料中不同組分比例變化對(duì)得率影響的一種有效方法，通過對(duì)多項(xiàng)式方程的回歸分析，來預(yù)測(cè)混合料組分的最佳比例，現(xiàn)已在多學(xué)科領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)以曲拉為原料，采用胃蛋白酶、木瓜凝乳酶和酵母凝乳酶復(fù)配成混合凝乳酶，首先采用單因素實(shí)驗(yàn)研究混合凝乳酶添加量、凝乳pH、凝乳溫度、凝乳時(shí)間和CaCl2添加量對(duì)出品率的影響，再通過混料設(shè)計(jì)優(yōu)化混合凝乳酶中不同凝乳酶的組成比例，并對(duì)干酪素的理化性質(zhì)、紅外光譜特性、熱力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，以期為凝乳酶干酪素開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

曲拉，四川甘孜藏族自治州瀘定縣；小牛皺胃酶(酶活≥20 000 U/g)，美國(guó)Sigma-Aldrich科技公司；胃蛋白酶(酶活≥800 000 U/g)，上海瑞永生物科技有限公司；木瓜凝乳酶(酶活≥20 000 U/g)，廣西龐博生物工程有限公司；酵母凝乳酶(酶活≥60 000 U/g)，DSM有限公司。

NaOH、HCl、CaCl2、KBr等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S恒溫水浴鍋，上海力辰科技有限公司；PHS-3C pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；KDN-1全自動(dòng)凱氏定氮儀，上海雷磁科技有限公司；DHG-9245A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；KH19A臺(tái)式通用高速離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；NicoletIS10傅里葉變換紅外光譜儀，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，Q200MDSC差示掃描量熱儀，美國(guó)TA儀器(沃特世科技(上海)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小牛皺胃酶干酪素的制備工藝

小牛皺胃酶干酪素的制備工藝參考韓玲等[10]的方法進(jìn)行。

1.3.2 混合凝乳酶干酪素的制備工藝

1.3.2.1 工藝流程

參考韓玲等[10]和常海軍等[11]的方法，確定牦?！扒备衫宜毓に嚵鞒虨椋?/p>

原料粉碎→堿液溶解→過濾→離心分離→巴氏殺菌→冷卻→凝乳→洗滌→烘干→成品

1.3.2.2 操作要點(diǎn)

溶解：將曲拉粉粹后與水以1∶11體積比混合，置于65 ℃的水浴鍋中攪拌溶解，同時(shí)緩慢滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16% NaOH溶液，直至曲拉全部溶解；攪拌30 min后用100目濾布過濾，除去機(jī)械雜質(zhì)。

離心：將濾液加熱到45 ℃，以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心，除去脂肪以及雜質(zhì)。

凝乳：按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求調(diào)整濾液pH值、溫度，加入酶和CaCl2，并適當(dāng)攪拌，使干酪素充分凝集沉淀。

脫水造粒：將200目濾布過濾得到的凝固物，用水洗滌3次，壓榨脫水后，加壓使水分充分?jǐn)D出，揉搓造粒。

干燥：在42 ℃條件下于恒溫干燥箱中干燥30 min，所得粉末即為成品。

出品率按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.3.2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1)單因素實(shí)驗(yàn)

以出品率為指標(biāo)，首先研究不同種類酶(胃蛋白酶、木瓜凝乳酶和酵母凝乳酶)對(duì)出品率的影響；再研究混合凝乳酶(設(shè)定胃蛋白酶∶木瓜凝乳酶∶酵母凝乳酶的質(zhì)量比為0.33∶0.33∶0.33，3種酶比例之和為1)在不同凝乳時(shí)間、溫度、酶添加量和CaCl2添加量條件下對(duì)出品率的影響，以確定混合凝乳酶的最優(yōu)酶凝條件，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

酶的種類：在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，研究不同種類酶對(duì)出品率的影響。具體酶凝條件為：添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的胃蛋白酶、pH 6.0、30 min、40 ℃、添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CaCl2；添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%木瓜凝乳酶、pH 6.0、30 min、40 ℃、添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CaCl2；添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的酵母凝乳酶、pH 5.5、30 min、50 ℃、添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CaCl2。

凝乳時(shí)間：在pH 6.0、40 ℃、添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的混合酶、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CaCl2，研究凝乳時(shí)間對(duì)出品率的影響。

凝乳溫度：在pH 6.0、30 min、添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的混合酶、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CaCl2，研究凝乳溫度對(duì)出品率的影響。

凝乳pH：在凝乳時(shí)間30 min、45 ℃、添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的混合酶、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CaCl2，研究凝乳pH對(duì)出品率的影響。

凝乳酶添加量：在pH 6.3、30 min、45 ℃、添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CaCl2，研究混合凝乳酶添加量對(duì)出品率的影響。

CaCl2添加量：在pH 6.3、30 min、45 ℃、添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的混合酶條件下，研究CaCl2添加量對(duì)出品率的影響。

(2)混料設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，按照Design-Expert軟件(11.0版)有“上下限制約束”的混料設(shè)計(jì)，對(duì)混合凝乳酶中胃蛋白酶、木瓜凝乳酶、酵母凝乳酶的不同混合比例進(jìn)行優(yōu)化，以確定3種酶的適宜配比，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

在混合物設(shè)計(jì)中，實(shí)驗(yàn)條件必須滿足約束條件，其中Xi表示第i分量的分?jǐn)?shù)，0≤Xi≤1,i=1, 2, …, q。在這項(xiàng)研究中，混合酶由A(胃蛋白酶)、B(木瓜凝乳酶)和C(酵母凝乳酶)組成?；旌厦傅奶砑恿恳浴扒痹系馁|(zhì)量百分比為基礎(chǔ)，混合酶的總和等于100%。按照“上下限制約束”混料進(jìn)行條件設(shè)置，即0

1.3.3 常規(guī)理化指標(biāo)檢測(cè)

干酪素中蛋白質(zhì)、酪蛋白、脂肪、水分的測(cè)定，按照GB31638—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 酪蛋白》進(jìn)行。

1.3.4 紅外光譜分析

紅外光譜分析采用KBr片涂布法進(jìn)行，取2.0 mg凝乳酶干酪素與一定量預(yù)先干燥的KBr混合后經(jīng)均勻研細(xì)，再置于模具中，用油壓機(jī)上壓成透明薄片；然后用紅外光譜儀在400～4 000 cm-1、分辨率為4 cm-1、掃描次數(shù)32次條件下進(jìn)行掃描。

1.3.5 差示掃描量熱分析

參考WEE 等[12]的方法，對(duì)凝乳酶干酪素進(jìn)行差示掃描量熱分析(differential scanning calorimetry，DSC)。取樣品10.0 mg裝入專用鋁坩堝中，加蓋密封后放入樣品室內(nèi)，用空坩堝作空白對(duì)照，DSC分析在高純N2保護(hù)下進(jìn)行。具體條件為在20 ℃保持3 min，以10 ℃/min的速率升至190 ℃，N2速率是50 mL/min，記錄其熱力學(xué)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 酶的種類對(duì)出品率的影響

由圖1可知，以小牛皺胃酶作為對(duì)照，在相同的酶添加量條件下，不同酶在各自較適宜凝乳條件下對(duì)出品率的影響較大。盡管胃蛋白酶的出品率高于木瓜凝乳酶和酵母凝乳酶，但3種酶的出品率均較低。LUCEY等[13]認(rèn)為，凝乳酶干酪素制備中最重要的環(huán)節(jié)就是酶促進(jìn)蛋白的凝結(jié)過程，由于選用凝乳酶種類不同，其凝乳特性和蛋白水解特性會(huì)有所差異，從而影響干酪素的出品率。YAN等[14]也認(rèn)為，凝乳酶通常都是酸性蛋白酶，具有一定的蛋白水解活性，在凝乳過程要防止蛋白的過度水解。因此，胃蛋白酶、木瓜凝乳酶和酵母凝乳酶制備的干酪素出品率都偏低，可能與酪蛋白被其水解有關(guān)。由于不同蛋白酶之間存在相互抑制作用，而且3種酶都是酸性蛋白酶，因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中考慮將3種酶按適宜比例混合進(jìn)行凝乳以提高出品率。

圖1 不同種類酶對(duì)出品率的影響

圖2 凝乳時(shí)間對(duì)出品率的影響

2.1.2 凝乳時(shí)間對(duì)出品率的影響

在pH 6.0、40 ℃、混合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%條件下，研究凝乳時(shí)間對(duì)出品率的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，凝乳時(shí)間在20～30 min時(shí)，隨著凝乳時(shí)間延長(zhǎng)，出品率快速上升；在凝乳時(shí)間為30 min時(shí)達(dá)到最高，但凝乳時(shí)間超過30 min后，出品率隨著凝乳時(shí)間延長(zhǎng)而下降。這是因?yàn)槟闀r(shí)間較短，酪蛋白凝固不充分，出品率相對(duì)較低；而混合酶本身是蛋白酶，凝乳時(shí)間太長(zhǎng)，混合酶可能會(huì)對(duì)酪蛋白進(jìn)行降解，導(dǎo)致出品率下降[15]。HAROUN等[16]以駱駝乳和牛乳為原料，利用駱駝胃蛋白酶制備干酪素時(shí)證實(shí)，凝乳時(shí)間太長(zhǎng)，蛋白酶的凝結(jié)作用下降，水解蛋白質(zhì)的能力會(huì)增強(qiáng)，導(dǎo)致出品率降低。因此，本試驗(yàn)適宜凝乳時(shí)間為30 min。

2.1.3 凝乳溫度對(duì)出品率的影響

在pH 6.0、30 min、混合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%條件下，研究凝乳溫度對(duì)出品率的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，凝乳溫度在35～45 ℃，出品率隨著溫度上升而增加；在凝乳溫度為45 ℃時(shí)，出品率最高；當(dāng)溫度超過45 ℃時(shí)，出品率隨著溫度上升而下降。通常溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響有兩方面，一方面是在一定溫度范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)溫度上升，單位時(shí)間內(nèi)酶與底物分子間接觸頻率增加，酶促反應(yīng)速度加快；另一方面是由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，反應(yīng)溫度過高，酶蛋白發(fā)生變性，其活性減弱從而降低酶促反應(yīng)速度，導(dǎo)致出品率下降。酶促反應(yīng)的最適溫度就是這2個(gè)過程平衡的結(jié)果。張衛(wèi)兵等[17]以新鮮牛乳為原料，采用細(xì)菌凝乳酶作制備干酪素時(shí)也發(fā)現(xiàn)，隨著溫度升高干酪素得率先上升后下降，與本研究結(jié)果類似。因此，本試驗(yàn)適宜酶解溫度為45 ℃。

圖3 凝乳溫度對(duì)出品率的影響

圖4 凝乳pH對(duì)出品率的影響

2.1.4 凝乳pH對(duì)出品率的影響

在凝乳時(shí)間30 min、45 ℃、混合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%條件下，研究凝乳pH對(duì)出品率的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，在pH 5.4～6.3，出品率隨著凝乳pH的升高而增加；在pH 6.3時(shí)出品率最高；當(dāng)pH超過6.3時(shí)，出品率隨pH升高而下降。這可能與混合酶的最適酶解pH有關(guān)，過高或過低的pH都會(huì)對(duì)酶的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，甚至使酶變性而失活，從而導(dǎo)致凝乳效果下降。而適宜的pH可以促進(jìn)酶和底物之間的結(jié)合，改善凝乳效果，從而提高干酪素的出品率[18]。紀(jì)銀莉等[19]在以“曲拉”為原料，采用微小毛霉凝乳酶為凝乳劑制備干酪素時(shí)也認(rèn)為，凝乳pH直接影響凝乳酶的活力，過低或過高的pH都會(huì)對(duì)凝乳酶活性有抑制作用，影響出品率。因此，本試驗(yàn)適宜凝乳pH為6.3。

2.1.5 混合凝乳酶添加量對(duì)出品率的影響

在pH 6.3、30 min、45 ℃、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的條件下，研究混合凝乳酶添加量對(duì)出品率的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，酶添加量在0.4%～1%，隨著凝乳酶添加量的增加，干酪素出品率呈上升趨勢(shì)；酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1%時(shí)，出品率達(dá)到最高值；當(dāng)酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過1%以后，繼續(xù)增加酶添加量，出品率則降低。HSIEH等[20]研究認(rèn)為凝乳酶主要是通過水解κ-酪蛋白中的Phe105-Met106的肽鍵，生成κ-酪蛋白巨肽和副κ-酪蛋白；當(dāng)大量κ-酪蛋白被水解時(shí)，通過Ca2+的作用，使副κ-酪蛋白發(fā)生聚集形成三維網(wǎng)狀凝膠。因此凝乳酶添加量較少時(shí)，κ-酪蛋白水解不充分，凝乳緩慢，出品率較低。當(dāng)酶濃度過高，凝乳速度加快，但形成的凝塊彈性較差、易碎，水洗時(shí)容易造成損失。此外，酶濃度過高，酪蛋白容易被徹底水解為多肽和氨基酸，導(dǎo)致干酪素出品率降低。HORNE等[21]認(rèn)為，凝乳酶的本質(zhì)是蛋白酶，添加過量會(huì)對(duì)底物蛋白產(chǎn)生水解作用，凝乳酶的添加應(yīng)充分考慮凝乳酶的凝固作用，避免水解酪蛋白。李學(xué)朋等[22]在用米黑毛霉制備酶凝干酪素時(shí)證實(shí)，酶添加量對(duì)干酪素的出品率影響較大，與本研究結(jié)果類似。因此，本試驗(yàn)適宜添加凝乳酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。

圖5 凝乳酶添加量對(duì)出品率的影響

圖6 CaCl2添加量對(duì)出品率的影響

2.1.6 CaCl2添加量對(duì)出品率的影響

在pH 6.3、30 min、45 ℃、混合凝乳酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%條件下，研究CaCl2添加量對(duì)出品率的影響，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，在添加CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%～1%，隨著CaCl2添加量的增加，干酪素出品率增加；CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，出品率最高；繼續(xù)添加CaCl2，出品率變化不大。通常Ca2+通過增強(qiáng)靜電吸附作用，在副酪蛋白分子間形成“鈣橋”以促進(jìn)酪蛋白膠體完成凝聚過程[23]。當(dāng)Ca2+濃度較低時(shí)，鈣橋形成不完全，影響凝乳效果。因此隨著Ca2+的添加，出品率增加。SMIALOWSKA等[24]研究認(rèn)為Ca2+不僅參與乳的凝固過程，而且還能穩(wěn)定凝乳酶的三維結(jié)構(gòu)，保護(hù)酶凝乳活性，使凝乳速度加快。當(dāng)Ca2+濃度超過一定量時(shí)，對(duì)凝乳效果影響不大。因此，本試驗(yàn)適宜的添加CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。

2.2 混料試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 混料試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?/p>

通過Design-expert 11.0軟件中混料試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以胃蛋白酶添加比例(A)、木瓜凝乳酶添加比例(B)和酵母凝乳酶添加比例(C)為自變量，以出品率(Y)為響應(yīng)值，將3種酶百分含量分別限定在0.1≤A<1，0.1≤B<1，0.1≤C<1范圍內(nèi)，且A+B+C=1(100%)。經(jīng)過軟件自動(dòng)優(yōu)化處理后，約束條件分別被修訂為0.1≤A≤0.8、0.1≤B≤0.8和0.1≤C≤0.8，生成各因素的試驗(yàn)方案進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

表1 混料設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果

通過軟件對(duì)表1的數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化分析，得到Y(jié)與A、B和C之間回歸方程模型如下：

Y=68.25A+40.41B+44.58C+15.96AB+34.85AC+7.26BC+211.54ABC+107.87(A-B)+100.95(A-C)-74.30(B-C)

2.2.2 混料試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷娘@著性檢驗(yàn)

對(duì)混料設(shè)計(jì)得到的回歸方程模型進(jìn)行方差分析，對(duì)模型系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

表2 回歸方程方差分析結(jié)果

注：P<0.05表示差異顯著，標(biāo)注為*;P<0.01表示差異極顯著，標(biāo)注為**

由表3可知，該回歸方程模型極顯著(P<0.01)，說明該回歸方程的因變量與自變量之間的相關(guān)關(guān)系顯著，其中A、B、C、AB、AC、BC、ABC、A-B、A-C、B-C對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)，表明各個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是二次拋物線關(guān)系。失擬項(xiàng)檢測(cè)不顯著(P>0.05)，表明該方程對(duì)試驗(yàn)的擬合情況好，誤差小，可以用該方程對(duì)不同條件下的提取效果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。由表3可知，ABC三因素間存在交互作用，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著(P<0.01)。3種酶交互作用的等高線圖和響應(yīng)面圖如圖7所示。

a-等高線圖;b-響應(yīng)面圖

由圖7可知，而當(dāng)胃蛋白酶用量較高，木瓜凝乳酶和酵母凝乳酶用量較少時(shí)，出品率較高，為75%左右。當(dāng)木瓜凝乳酶用量較高，胃蛋白酶和酵母凝乳酶用量較少，或酵母凝乳酶用量較高，胃蛋白酶和木瓜凝乳酶用量較少時(shí)，出品率約為45%，可見3種酶以不同比例混合對(duì)出品率影響顯著。KRUIF等[25]認(rèn)為，酶凝干酪素出品率的差異主要與酶對(duì)酪蛋白的凝結(jié)特性和分解活性的差異有關(guān)，凝乳酶凝結(jié)性強(qiáng)，分解性弱，則出品率較高。HUPPERTZ等[26]和JACOB等[27]認(rèn)為，混合酶制備干酪素的核心是如何確定不同凝乳酶的比例，而凝乳酶干酪素凝膠是一種蛋白質(zhì)凝膠，其形成主要是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子的聚集作用，同時(shí)也是變性的蛋白質(zhì)分子間吸附和水解相平衡的結(jié)果。本研究表明3種酶在凝乳過程中，胃蛋白酶起到了主導(dǎo)作用，而胃蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的分解作用可能被木瓜凝乳酶和酵母凝乳酶抑制。由于木瓜凝乳酶和酵母凝乳酶同樣具有凝乳活性，但是其對(duì)蛋白質(zhì)的降解能力更強(qiáng)。而胃蛋白酶的使用能夠?qū)δ竟夏槊负徒湍改槊附到獾鞍踪|(zhì)的能力產(chǎn)生抑制，因此木瓜凝乳酶和酵母凝乳酶對(duì)出品率同樣有所貢獻(xiàn)。由于圖7中的響應(yīng)面圖出現(xiàn)了曲面，表明3種酶之間存在交互作用。因此在凝乳過程中，將3種酶按照適宜配比后組成的混合酶系對(duì)凝乳酶干酪素的制備可產(chǎn)生協(xié)同作用，顯著提高出品率。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過Design expert 11.0軟件對(duì)模型方程進(jìn)行求解，得出理想的混合酶配比為m(胃蛋白酶)∶m(木瓜凝乳酶)∶m(酵母凝乳酶)=0.60∶0.18∶0.22，即胃蛋白酶添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%、木瓜凝乳酶添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%及酵母凝乳酶添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)22%，此時(shí)理論出品率為81.77%。為了驗(yàn)證該配比的可靠性，通過3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的出品率平均值為(80.35±0.62)%，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合。這也表明將胃蛋白酶、木瓜凝乳酶和酵母凝乳酶按比例混合后進(jìn)行凝乳酶干酪素的制備，其出品率明顯高于單一酶的出品率。

2.3 理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果與分析

將本實(shí)驗(yàn)獲得的凝乳酶干酪素和小牛皺胃酶干酪素進(jìn)行理化指標(biāo)檢測(cè)，結(jié)果如表3所示。

表3 產(chǎn)品理化指標(biāo)檢測(cè) 單位：g/100g

由表3可知，本實(shí)驗(yàn)獲得的凝乳酶干酪素的蛋白質(zhì)、酪蛋白、脂肪、水分等指標(biāo)與小牛皺胃酶干酪素差異不顯著(P>0.05)，而且均符合GB31638—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 酪蛋白》的要求，這表明本實(shí)驗(yàn)獲得的凝乳酶干酪素質(zhì)量較好，具有開發(fā)前景。

2.4 紅外光譜分析

將小牛皺胃酶制備的干酪素和混合酶制備的干酪素用傅立葉變換紅外光譜儀進(jìn)行官能團(tuán)檢測(cè)分析，結(jié)果如圖8所示。

a-混合酶；b-小牛皺胃酶

2.5 DSC分析

將小牛皺胃酶制備的干酪素和混合酶制備的干酪素采用差示掃描量熱儀進(jìn)行熱力學(xué)分析，結(jié)果如圖9所示。

a-混合酶;b-小牛皺胃酶

由于加熱能夠使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而導(dǎo)致其功能受到影響，因此研究食品蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性對(duì)于蛋白質(zhì)的合理利用具有重要意義。對(duì)于DSC而言，在熱分析圖譜上出現(xiàn)吸熱峰可以表示該點(diǎn)處在蛋白質(zhì)熱變性溫度區(qū)，而且這個(gè)峰值對(duì)應(yīng)的溫度即為該樣品的熱變性溫度[29]。由圖9可知，2種方法制備干酪素的變性焓值(ΔH)也很接近，分別為165.1和165.5 J/g，表明2種方法制備干酪素在變性時(shí)吸入的熱量相似。熱分析曲線在123 ℃附近均出現(xiàn)1個(gè)主要的吸熱峰，這可能是干酪素的變性溫度。由于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)變性溫度的高低密切相關(guān)，變性溫度越高標(biāo)志蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性越好。因此，干酪素具有相對(duì)較好的熱穩(wěn)定性。此外，2種方法制備的干酪素的熱分析曲線形狀和峰型均相似，表明酶法制備干酪素的工藝沒有對(duì)其熱力學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生影響。

3 結(jié)論

以牦牛“曲拉”為原料，通過單因素試驗(yàn)和混料設(shè)計(jì)，確定了混合酶法制備干酪素的最優(yōu)工藝條件為：添加混合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%(其中胃蛋白酶∶木瓜凝乳酶∶酵母凝乳酶的質(zhì)量比為0.60∶0.18∶0.22)，在pH 6.3、溫度45 ℃、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%條件下，凝乳30 min，出品率為(80.35±0.62)%，通過驗(yàn)證試驗(yàn)，證實(shí)了該工藝具有可靠性。

通過對(duì)本實(shí)驗(yàn)獲得干酪素與小牛皺胃酶干酪素進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果表明，混合酶法制備干酪素的理化性質(zhì)、紅外光譜特性和熱力學(xué)性質(zhì)與小牛皺胃酶干酪素差異不顯著，而且符合GB31638—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 酪蛋白》的要求，這表明本實(shí)驗(yàn)獲得的凝乳酶干酪素質(zhì)量較好，具有開發(fā)價(jià)值。

因此，采用混料設(shè)計(jì)優(yōu)化混合酶制備干酪素，所需工藝設(shè)備簡(jiǎn)單、提取條件溫和、操作安全，可為凝乳酶干酪素的生產(chǎn)提供參考。