徐迎春 朱曦芮

摘 要：為確定中山杉適宜栽植區(qū)及雜交育種選擇耐寒親本，以中山杉302、118、401、405、149、402、406為試驗(yàn)材料，對(duì)其萌芽前的枝條分別采用-8℃、-12℃、16℃、-20℃、-24℃、-28℃、-32℃的低溫脅迫處理，根據(jù)細(xì)胞膜透性的變化配合Logistic方程，求得半致死溫度（LT50）。結(jié)果表明，不同低溫處理下，各品種枝條的相對(duì)電導(dǎo)率和細(xì)胞膜傷害率的增加呈“S”形曲線，與相應(yīng)的低溫呈極顯著負(fù)相關(guān);7個(gè)中山杉品種的低溫半致死溫度分別為-18.7℃（302）、-20.5℃（118）、-22.9℃（401）、-21.5℃（405）、-19.9℃（149）、-21.8℃（402）、-26.9℃（406）。中山杉406的耐寒性最強(qiáng)，中山杉401的耐寒性較強(qiáng)，中山杉302的耐寒性最弱，其余品種的耐寒性居中。

關(guān)鍵詞：中山杉;半致死溫度;耐寒性

中圖分類號(hào) S79 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2020）24-0086-03

Evaluation of Low Temperature Semi-lethal Temperatureand Cold Tolerance of Seven Taxodium‘Zhongshanshan’Cunninghamia lanceolata Varieties

XU Yinchun1 et al.

（1Nantong Haimen District Agricultural Cadres School，Nantong，Jiangsu 226107，China）

Abstract：302，118，401，405，149，402 and 406 were used as experimental materials. The branches before germination of Taxodium‘Zhongshanshan’ were treated with low temperature stress of -8℃，-12℃，-16℃，-20℃，-24℃，-28℃ and -32℃，respectively. According to the changes of cell membrane permeability and Logistic equation，semi-lethal was obtained. Temperature（LT50），in order to provide scientific basis for determining the suitable planting area and selecting cold-tolerant parents for cross breeding of Taxodium‘Zhongshanshan’. The results showed that the increase of relative conductivity and cell membrane damage rate of branches under different low temperature treatments showed a “S” curve，which was negatively correlated with the corresponding low temperature. The low temperature semi-lethal temperatures of 7 cultivars were -18.7℃（-302），-20.5℃（-118），-22.9℃（-401），-21.5℃（-405），-19.9℃（-149），-21.8℃（-402），-26.9℃（-406）. Taxodium‘Zhongshanshan’406 has the strongest cold tolerance.Taxodium‘Zhongshanshan’401 has the strongest cold tolerance，Taxodium‘Zhongshanshan’302 has the weakest cold tolerance，and other varieties have the middle cold tolerance.

Key words：Taxodium‘Zhongshanshan’; Semi-lethal temperature; Cold tolerance

中山杉Taxodium‘Zhongshanshan’是落羽杉Taxodium distichum，墨西哥落羽杉Taxodium mu-cronatum，池杉Taxodium ascendens等3個(gè)樹種種間雜交得到的優(yōu)良無(wú)性系的總稱，由江蘇省·中國(guó)科學(xué)院植物研究所經(jīng)多年試驗(yàn)研究選育而成。具有樹干挺直，樹形美觀，樹葉綠色期長(zhǎng)，耐鹽堿、耐水濕，抗風(fēng)性強(qiáng)，病蟲害少，生長(zhǎng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，為長(zhǎng)江中、下游及其以南地區(qū)平原濕地和沿海灘涂綠化造林、農(nóng)田防護(hù)林的優(yōu)秀樹種。這些優(yōu)良品種在中國(guó)未來(lái)用材林、能源林、碳匯林、休閑林和水源涵養(yǎng)林等營(yíng)造以及沿海防護(hù)林建設(shè)、公路及城鄉(xiāng)綠化、農(nóng)田林網(wǎng)和灘涂造林等方面具有巨大的應(yīng)用潛力[1]。

溫度是影響中山杉生長(zhǎng)和地理分布的一個(gè)重要環(huán)境因子，對(duì)中山杉的生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的作用。低溫凍害是中山杉種植的主要限制因子，影響著中山杉的區(qū)域性分布。野外抗寒性鑒定周期長(zhǎng)且可控度低，室內(nèi)鑒定則通過(guò)人工模擬冰凍試驗(yàn)及生理生化指標(biāo)測(cè)定比較植物抗寒性，能彌補(bǔ)野外試驗(yàn)的不足[2]。

電導(dǎo)法是通過(guò)測(cè)定植物細(xì)胞電解質(zhì)外滲率配以Logistic曲線方程，準(zhǔn)確估量耐寒性的數(shù)量指標(biāo)半致死溫度（LT50），反映植物所忍受的低溫極限，并以此評(píng)價(jià)植物抗寒性的一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏的方法[3]。目前，該方法已被廣泛應(yīng)用于多種果樹抗寒能力的鑒定，如石榴[4]、柑橘[5]、蘋果[6]等，認(rèn)為其能夠直接準(zhǔn)確地反映各果樹品種的耐寒性，但對(duì)用于中山杉的耐寒性研究還尚未見報(bào)道。為此，本試驗(yàn)選用7個(gè)優(yōu)良中山杉品種，測(cè)定不同低溫處理下細(xì)胞電解質(zhì)外滲率，并配合Logistic方程，求得半致死溫度（LT50），確定各品種的耐寒水平，以期為確定中山杉適宜栽植區(qū)及雜交育種選擇耐寒親本提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)材料取自南通茂森苗圃有限公司中山杉扦插苗圃，原種從江蘇省·中國(guó)科學(xué)院植物研究所引進(jìn)。供試材料為中山杉302、118、401、405、149、402、406。試驗(yàn)于2017年1月中下旬即中山杉萌芽前進(jìn)行，選擇生長(zhǎng)勢(shì)相近的1年生扦插苗頂部長(zhǎng)約60cm的枝條作為試驗(yàn)材料。用海爾程控式低溫冰箱（海爾BCD-252WBCS型）對(duì)枝條進(jìn)行低溫脅迫處理，用上海雷磁DDSJ-308F型電導(dǎo)率儀測(cè)定其電導(dǎo)率。

1.2 方法 每個(gè)品種隨機(jī)選取粗細(xì)相近的1年生健壯枝條80個(gè)，枝條先用自來(lái)水沖洗20min，然后用蒸餾水和去離子水各沖洗2～3次，洗后用干凈的細(xì)紗布將水擦干。每個(gè)品種分成8組，每組10條枝條，其中1組在田間條件下（-3℃）測(cè)定其電導(dǎo)率作為對(duì)照（CK），其余7組用低溫冰箱進(jìn)行低溫脅迫處理。枝條用紗布和保鮮膜依次包裹后分別放置在-8℃、-12℃、-16℃、-20℃、-24℃、-28℃、-32℃低溫下進(jìn)行處理，降溫和升溫速率均為4℃/h，到達(dá)設(shè)定的溫度后保持12h。按品種取出低溫處理的中山杉枝條，在4℃下解凍2h，取出選枝條將中間部分剪成2mm的薄片混合均勻，分別稱取枝段約0.5g置于電導(dǎo)杯中，加入超純水25mL搖勻，浸泡18h，測(cè)定其電導(dǎo)率值C1，C1代表低溫處理后枝條的電解質(zhì)滲出量;再將樣品于沸水浴中煮30min，冷卻1h 后，搖勻測(cè)定電導(dǎo)率值C2，C2代表低溫處理后枝條的原生質(zhì)膜被全部破壞后所滲出的電解質(zhì)總量。每個(gè)品種試樣重復(fù)3次，取平均值[7-8]。

相對(duì)電導(dǎo)率（%）=C1/C2×100;

細(xì)胞傷害率（%）=[（C1-CK）/（C2-CK）]×100

式中：CK為對(duì)照樣品的電導(dǎo)率值，CK代表田間溫度田間下枝條的電解質(zhì)滲出量[9]。

Logistic方程和低溫半致死溫度（LT50）研究低溫脅迫處理下中山杉莖段相對(duì)電導(dǎo)率與抗寒性的關(guān)系，配合Logistic方程，相對(duì)電導(dǎo)率擬合Logistic回歸方程為：y=k/（1+ae-bx）;y為實(shí)測(cè)細(xì)胞傷害率，x代表冷凍溫度;k為細(xì)胞傷害率的飽和容量，在本試驗(yàn)中為100;a、b為未知參數(shù)，將方程進(jìn)行線性化處理，令二階導(dǎo)數(shù)等于零，求得a、b值及相關(guān)系數(shù)R，處理溫度對(duì)應(yīng)的相對(duì)電導(dǎo)率曲線的拐點(diǎn)溫度即為半致死溫度，即LT50=lna/b[10]。

1.3 數(shù)據(jù)處理 用Excel統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，DPS軟件分析相關(guān)系數(shù)和獲得Logistic方程擬合參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同低溫處理下7個(gè)品種中山杉的相對(duì)電導(dǎo)率 從圖1可以看出，7個(gè)品種中山杉的枝條相對(duì)電導(dǎo)率隨著溫度的降低總體上呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，處理溫度與相對(duì)電導(dǎo)率之間呈現(xiàn)極顯著的負(fù)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為-0.912～-0.982;處理溫度與相對(duì)電導(dǎo)率之間呈負(fù)相關(guān)的“S”型變化，低溫處理初期7個(gè)品種中山杉相對(duì)電導(dǎo)率上升較為緩慢，隨著溫度的進(jìn)一步降低，相對(duì)電導(dǎo)率迅速上升，隨后電導(dǎo)率上升又趨于緩慢，但上升速度因品種而異。-8～-12℃時(shí)，中山杉302電導(dǎo)率略有下降，其余品種電導(dǎo)率均緩慢上升，中山杉149上升最快達(dá)9.1%。-12～-16℃時(shí)，所有品種電導(dǎo)率繼續(xù)緩慢上升。-16～-20℃時(shí)，中山杉402、406電導(dǎo)率緩慢上升;其余5個(gè)品種電導(dǎo)率迅速上升均在20.0%以上，中山杉149上升最快達(dá)27.7%，5個(gè)中山杉品種在-20℃時(shí)比-16℃時(shí)相對(duì)電導(dǎo)率平均上升24.4%，說(shuō)明這5個(gè)品種細(xì)胞電解質(zhì)滲出量較大，細(xì)胞膜受到的不可逆?zhèn)Α?20～-24℃時(shí)，中山杉402的電導(dǎo)率上升19.2%，上升最快，其余品種電導(dǎo)率上升在5.1%～11.6%。-24～-28℃時(shí)，中山杉的406電導(dǎo)率上升31.8%，其余品種電導(dǎo)率上升上升均在10.0%以下。-28～-32℃時(shí)，中山杉149的電導(dǎo)率略有下降，其余品種的電導(dǎo)率均平緩上升在3.2%～10.3%。

2.2 不同低溫處理下7個(gè)品種中山杉的細(xì)胞傷害率 從圖2可以看出，低溫處理后，7個(gè)品種中山杉的細(xì)胞傷害率與相對(duì)電導(dǎo)率具有相似的變化規(guī)律;相關(guān)性分析結(jié)果表明，細(xì)胞傷害率與相對(duì)電導(dǎo)率呈現(xiàn)極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.995～1.000。處理溫度與相對(duì)細(xì)胞傷害率之間呈負(fù)相關(guān)的“S”型變化，7個(gè)品種中山杉的細(xì)胞膜傷害率隨著溫度的降低總體上呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)。相關(guān)性分析結(jié)果表明，處理溫度與細(xì)胞傷害率之間呈現(xiàn)極顯著的負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.942～-0.986。

2.3 不同低溫處理下7個(gè)品種中山杉的半致死溫度 應(yīng)用Logistic方程對(duì)不同低溫處理下的相對(duì)電導(dǎo)率進(jìn)行擬合。結(jié)果表明，7個(gè)品種中山杉相對(duì)電導(dǎo)率與溫度之間能較好地用Logistic方程進(jìn)行擬合，相關(guān)系數(shù)為-0.78124～-0.9679，均達(dá)極顯著水平，擬合結(jié)果可靠，精確度較高，能準(zhǔn)確體現(xiàn)7個(gè)品種中山杉的耐寒性強(qiáng)弱。從表1可以看出，中山杉406的耐寒性最強(qiáng)半致死溫度為-26.9℃，中山杉401的耐寒性較強(qiáng)半致死溫度為-22.9℃，中山杉302的耐寒性最弱半致死溫度為-18.7℃，其余中山杉品種的耐寒性較為接近半致死溫度在-20.0℃左右。

3 討論

植物組織遭受低溫傷害時(shí)細(xì)胞膜凝膠化，細(xì)胞膜的功能受損或結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致透性增大，胞內(nèi)電解質(zhì)外滲量也相應(yīng)增加。相對(duì)電導(dǎo)率是表現(xiàn)低溫造成的細(xì)胞膜受損前后胞內(nèi)電解質(zhì)滲出率，外滲電解質(zhì)越多，相對(duì)電導(dǎo)率越大，細(xì)胞膜受傷害程度越大，植物耐寒性越弱，反之則植物耐寒性越強(qiáng)[11]。相對(duì)電導(dǎo)率的增加程度較精確地反映了植物組織細(xì)胞膜受傷害的程度，是植物抗寒性強(qiáng)弱評(píng)價(jià)的一個(gè)可靠指標(biāo)[12]。不同各品種對(duì)低溫的應(yīng)激反應(yīng)能力不同，隨著溫度的降低胞內(nèi)電解質(zhì)外滲非持續(xù)進(jìn)行，相對(duì)電導(dǎo)率在總趨勢(shì)升高的基礎(chǔ)上有變緩或下降的情況。如中山杉302在-8～-12℃時(shí)相對(duì)電導(dǎo)率下降，這可能是植物在逆境傷害初期的自我保護(hù)作用，此時(shí)細(xì)胞膜尚處于傷害的可逆階段，能夠進(jìn)行正常的主動(dòng)運(yùn)輸，從而調(diào)整胞質(zhì)的外滲，導(dǎo)致相對(duì)電導(dǎo)率下降[13]。隨著溫度的不斷降低，相對(duì)電導(dǎo)率隨之上升，細(xì)胞膜受到的傷害程度加劇;因遺傳背景的不同，各中山杉品種枝條在細(xì)胞結(jié)構(gòu)上存在差異，不同低溫階段相對(duì)電導(dǎo)率上升的速度有明顯差異。低溫處理后期，各品種的相對(duì)電導(dǎo)率變化均較為平緩，說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞膜透性已遭到了嚴(yán)重破壞，細(xì)胞膜傷害處于不可逆的狀態(tài)，運(yùn)輸功能受損。

低溫半致死溫度是指植物在該溫度時(shí)達(dá)到半致死狀態(tài)，當(dāng)溫度繼續(xù)降低時(shí)，植物所遭受的傷害將不能恢復(fù)，嚴(yán)重的甚至死亡。利用相對(duì)電導(dǎo)率擬合Logistic方程計(jì)算各中山杉品種的低溫半致死溫度，簡(jiǎn)便、快速、設(shè)備便宜，能較好地確定中山杉品種的耐寒性[14-15]。植物的抗寒性受多種因素的影響，其抗寒生理過(guò)程錯(cuò)綜復(fù)雜。本試驗(yàn)只測(cè)定了一個(gè)時(shí)期的電導(dǎo)率，而未考慮不同生長(zhǎng)期對(duì)各中山杉品種半致死溫度的影響，所得到其枝段的LT50只是比較抗寒能力的依據(jù)之一。若要更加精確的判斷各品種的耐寒性，需結(jié)合相關(guān)抗寒性生理、生化指標(biāo)如葉綠素總量、Pro含量、MAD含量、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶（SOD）及過(guò)氧化物酶（POD）活性等來(lái)綜合評(píng)價(jià)[16-17]。若實(shí)驗(yàn)室的間接測(cè)定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果相結(jié)合評(píng)價(jià)中山杉的耐寒性，會(huì)有更好的效果[16]。

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