李艷芳　包國(guó)章　劉曉婷

摘要：以東苜1號(hào)品種苜蓿為試驗(yàn)材料，在中度堿性鹽脅迫下對(duì)其幼苗進(jìn)行凍融處理，以整株幼苗為試驗(yàn)對(duì)象，研究幼苗體內(nèi)蛋白質(zhì)含量、MDA含量、脯氨酸含量、POD活性、SOD活性。結(jié)果表明，堿性鹽脅迫下苜蓿幼苗體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，MDA含量升高10.83%～46.99%，對(duì)幼苗造成傷害，致使蛋白質(zhì)含量減少1.39%～9.89%，幼苗體內(nèi)防御機(jī)制誘導(dǎo)POD、SOD活性增強(qiáng)以抵抗堿性鹽傷害；在凍融脅迫下，整個(gè)凍融周期內(nèi)脯氨酸、MDA含量、POD活性、SOD活性均呈先升高后降低的趨勢(shì)，對(duì)-3 ℃較為敏感，與10 ℃相比分別增加了54.94%、76.80%、48.75%、10.80%，具有顯著性差異（P<0.05）；低溫狀態(tài)下MDA含量增加，幼苗受傷害的程度加??；凍融及堿性鹽雙重脅迫作用對(duì)紫花苜蓿幼苗的傷害更大。在凍融及堿性鹽脅迫下，苜蓿幼苗的各項(xiàng)生理指標(biāo)發(fā)生適應(yīng)性變化，保證了幼苗的正常生長(zhǎng)，表明苜蓿幼苗具有一定耐寒和耐鹽堿能力。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿幼苗；凍融；堿性鹽脅迫；耐寒性；耐鹽堿性

中圖分類號(hào)： S541+.101 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0278-04

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）以“牧草之王”著稱，是世界上栽培利用最廣泛的豆科牧草。其莖直立，叢生以至平臥，呈四棱形，無(wú)毛或微被柔毛，枝葉茂盛，全國(guó)各地區(qū)均有栽培或呈半野生狀態(tài)，生于田邊、路旁、曠野、草原、河岸、溝谷等地。因其植株具有富含蛋白質(zhì)、產(chǎn)量高、各類家畜喜食等優(yōu)點(diǎn)，是畜牧業(yè)發(fā)展中飼料蛋白的重要來(lái)源[1]。

我國(guó)是世界上土壤鹽漬化較嚴(yán)重的國(guó)家之一，土壤鹽漬化嚴(yán)重影響我國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境。我國(guó)鹽堿地面積約為4 000萬(wàn)hm2，約占陸地總面積的25%，僅海岸帶、灘涂的面積就超過(guò)667萬(wàn)hm2[2]。我國(guó)東北地區(qū)土壤鹽漬化嚴(yán)重，且春季凍融是該地區(qū)最常見(jiàn)的現(xiàn)象，復(fù)合環(huán)境脅迫對(duì)牧草的要求更高。紫花苜蓿作為優(yōu)質(zhì)牧草，具有較強(qiáng)的抗寒、抗鹽堿能力，抗逆性是決定其能否成功生存并發(fā)揮優(yōu)勢(shì)生產(chǎn)潛力的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[3]。

近年來(lái)，關(guān)于苜蓿耐鹽性的研究取得了不少成果。龍明秀等研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，紫花苜蓿幼苗葉片和根中抗氧化酶的含量增加；鹽濃度較低時(shí)，葉片內(nèi)抗氧化酶的含量變化不顯著，根的抗氧化能力隨著鹽濃度的升高而下降[1]。周瑞蓮等研究發(fā)現(xiàn)，具有抗寒能力的白三葉在經(jīng)歷凍融過(guò)程后，部分恢復(fù)正常生長(zhǎng)，可見(jiàn)融凍型脅迫引起細(xì)胞結(jié)冰-融化造成的機(jī)械傷害使許多植物無(wú)法越冬[4]。王保平等研究發(fā)現(xiàn)，堿性鹽對(duì)紫花苜蓿的脅迫作用大于中性鹽，各種鹽的作用強(qiáng)度順序?yàn)镹a2SO4

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用室內(nèi)培養(yǎng)皿培養(yǎng)試驗(yàn)法。紫花苜蓿東苜1號(hào)種子經(jīng)7 d培養(yǎng)后得到供試幼苗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種苗選育 挑取飽滿的種子，采用0.1% KMnO4溶液進(jìn)行消毒，采用直徑為100 mm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)幼苗。每個(gè)培養(yǎng)皿中放入2層濕潤(rùn)的濾紙，均勻鋪放100粒種子，加入適量水使種子浸沒(méi)，蓋蓋培養(yǎng)。置于光照恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽處理，發(fā)芽期間可不采用光照。培養(yǎng)至發(fā)芽時(shí)，采用12 h光照，光照時(shí)間溫度為25 ℃，非光照時(shí)間溫度為15 ℃。發(fā)芽期每天定量滴加4 mL水，分早、中、晚3次添加。培養(yǎng)幼苗至長(zhǎng)出第3片子葉時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)相同的植株進(jìn)行堿性鹽脅迫處理。

1.2.2 鹽堿處理 處理濃度為0、100 mmol/L，即無(wú)脅迫、中度脅迫2個(gè)試驗(yàn)組。

1.2.3 人工模擬凍融試驗(yàn) 對(duì)堿性鹽處理過(guò)的試驗(yàn)組進(jìn)行凍融處理，處理時(shí)間為2 h。溫度分別設(shè)置為10、5、0、-3、0、5、10 ℃。設(shè)置對(duì)照組，即加入鹽堿溶液而不進(jìn)行凍融的試驗(yàn)組。根據(jù)每個(gè)溫度下測(cè)定指標(biāo)所需的樣量對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行取樣，每組取3份平行樣，取樣后在冰袋上迅速進(jìn)行測(cè)定試驗(yàn)。

1.2.4 生理指標(biāo)測(cè)定方法 采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白含量，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量，采用酸性茚三酮比色法[7]測(cè)定脯氨酸含量。分別采用SOD、POD試劑盒測(cè)定其活性。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2007、SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)、分析，采用Origin 8.0軟件對(duì)各樣的測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)含量的變化

本試驗(yàn)中對(duì)照組為純凍融脅迫試驗(yàn)組，鹽堿組為凍融及堿性鹽復(fù)合脅迫組。由圖1可知，經(jīng)NaHCO3處理后，紫花苜蓿幼苗體內(nèi)蛋白質(zhì)的含量比對(duì)照組低，減少了1.39%～9.89%?？赡苁怯捎趬A性鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗體內(nèi)蛋白質(zhì)合成酶的活性降低或遭到破壞，致使蛋白質(zhì)合成受阻；或者由于蛋白質(zhì)分解酶活性增強(qiáng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)被分解，表明堿性鹽處理導(dǎo)致植物幼苗體內(nèi)蛋白質(zhì)含量下降，這與毛桂蓮等對(duì)植物耐鹽能力的研究結(jié)果[8-9]一致。

在融凍階段，溫度降至5 ℃時(shí)，對(duì)照組和鹽堿組中苜蓿幼苗體內(nèi)蛋白質(zhì)含量均呈下降趨勢(shì)，10 ℃與5 ℃相比均有顯著性差異（P<0.05）。

在凍融階段，隨著溫度的回升，苜蓿幼苗體內(nèi)蛋白質(zhì)含量均呈上升趨勢(shì)。溫度升至0 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)含量大幅增加，出現(xiàn)了峰值11.09、10.93 mg/g，分別比0 ℃時(shí)增加了18.73%、27.09%，鹽堿組變化較為明顯，與-3 ℃相比均有顯著性差異（P

2.2 MDA含量的變化

由圖2可知，經(jīng)NaHCO3處理后紫花苜蓿幼苗體內(nèi)的MDA含量均高于對(duì)照組，比對(duì)照組增加了10.83%～46.99%?？梢?jiàn)，經(jīng)NaHCO3處理后，植物幼苗受到堿性鹽脅迫，膜脂過(guò)氧化，MDA含量的增加加劇了膜的損傷。這與尤佳等關(guān)于鹽生植物黃花補(bǔ)血種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)對(duì)鹽堿脅迫生理響應(yīng)的研究結(jié)果[12]一致，在堿性鹽脅迫下MDA含量升高，MDA含量越高則膜損傷越大。

在融凍階段，對(duì)照組與鹽堿組中紫花苜蓿幼苗體內(nèi)MDA含量的變化趨勢(shì)一致。隨著溫度的降低，幼苗體內(nèi)MDA含量呈上升趨勢(shì)。對(duì)照組與試驗(yàn)組在-3 ℃時(shí)達(dá)到峰值，MDA含量與10、5、0 ℃時(shí)均有顯著性差異（P

在凍融階段，對(duì)照組與鹽堿組植物幼苗體內(nèi)的MDA含量呈下降趨勢(shì)。溫度回升至10 ℃時(shí)，MDA含量比-3 ℃時(shí)分別降低了37.83%、42.35%，與-3 ℃時(shí)相比有顯著性差異（P

2.3 脯氨酸含量的變化

由圖3可知，堿性鹽處理組的脯氨酸含量均高于對(duì)照組，比對(duì)照組增加了11.07%～45.32%。可見(jiàn)，紫花苜蓿幼苗在堿性鹽脅迫下發(fā)生了抗逆性反應(yīng)，導(dǎo)致體內(nèi)脯氨酸含量升高。這與胡宗英、高文俊等關(guān)于鹽堿脅迫對(duì)紫花苜蓿生理特性影響的研究結(jié)果[14-15]一致。

由圖3可知，凍融周期內(nèi)紫花苜蓿幼苗體內(nèi)的脯氨酸含量呈先上升后下降的趨勢(shì)。在融凍階段，對(duì)照組和鹽堿組紫花苜蓿幼苗體內(nèi)的脯氨酸含量均呈上升趨勢(shì)，在-3 ℃時(shí)出現(xiàn)峰值，分別為116.03、163.01 μg/g，與10 ℃時(shí)相比有顯著性差異（P<0.05），下降了25.19%。這與李彥奇等關(guān)于低溫脅迫對(duì)3種早春短命植物生理生化指標(biāo)影響的研究結(jié)果[16]一致，植物在低溫狀態(tài)下通過(guò)調(diào)節(jié)脯氨酸含量減緩低溫傷害。

2.4 SOD活性的變化

由圖4可知，堿性鹽處理后紫花苜蓿幼苗體內(nèi)SOD活性增強(qiáng)，與對(duì)照組相比增強(qiáng)了3.21%～11.01%?？梢?jiàn)，堿性鹽處理后幼苗迫于堿性鹽脅迫，提高了體內(nèi)SOD活性。這與劉濱碩等關(guān)于羊草在鹽堿脅迫下生理生化響應(yīng)特征的研究結(jié)果[17]一致，在一定鹽堿濃度范圍內(nèi)，SOD活性隨著鹽堿濃度的增大而增大。

在融凍階段，對(duì)照組和鹽堿組紫花苜蓿幼苗體內(nèi)的SOD活性均隨溫度降低呈上升趨勢(shì)。對(duì)照組變化不顯著，-3 ℃時(shí)比10 ℃時(shí)增加了4.51%。堿性鹽處理組中，10～0 ℃時(shí)SOD活性緩慢增強(qiáng)，0～-3 ℃時(shí)SOD活性明顯增強(qiáng)，-3 ℃與0 ℃時(shí)相比有顯著性差異（P<0.05），其余各溫度之間沒(méi)有顯著性差異?？梢?jiàn)，溫度回升，幼苗解凍，植株受到的低溫脅迫減緩，SOD活性降低后趨于穩(wěn)定。葉亞新等對(duì)低溫脅迫下小麥、玉米、蘿卜幼苗超氧化物歧化酶活性影響的研究表明，隨著脅迫溫度的降低，SOD活性呈先上升后下降的趨勢(shì)[18]。龔束芳等研究表明，在低溫脅迫下，偃麥草和高羊茅的SOD活性呈緩慢上升趨勢(shì)[19]。

2.5 POD活性的變化

由圖5可知，堿性鹽處理組的POD活性均高于對(duì)照組，增加了0.48%～6.35%。與其他指標(biāo)相比，POD活性在堿性鹽脅迫下的變化不是特別明顯，但依然呈增加趨勢(shì)?？梢?jiàn)，紫花苜蓿有一定的抗鹽堿能力，在堿性鹽脅迫下，紫花苜蓿幼苗通過(guò)增強(qiáng)POD活性抵抗逆性環(huán)境。孫偉澤對(duì)紫花苜?？果}脅迫的研究也證實(shí)了該結(jié)論，鹽堿脅迫對(duì)植物體內(nèi)的POD活性具有促進(jìn)作用[20]。

在凍融階段，對(duì)照組與鹽堿組POD活性均呈上升趨勢(shì)，在-3 ℃時(shí)較敏感，達(dá)到峰值7.89、8.33 U/g，與10 ℃時(shí)相比具有顯著性差異（P

3 結(jié)論與討論

3.1 凍融及堿性鹽脅迫對(duì)紫花苜蓿幼苗中生物膜系統(tǒng)的影響

植物器官在逆境條件下常發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用，MDA是其產(chǎn)物之一，可與蛋白質(zhì)、核酸發(fā)生反應(yīng)修飾其特征，抑制蛋白質(zhì)的合成。通常將MDA作為膜脂過(guò)氧化指標(biāo)，其含量多少反映了膜的穩(wěn)定性與植物受傷害程度[21]。在凍融及堿性鹽雙重脅迫下，植物所受的最大傷害是膜質(zhì)過(guò)氧化。在雙重脅迫環(huán)境中，細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用會(huì)造成MDA累積[22]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，紫花苜蓿幼苗的MDA含量在堿性鹽單因子脅迫、凍融及堿性鹽雙因子脅迫下均表現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，幼苗生長(zhǎng)受到脅迫，在逆境中產(chǎn)生了大量活性氧，致使細(xì)胞膜受損、MDA含量增加。在本試驗(yàn)中-3～0 ℃低溫條件下，雙重脅迫下鹽堿組與對(duì)照組MDA含量的變化最為明顯?？赡艿脑?yàn)榻鈨鲞^(guò)程中低溫持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，苜蓿幼苗細(xì)胞膜受到的傷害更為嚴(yán)重，這與已有研究的結(jié)果[23]一致。在逆境條件脅迫下，植物幼苗MDA含量隨著脅迫程度的加強(qiáng)而逐漸增大，MDA含量反映了凍融及鹽堿脅迫對(duì)植物的傷害程度。

3.2 凍融及堿性鹽脅迫對(duì)紫花苜蓿幼苗體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

游離脯氨酸是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物體通過(guò)調(diào)節(jié)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)維持體內(nèi)滲透勢(shì)平衡。在正常條件下，植物體內(nèi)游離脯氨酸的含量很低，但遇到干旱、低溫逆境脅迫時(shí)，體內(nèi)脯氨酸大量累積，且累計(jì)指數(shù)與植物的抗逆性有關(guān)，因此可作為植物抗逆性的一項(xiàng)生化指標(biāo)[24]。本研究結(jié)果表明，紫花苜蓿幼苗在逆性環(huán)境中通過(guò)調(diào)節(jié)脯氨酸含量來(lái)維持體內(nèi)滲透平衡。雙重脅迫時(shí)的脯氨酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單因子脅迫，表明凍融條件下進(jìn)行鹽堿處理對(duì)幼苗的危害更大，這是由于雙重脅迫下苜蓿既要通過(guò)脯氨酸進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)，又要抵抗低溫傷害，而后者是耗能過(guò)程，導(dǎo)致苜蓿生長(zhǎng)受抑制。

蛋白質(zhì)是植物細(xì)胞中最豐富的生物大分子，是生物體結(jié)構(gòu)和功能最重要的基礎(chǔ)物質(zhì)之一，作為酶的主要成分可參與細(xì)胞的化學(xué)反應(yīng)[24]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，凍融及堿性鹽雙重脅迫下的蛋白質(zhì)含量低于堿性鹽單因子脅迫，這可能是因?yàn)閴A性鹽脅迫下幼苗生長(zhǎng)受到抑制，蛋白質(zhì)合成受阻，或蛋白質(zhì)合成酶在雙重脅迫下被分解，還可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)合成速率小于分解速率。試驗(yàn)結(jié)果中蛋白質(zhì)的變化規(guī)律與其他指標(biāo)不盡相同，凍融循環(huán)過(guò)程中蛋白質(zhì)含量隨溫度的降低而減少，這可能是因?yàn)榈蜏卦斐芍参锷L(zhǎng)緩慢，受到低溫脅迫；持續(xù)進(jìn)行低溫脅迫，植物產(chǎn)生抗逆性反應(yīng)，蛋白質(zhì)含量隨之升高；在 -3 ℃ 時(shí)，由于溫度過(guò)低造成了凍性傷害，蛋白質(zhì)含量下降；隨著溫度回升，苜蓿幼苗解凍，脅迫壓力減緩，在抗逆能力的促使下蛋白質(zhì)含量增加并趨于穩(wěn)定。王會(huì)良等研究植物的抗寒性機(jī)理時(shí)總結(jié)了前人的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)多數(shù)研究認(rèn)為低溫脅迫會(huì)引起蛋白質(zhì)增加[25]，本試驗(yàn)結(jié)果與之一致。

3.3 凍融及堿性鹽脅迫對(duì)紫花苜蓿幼苗體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)的影響

植物處于鹽堿、低溫等逆境脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的活性氧會(huì)大量積累，超出正常水平，對(duì)細(xì)胞造成過(guò)氧化傷害。此時(shí)植物通過(guò)提高抗氧化酶系統(tǒng)的活性來(lái)清除活性氧，保護(hù)自身免受活性氧的傷害[26-27]。

SOD是保護(hù)植物細(xì)胞免受活性氧傷害的第一道防線，普遍存在于植物體內(nèi)，具有將超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為H2O2的功能，保護(hù)植物免受羥自由基的傷害，其活性大小可直接反映植物受活性氧脅迫和耐受活性氧脅迫的能力[28-29]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，凍融及堿性鹽雙重脅迫下苜蓿幼苗體內(nèi)的SOD活性高于堿性鹽單因子脅迫。在凍融脅迫下，堿性鹽處理組的變化比對(duì)照組更為明顯，表明雙重脅迫下幼苗受到的傷害更為嚴(yán)重。溫度降至-3 ℃時(shí)，對(duì)照組與鹽堿組的差距更為顯著，隨著溫度的回升差距雖有減小但依然明顯，表明凍融過(guò)程中的持續(xù)低溫對(duì)幼苗造成損傷，導(dǎo)致活性氧含量過(guò)高，此時(shí)植物體誘導(dǎo)SOD活性增強(qiáng)以減少活性氧的傷害。這與李銳等關(guān)于棉花幼苗耐低溫能力的研究結(jié)果[30]一致，低溫可誘導(dǎo)植物體內(nèi)SOD活性增強(qiáng)。

POD能夠迅速消除植物體內(nèi)H2O2造成的傷害，被認(rèn)為是植物體內(nèi)保護(hù)細(xì)胞免受H2O2傷害的主要酶。本試驗(yàn)結(jié)果表明，凍融及堿性鹽雙重脅迫下苜蓿幼苗體內(nèi)的POD活性增強(qiáng)，在凍融周期內(nèi)呈先升高、后下降、最后趨于穩(wěn)定的規(guī)律。-3 ℃時(shí)幼苗體內(nèi)POD活性最大，表現(xiàn)最為敏感，這可能是由于此時(shí)幼苗受到的脅迫最為嚴(yán)重，體內(nèi)產(chǎn)生較多H2O2，促使幼苗產(chǎn)生抗逆反應(yīng)，誘導(dǎo)防御系統(tǒng)中的POD活性增強(qiáng)。

4 結(jié)論

凍融及堿性鹽脅迫下，苜蓿幼苗體內(nèi)MDA含量增加，幼苗體內(nèi)膜脂過(guò)氧化傷害加劇，活性氧大量增加，細(xì)胞膜系統(tǒng)受損，苜蓿幼苗通過(guò)誘導(dǎo)SOD、POD活性的增強(qiáng)，快速消除活性氧，防御超氧陰離子自由基對(duì)植物體的傷害。在本試驗(yàn)條件下，苜蓿幼苗仍能繼續(xù)生長(zhǎng)，表明苜蓿幼苗具有一定的抗鹽堿和抗寒能力，為寒冷地區(qū)鹽堿地的利用提供了依據(jù)。苜蓿作為優(yōu)良牧草，對(duì)土壤鹽漬化環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)，同時(shí)具有抗寒能力，在寒冷地區(qū)鹽堿地的利用中具有良好發(fā)展前景。

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