范衛(wèi)鋒，胡琴，段婷婷，葉志文

(1.廣西玉林制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司，玉林 537001；2.廣州康臣藥物研究有限公司，廣州 510530)

正骨水由徐長卿、兩面針、降香、五味藤、薄荷腦、樟腦等26味中草藥組成，具有活血祛瘀、舒筋活絡(luò)、消腫止痛等藥理作用，用于跌打扭傷以及體育運(yùn)動(dòng)前后消除疲勞[1]，也有文獻(xiàn)報(bào)道正骨水治療肩周炎、凍瘡有效[2-3]。目前，采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析正骨水的成分，鑒別出正骨水29 種成分[4]，而對于正骨水的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜研究筆者未見報(bào)道。中藥指紋圖譜能較好地反映中藥及其制劑內(nèi)在質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性，目前被國內(nèi)外廣泛接受和采納作為質(zhì)量控制手段之一[5-6]。筆者采用 HPLC 法對正骨水進(jìn)行指紋圖譜研究，為正骨水的質(zhì)量控制提供更多的參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Synsv0000超純水器(Millipore公司)；JP-060超聲波清洗器(深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司)；BT 25S電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司，感量：0.01 mg]。

1.2藥品與試藥 丹皮酚(批號：110708-200506)，4-甲氧基水楊醛(批號：110790-201404)，樟腦(批號：111749-200601)均購于中國食品藥品檢定研究院，水為純化水，其他試劑均為分析純。19批正骨水，批號分別為213281(S1)，213286(S2)，213290(S3)，213291(S4)，213294(S5)，213305(S6)，213309(S7)，213321(S8)，213322(S9)，213324(S10)，213326(S11)，213327(S12)，1701002(S13)，1701003(S14)，1701004(S15)，1701005(S16)，1701006(S17)，1701008(S18)，1701010(S19)，由廣西玉林制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 Agilent Extend-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)為流動(dòng)相；梯度洗脫，0～15 min，5%→20%A；>15～45 min，20%→30%A；>45～75 min，30%→50%A；>75～90 min，50%→80%A；>90～110 min，80%→100%A，流速：1.0 mL·min-1，柱溫：30 ℃，檢測波長為280 nm。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備 取丹皮酚、4-甲氧基水楊醛、樟腦對照品適量，精密稱定，加甲醇制成1.998，2.016，99.7 mg·L-1溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 精密量取正骨水100 μL，置10 mL量瓶中，加乙醇定容，搖勻即得。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1精密度實(shí)驗(yàn) 取正骨水溶液(批號：213281)，按 “2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量5 μL。以丹皮酚色譜峰為參照，計(jì)算22個(gè)共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積，RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.3.2溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取正骨水溶液(批號：213281)，按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別于制備后0，2，4，8，12，24，48，72 h進(jìn)樣，進(jìn)樣5 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定。以徐長卿藥材主要成分丹皮酚色譜峰為參照，計(jì)算22個(gè)共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD均小于3%，結(jié)果表明供試品溶液放置72 h 穩(wěn)定。

2.3.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取正骨水溶液(批號：213281)，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，制備 6 份供試品溶液，分別進(jìn)樣測定，進(jìn)樣5 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以徐長卿藥材主要成分丹皮酚色譜峰為參照，計(jì)算22個(gè)共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果RSD均小于3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4指紋圖譜的建立與分析

2.4.1指紋圖譜的建立 取19批正骨水，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，得到19批正骨水的 HPLC 指紋圖譜，標(biāo)記為S1～S19。見圖1。

A.空白溶劑；B.對照品；C.正骨水；11.4-甲氧基水楊醛; 14.丹皮酚; 18.樟腦。

圖1 正骨水和對照品的HPLC圖

A. blank solivent;B.control solution;C.Zhenggushui;11.4-methoxysalicylaldehyde;14.paeonol;18.camphor

Fig.1 HPLC chromatogram ofZhenggushuiand control

表1 19批正骨水的相對保留時(shí)間

2.4.2參照峰的選擇 丹皮酚為徐長卿的主要成分，其分離度好、出峰時(shí)間適中、峰面積較大且穩(wěn)定、易于辨認(rèn)，故選擇其作為本品 HPLC 指紋圖譜的參照峰。

2.4.3共有峰的標(biāo)定 以14號(S)丹皮酚色譜峰為參照，計(jì)算樣品的22 個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間、相對峰面積值，共有指紋峰特征參數(shù)見表 1，2。

表2 19 批正骨水的相對峰面積

2.4.4指紋圖譜的相似度評價(jià) 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件”2012 版(國家藥典委員會(huì))對 19 批正骨水進(jìn)行相似度評價(jià)，指紋圖譜疊加見圖2，相似度評價(jià)結(jié)果見表3。S1～S19 相似度>0.90。

圖2 19 批正骨水HPLC 指紋譜疊加

Fig.2 Overlay HPLC fingerprint of 19 batches ofZhenggushui

2.4.5各特征峰的藥材歸屬 按正骨水制備方法制備徐長卿、兩面針、降香、五味藤、香加皮、香樟、樟腦、21味藥材蒸餾液，按“2.2.2”項(xiàng)方法，制成供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，并與正骨水樣品的指紋圖譜進(jìn)行比對，從而確認(rèn)樣品指紋圖譜中各特征峰的歸屬，結(jié)果見表4。

2.4.6正骨水色譜數(shù)據(jù)的聚類分析 將各樣品所得指紋圖譜的 22 個(gè)共有峰峰面積相對于稱樣量量化，運(yùn)用SPSS 20.0版軟件對所有正骨水樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。采用 Ward 法，采用平方Euclidean距離法，計(jì)算不同批號樣品間相似程度，聚類分析結(jié)果見圖3。19批正骨水樣品大致分為 4 類：Ⅰ類包括批號為S1，S3，S4，S5，S6的樣品，Ⅱ類包括批號為S7，S8，S9，S10，S11，S12的樣品，Ⅲ類包括批號為S14，S15，S16，S17的樣品，Ⅳ類包括批號為S13，S18，S19的樣品；但整體而言，這19批正骨水樣品均聚在同一類，產(chǎn)品相似度比較集中，質(zhì)量差異性較小。聚類分析得到的樣品之間的相關(guān)程度，與采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件”2012 版(國家藥典委員會(huì))計(jì)算樣品間相似度的相關(guān)性比較，結(jié)果一致。

3 討論

采用DAD 檢測對正骨水供試品溶液在200～400 nm波長紫外吸收進(jìn)行考察，重點(diǎn)考察210，254，280，310和365 nm共5個(gè)波長，結(jié)果表明在280 nm 波長下，色譜信息豐富，各成分均有較好地吸收，各色譜峰分布均勻，且峰形大小合適，基線較平穩(wěn)，因而選擇了280 nm作為檢測波長。

表3 19批正骨水相似度評價(jià)

表4 指紋圖譜中各特征峰的歸屬

Tab.4 Affiliation of characteristic peaks in fingerprints

藥材峰號徐長卿14降香6,7,9,10,11,12,13,15, 16,17,19,20,21兩面針1,3,4,5,8五味藤19藥材峰號香加皮11香樟22樟腦1821味藥材蒸餾液2,11,22

圖3 聚類分析樹狀圖

正骨水中九龍川、木香、海風(fēng)藤等21味藥材，置回流提取罐中，加入一定濃度乙醇，加熱回流提取7 h后，進(jìn)行蒸餾得到蒸餾液，進(jìn)行液相色譜研究，得到色譜信息較少，正骨水HPLC指紋圖譜得到主要色譜峰來自用于浸漬的具有祛瘀止痛功效的降香[7]、兩面針[8-9]、徐長卿、五味藤、蒸餾提取的香加皮和香樟藥材、加入的樟腦原料藥。

運(yùn)用指紋圖譜技術(shù)可全面評價(jià)中藥復(fù)方制劑內(nèi)在質(zhì)量，其具有整體性、直觀性，相對于以單一對照品而言，其提供的信息更全面，更有價(jià)值[10-11]。本實(shí)驗(yàn)對19批正骨水進(jìn)行HPLC指紋圖譜的研究，標(biāo)定22個(gè)共有峰，并指認(rèn)了3個(gè)成分峰，確認(rèn)14號峰為丹皮酚(徐長卿中主要成分[12])，11號峰為4-甲氧基水楊醛(香加皮中主要成分)，確認(rèn)18號峰為樟腦(樟腦原料)，19批正骨水的相似度均>0.9，并對共有峰進(jìn)行歸屬，結(jié)果表明各樣品的指紋圖譜主要峰整體一致，該法可作為正骨水質(zhì)量控制方法之一。