汪玉馨，唐婉，劉洋，孟長虹，陸益紅，，史清水，王廣基

(1.中國藥科大學(xué)藥物代謝動力學(xué)重點實驗室，南京 210009；2.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院藥理毒理研究中心，南京 210019；3.徐州醫(yī)科大學(xué)新藥研究與臨床藥學(xué)重點實驗室，徐州 221004)

亮菌甲素又稱假蜜環(huán)菌甲素(armillarisin A)，為一種香豆素類化合物，是從我國擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的環(huán)菌屬假蜜環(huán)菌中培養(yǎng)分離出的活性成分，具有促進膽汁分泌和對膽道末端括約肌的松弛、解痙作用，主要用于治療急慢性膽囊炎、急性膽源性胰腺炎、黃疸型肝炎、急慢性淤膽型肝炎、肝炎肝硬化重度膽汁淤積癥等[1-4]。由于亮菌甲素在水中幾乎不溶，常需加聚維酮 K30、丙二醇等輔料提高溶解度以滿足臨床用藥需求[5]，而輔料的安全性問題也越來越受到國內(nèi)外的關(guān)注。除無菌、細菌內(nèi)毒素不符合要求會導(dǎo)致安全風(fēng)險外，注射用輔料潛在的過敏性、刺激性、溶血性和基因毒性以及注射用輔料與主藥之間的配伍不當(dāng)均可導(dǎo)致安全性問題的發(fā)生[6-8]，因此，對于注射用輔料必須要有嚴格的安全性與質(zhì)量要求。

根據(jù)前期亮菌甲素原輔料及其注射劑肌肉刺激、血管刺激及溶血安全性評價研究發(fā)現(xiàn)，亮菌甲素注射液對肌肉、血管刺激性大于注射用亮菌甲素，且其溶血率也接近標準限度，考慮其劑型不同安全性也存在一定差異，為了對在體試驗結(jié)果進行驗證，筆者比較不同生產(chǎn)企業(yè)、不同原輔料之間的細胞毒性是否存在差異，進一步考察亮菌甲素原輔料及其制劑在小鼠成纖維細胞(L929)上的毒性反應(yīng)，為亮菌甲素注射劑原輔料來源的選擇、處方、工藝及劑型優(yōu)化提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1儀器與試劑 生物安全柜(美國賽默飛世爾科技公司，型號：Thermo 1300series A2)、5%二氧化碳(CO2)箱培養(yǎng)箱(德國Memmert公司)、倒置顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社，型號：OLYMPUS IX53)、光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社，型號：OLYMPUS BX41)、高壓蒸汽滅菌器(日本松下電器株式會社，型號：Panasonic MLS-3781L)、細胞計數(shù)儀(Countstar BioMed，上海睿鈺生物科技有限公司)、培養(yǎng)瓶(美國Costar公司，規(guī)格：25 mL)。二甲亞砜(DMSO，美國Solarbio生化試劑公司，批號： 1213C0341)、1640培養(yǎng)基(GIBCO公司，批號：8118167)、小牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批號：20170106)、0.25%胰酶消化液(HyClone公司，批號：J180013，)，細胞株[ATCC CCL1 NCTC clone 929(小鼠成纖維細胞)，上海細胞研究所]。

1.1.2實驗樣品 亮菌甲素注射劑生產(chǎn)企業(yè)、規(guī)格、批號及其原料來源相關(guān)信息見表1，其中注射用亮菌甲素有3家生產(chǎn)企業(yè)，3個規(guī)格，每個規(guī)格2批，共8批；亮菌甲素注射液生產(chǎn)企業(yè)僅1家，2個規(guī)格，共4批；原料生產(chǎn)企業(yè)有3家，由4個制劑生產(chǎn)企業(yè)提供，共4批。實驗時除原料用DMSO溶解后，用1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清)稀釋外，其他均直接用1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清)稀釋。

亮菌甲素注射液各輔料濃度分別為聚維酮K30 0.25%、N，N-二甲基乙酰胺5%、丙二醇30%、聚乙二醇400 1%、聚乙二醇6000 5%、聚山梨酯80 0.5%、硫脲0.06%，同時按上述濃度配制輔料總混液，配制后高壓滅菌。

注射用亮菌甲素各輔料濃度分別為甘露醇58.5%、精氨酸39%、枸櫞酸鈉10%，配制后高壓滅菌。

表1 亮菌甲素制劑及原料相關(guān)信息

Tab.1 The information of armillarisin A injections as well as its raw materials

劑型與生產(chǎn)企業(yè)規(guī)格批號備注注射用亮菌甲素 企業(yè)A2.5 mgA-1原料來源企業(yè)EA-2 企業(yè)B5 mgB-1原料來源企業(yè)GB-2 企業(yè)C5 mgC-1原料來源企業(yè)GC-2 企業(yè)C1 mgC-3原料來源企業(yè)GC-4亮菌甲素注射液 企業(yè)D10 mL5 mgD-1原料來源企業(yè)GD-2 企業(yè)D2 mL1 mgD-3D-4原料 企業(yè)EE-1企業(yè)A提供 企業(yè)FF-1企業(yè)F提供 企業(yè)GG-1企業(yè)B提供 企業(yè)GG-2企業(yè)G提供

1.2實驗方法

1.2.1L929細胞毒性實驗 將已培養(yǎng)48～72 h細胞生長旺盛的L929細胞用0.25%胰酶消化液，消化數(shù)秒，加入細胞培養(yǎng)液6 mL，用吸管把細胞從瓶壁上吹打下來，混勻后用血細胞計數(shù)板在細胞計數(shù)儀下計數(shù)。根據(jù)實測細胞濃度，用適量培養(yǎng)液加入培養(yǎng)瓶，配制成100 000個·mL-1的細胞懸液備用。取12孔細胞培養(yǎng)板，每孔加細胞懸浮液l mL，置37 ℃ ，5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。

當(dāng)細胞培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)液，分別加入用1640培養(yǎng)液配成的供試品液，每孔1 mL。原料陰性對照給予1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清)990 μL，加DMSO 10 μL，其他陰性對照給予1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清)1 mL。供試品溶液濃度，注射用粉針分別為：0.25，0.125，0.0625，0.031 25 mg·mL-1；注射液分別為：0.05，0.025，0.005，0.002 5 mg·mL-1；原料分別為：1，0.5，0.25，0.125，0.062 5 mg·mL-1；輔料根據(jù)其對應(yīng)的原料濃度稀釋計算，注射液對應(yīng)主藥活性藥用成分(active pharmaceutical ingredient,API)濃度為0.25，0.05，0.025，0.005，0.002 5 mg·mL-1，注射用粉劑對應(yīng)主藥(API)濃度為0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.031 25 mg·mL-1。

37 ℃、5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，光學(xué)倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，棄去原培養(yǎng)液，加入0.25%胰酶消化液，消化數(shù)秒后棄去胰酶消化液，再加入細胞培養(yǎng)液1 mL，用吸管把細胞從瓶壁上吹打下來，混勻后在細胞計數(shù)儀下計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1亮菌甲素注射劑細胞毒性測定及比較 將亮菌甲素原輔料及其注射劑相應(yīng)每個濃度的細胞數(shù)轉(zhuǎn)換成細胞生長抑制率，用GraphPad Prism 5軟件計算出50%細胞生長抑制濃度(IC50)，結(jié)果見表2，3。

根據(jù)上述實驗結(jié)果將不同生產(chǎn)企業(yè)的注射用亮菌甲素及亮菌甲素注射液L929細胞IC50值進行比較，并按細胞毒性由小至大從左向右排列，結(jié)果見圖1。

2.2亮菌甲素原輔料細胞毒性測定及比較 將不同生產(chǎn)企業(yè)亮菌甲素原料、輔料及輔料總混液各濃度的細胞數(shù)轉(zhuǎn)換成細胞生長抑制率，用GraphPad Prism 5軟件計算IC50，結(jié)果見表4～6。

根據(jù)上述實驗結(jié)果將亮菌甲素注射劑各生產(chǎn)企業(yè)的原料及其制劑中的各輔料、輔料總混液按照其相應(yīng)原料濃度計算的L929細胞IC50值進行比較，并按細胞毒性由小至大從左向右排列，結(jié)果見圖2。

3 討論

本實驗通過測定亮菌甲素原輔料及其注射劑對L929細胞染毒后的IC50值，比較不同劑型及不同原輔料間細胞毒性大小，由于亮菌甲素不易溶于水，因此用DMSO溶解后，用1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清)稀釋后給藥，其中DMSO在細胞培養(yǎng)液中量不超過1%。同時，由于亮菌甲素原料及制劑均有一定顏色，噻唑藍(MTT)法測定結(jié)果存在一定干擾，故采用細胞計數(shù)法對活細胞數(shù)進行測定。與MTT法比較，雖然已采用細胞計數(shù)儀進行計數(shù)，減少人工計數(shù)存在的死活細胞辨認等主觀誤差，但仍然存在操作繁瑣、費時費力的局限性，但由于計數(shù)過程中可結(jié)合細胞形態(tài)進行觀察，綜合判斷，結(jié)果更為準確[9]。

比較各批次亮菌甲素注射劑IC50值可以發(fā)現(xiàn)，亮菌甲素注射液IC50值(0.005 83 ～0.010 25 mg·mL-1)均小于注射用亮菌甲素IC50值(0.060 49～0.175 3 mg·mL-1)，顯示注射液的L929細胞毒性明顯大于注射用粉針?？疾觳煌a(chǎn)企業(yè)原料的IC50值為0.078 02～0.134 mg·mL-1，與注射用粉針結(jié)果相似，故考慮注射液中由于輔料的影響導(dǎo)致細胞毒性增加。

表2 注射用亮菌甲素細胞毒性計數(shù)結(jié)果

表3 亮菌甲素注射液細胞毒性細胞計數(shù)結(jié)果

圖1 不同批號亮菌甲素注射液IC50值比較

Fig.1 Comparison of IC50value of armillarisin A injections among different batches

與原料及其他輔料相比，注射液中N，N-二甲基乙酰胺(API IC50為0.007 172 mg·mL-1)及丙二醇(API IC50為0.018 53 mg·mL-1)毒性較大，導(dǎo)致輔料總混液(API IC50為0.016 59 mg·mL-1)細胞毒性增加，從而增加注射液的細胞毒性。因此，有必要對亮菌甲素注射液處方和生產(chǎn)工藝進一步優(yōu)化，降低藥用輔料可能帶來的不良反應(yīng)，從而保障人民群眾的用藥安全。

表4 亮菌甲素原料細胞毒性細胞計數(shù)結(jié)果

表5 亮菌甲素注射液輔料細胞毒性細胞計數(shù)結(jié)果

表6 注射用亮菌甲素輔料細胞毒性細胞計數(shù)結(jié)果

圖2 亮菌甲素原輔料IC50值比較

Fig.2 Comparison of IC50value of the raw material and the excipients of armillarisin A