楊旭，楊亞亞，曹燕，丁向彬，郭益文，郭宏，劉新峰

（天津農學院 動物科學與動物醫(yī)學學院 天津市農業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384）

驢為馬屬動物，具有性情溫和、環(huán)境適應能力強、便于飼養(yǎng)等特點[1]。近年來隨著人們生活水平的逐漸提高，驢作為“使役工具”的時代已經過去，而驢本身及其副產品逐漸演變成人們生活中的“營養(yǎng)食品”或“藥用食品”，如驢乳、驢肉、驢皮、驢鞭、驢血、驢骨等都具有很高的營養(yǎng)和藥用價值。目前已知，驢肉中蛋白質、不飽和脂肪酸以及微量元素的含量均高于豬、牛和羊肉，而脂肪含量低于豬、牛和羊肉[2-3]。據報道，全世界養(yǎng)驢數在 1996年時已達到4 346.7萬頭，其中養(yǎng)驢數目最多的是亞洲，達2 131.6萬頭，中國的養(yǎng)驢數占到亞洲的51.24%，達1 092.3萬頭。但到1997年統(tǒng)計時發(fā)現，全世界養(yǎng)驢數減少到 4 331.8萬頭，我國減少到1 073.3萬頭[4]。截至2016年，我國養(yǎng)驢數僅為456.9萬頭，占世界驢存欄量4 412.56萬頭的10.35%[5]。驢養(yǎng)殖數量的持續(xù)下降，主要與國內外養(yǎng)殖業(yè)以豬、牛、羊養(yǎng)殖為主，驢品種資源少、繁殖效率低有關。精液保存的目的是能最大限度地延長精子的存活時間且維持其受精能力。保存的精液經不同地區(qū)間的運輸，可擴大精液的使用范圍、增加受配動物的數量、提高種公畜的利用效率，使優(yōu)良種公畜的繁殖潛力和遺傳優(yōu)勢得到充分發(fā)揮。目前，驢精液保存的相關研究還比較少，隨著養(yǎng)驢業(yè)的興起和不斷發(fā)展，開展驢精液保存的研究，不僅可以解決我國驢存欄量持續(xù)減少和養(yǎng)驢規(guī)模日益縮小的問題，也可進一步推動養(yǎng)驢生產的發(fā)展。本文主要針對驢精液的低溫保存展開研究，以期篩選出適合驢精液的低溫保存稀釋液及稀釋液的過濾方式，旨在為提高驢的繁殖效率奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選擇4～6歲健康的種公驢5頭，且具有正常生殖能力，種公驢均由天津龍?zhí)煨竽琉B(yǎng)殖有限公司提供并養(yǎng)殖，每日定時飼喂，自由采食，自由飲水。

1.2 試驗試劑

三羥甲基氨基甲烷（Tris），北京鼎國昌盛生物技術有限公司生產；檸檬酸，天津大學科威公司生產；葡萄糖，天津市北方天醫(yī)化學試劑廠生產；果糖、青霉素和鏈霉素均由 Amresco生產；氧化石墨烯，AFNANO.INT生產；VC，Alfa Aesar（china）生產；VE，東京化成工業(yè)株式會社生產。

1.3 方法

1.3.1 稀釋液的配置

（1）基礎液的配置：Tris，3.04 g；檸檬酸，1.70 g；葡萄糖，1.5 g；果糖，1.5 g；青霉素，0.08 g；鏈霉素，0.14 g；雙蒸水100 mL。（2）稀釋液的配置：取適量基礎液，按體積百分比添加 15%卵黃作為低溫保存基礎液；取適量低溫保存基礎液分別添加不同濃度的VC、VE和氧化石墨烯（見試驗分組），開展后續(xù)試驗。

1.3.2 試驗分組

（1）稀釋液過濾方式：第一組為基礎液添加15%卵黃后過濾；第二組為基礎液過濾后再添加15%卵黃；第三組為卵黃過濾后，再按 15%的體積百分比添加到基礎液中（各組的過濾方式均為先用0.45 μm孔徑的過濾器過濾，再用0.22 μm孔徑的過濾器過濾）。（2）VC添加組：取適量低溫保存的基礎液過濾后再添加 15%卵黃的稀釋液，分別按100、200、300 μg/100 mL濃度添加VC。（3）VE添加組：取適量低溫保存的基礎液過濾后再添加15%卵黃的稀釋液，分別按5%、10%、15%濃度添加VE。（4）氧化石墨烯添加組：取適量低溫保存的基礎液過濾后再添加 15%卵黃的稀釋液，分別按 20%、25%、30%濃度添加氧化石墨烯。

1.3.3 鮮精的采集及低溫保存

使用假陰道法采集精液，4層無菌紗布過濾，收集到50 mL滅菌離心管內。將采集的鮮精和各組稀釋液分別按體積比為1∶2的方式添加到5 mL滅菌離心管中，混合均勻后將離心管封口放入盛有25 ℃水的燒杯中，轉移至4 ℃冰箱中保存，每隔24 h或48 h觀察精子的活率，并進行記錄。

1.3.4 統(tǒng)計與分析

試驗所得的數據用SPSS 20.0進行處理，用方差分析做差異顯著性檢驗，數據結果均用“平均數±標準差”進行表示。

2 結果與分析

2.1 稀釋液不同過濾方式對驢精子低溫保存活率的影響

由表1可見，在低溫保存2、4、6 d后，3組間精子活率均無顯著性差異（P＞0.05）；在低溫保存1 d后3組間精子活率均有顯著性差異（P＜0.05），且第二組稀釋液中精子活率最高；在低溫保存3 d后，第二組和第三組間精子活率存在顯著差異（P＜0.05），但第一組與其他兩組間差異不顯著（P＞0.05）；在低溫保存5 d后，第二組與第一組和第三組間精子活率均有極顯著差異（P＜0.01），而第一組和第三組間無顯著差異（P＞0.05）。綜合以上結果，分析可知第二組精子低溫保存效果優(yōu)于第一組和第三組。

表1 稀釋液不同過濾方式對驢精子低溫保存活率的影響

2.2 不同濃度VC對驢精子低溫保存活率的影響

由表2可見，添加3種不同濃度VC的稀釋液，在低溫保存4、6 d后3組間精子的活率均無顯著差異（P＞0.05）；在低溫保存 2 d時發(fā)現，添加100 μg/100 mL VC的稀釋液精子活率最高，與添加200和300 μg/100 mL VC的稀釋液組間的精子活率存在顯著性差異（P＜0.05），但添加 200和300 μg/100 mL VC的稀釋液組間的精子活率無顯著差異（P＞0.05）；進一步分析結果發(fā)現，低溫保存8 d后與低溫保存2 d后的試驗結果截然相反，添加200和300 μg/ 100 mL VC的稀釋液組間無顯著差異（P＞0.05），但與添加100 μg/100 mL VC的稀釋液組的精子活率均存在顯著差異（P＜0.05）。結合以上結果分析認為，添加200和300 μg/ 100 mL VC的稀釋液比較適合驢精子的低溫保存。

表2 不同濃度VC對驢精子低溫保存活率的影響

2.3 不同濃度VE對驢精子低溫保存活率的影響

由表3可見，在低溫保存2 d后，添加5% VE稀釋液中的精子活率極顯著高于添加濃度為 10%VE的稀釋液（P＜0.01），顯著高于添加濃度為15%VE的稀釋液（P＜0.05）；在低溫保存4和6 d后，3組精子間的活率均無顯著性差異（P＞0.05）；在低溫保存8 d后，添加15% VE的稀釋液保存的精子活率最低，且與其他兩組相比有顯著性差異（P＜0.05）；在低溫保存10 d后，添加5% VE的稀釋液中精子活率最高，與添加濃度為 10% 和15% VE的稀釋液組間的精子活率存在極顯著差異（P＜0.01）；綜上分析可知，當稀釋液中VE的濃度為5%時最適合驢精子的低溫保存。

表3 不同濃度VE對驢精子低溫保存活率的影響

2.4 不同濃度氧化石墨烯對驢精子低溫保存活率的影響

由表4可見，在低溫保存2 d后，添加30%氧化石墨烯稀釋液與添加 25%氧化石墨烯稀釋液中的精子活率存在極顯著性差異（P＜0.01），添加30%氧化石墨烯稀釋液與添加 20%氧化石墨烯稀釋液中的精子活率存在顯著性差異（P＜0.05），添加20%氧化石墨烯稀釋液與添加 25%氧化石墨烯稀釋液中的精子活率無顯著性差異（P＞0.05）；在低溫保存4和6 d后，3組稀釋液保存的精子活率均無顯著性差異（P＞0.05）；在低溫保存8 d后，3組不同濃度稀釋液中的精子活率均有顯著性差異（P＜0.05），添加 30%氧化石墨烯稀釋液中的精子活率高于其他2組。綜上分析可知，當稀釋液中氧化石墨烯的濃度為 30%時，較適合驢精子的低溫保存。

表4 不同濃度氧化石墨烯對驢精子低溫保存活率的影響

3 討論

稀釋液的無菌程度可影響精子的保存時間。通常情況下，在進行精子保存時，只對配制基礎液的水作無菌處理，而對配制好的基礎液及基礎液中添加的卵黃都不做進一步的無菌處理，基于此，本研究針對基礎液及添加的卵黃進行不同方式的過濾處理，盡量達到無菌的要求，進一步篩選出可以延長精子保存時間的過濾方式。通過試驗發(fā)現，單獨過濾基礎液后再添加卵黃對驢精子保存的效果優(yōu)于單獨過濾卵黃后再添加到基礎液中的保存效果，同時也優(yōu)于卵黃添加后再進行過濾的保存效果。本研究結果表明，單獨過濾基礎液可以提升基礎液的無菌程度，使驢精子的保存效果更好，但過濾卵黃后驢精子保存效果較差。分析原因，可能是因為卵黃過濾后破壞或減少了卵黃中有利于精子保存的物質。已有報道表明，卵黃中對精子起保護作用的主要是卵磷脂，含卵黃的精液保存液可以獲得比較理想的保存效果[6]。Rota等研究發(fā)現，添加2%的卵黃對驢精子進行凍存，解凍后精子的活力會增強[7]。這些報道證實了卵黃對精子保存的重要性。

VC作為常見的抗氧化劑，已有將VC應用在精液保存中的報道。趙憲林等研究發(fā)現 VC可提高精子低溫保存后的活率及頂體完整率，并且可以降低低溫保存對精子的危害[8]。姚桂東等研究也發(fā)現，VC有緩解熱應激的功效[9]，在低溫保存時會有緩慢降溫的操作，稀釋液中添加 VC可以減弱溫度突然降低時對精子的損傷。本次試驗也證實添加 VC后，驢精子的存活時間明顯延長，在第八天時精子活率在0.40以上。

VE是動物機體內重要的抗氧化劑，對細胞膜、線粒體或網狀組織的磷脂有著特殊的親和性，可以親和在膜的特定部位，預防或阻止誘發(fā)脂質過氧化反應，使之無法生成過氧化脂質的老化因子，從而起到保護精子膜免受氧化損傷的作用，有效減輕精子細胞受到的氧化應激損傷程度，保護精子的正常性能[10-12]。張樹山研究也證實VE可提高精液凍存后的活率和頂體完整率[13]，本試驗通過在稀釋液中添加不同濃度 VE對驢精子進行低溫保存，發(fā)現 VE的添加確實可以延長驢精子的存活時間，其中VE添加濃度為5%時保存效果最好，保存第十天時精子平均活率仍然接近0.30。

氧化石墨烯是石墨烯的衍生物，表面有很多羧基，可以很好地和大量帶有正電荷的物質基團結合，比石墨烯的親水性更強，氧化程度更高，被廣泛應用于生物藥學方面[14]。陳利萍等[15]研究也發(fā)現氧化石墨烯具有抗氧化的作用。中國科學院化學研究所王健君首次將氧化石墨烯作為抗氧化劑應用于低溫凍存馬精子，并發(fā)現具有很好的保存效果，馬精子的活率從24.3%提高到71.3%。迄今為止，氧化石墨烯在哺乳動物精子保存方面的研究鮮見報道。本次試驗通過在稀釋液中添加不同濃度的氧化石墨烯對驢精子的低溫保存效果進行研究，結果顯示，添加氧化石墨烯的稀釋液濃度為 30%時最適合精子的低溫保存，在保存第八天時精子平均活率仍然接近0.30。