洪靜，劉黎瑤,,通信作者，王慶奎

（天津農學院 a.基礎科學學院，b.天津市水產生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384）

煙酰胺，化學名為吡啶3-甲酰胺[1]，參與機體內多種氧化還原反應[2-4]，臨床上多用來治療代謝相關疾病，如唇炎、口角生瘡、肝臟疾病等[5-7]。研究表明，煙酰胺具有多種皮膚科藥理作用，能有效降低皮膚癌發(fā)病率，經皮給藥之后具有抗自由基氧化、抑制黑色素轉移以及消炎等作用[8-10]，可用于開發(fā)抗衰老及局部治療的外用制劑。但是，由于煙酰胺具有酰胺的結構，在空氣中長期放置會被氧化成煙酸，繼而對皮膚產生一定的刺激性[11]，因此，本研究中采用水中乳化的方式將煙酰胺制備成油包水型（W/O）乳膏劑，將煙酰胺包載于內水相中以增加其穩(wěn)定性[12]，提高其經皮給藥順應性。在研究過程中，通過單因素影響試驗，以離心穩(wěn)定性為評價指標，對油/水比例、乳化劑以及輔助乳化劑加入量（質量分數(shù)）的范圍進行篩選，在保證乳膏劑具有較高離心穩(wěn)定性的前提下，通過正交篩選的方法，以外觀均一性、涂布延展性、離心穩(wěn)定性以及耐寒耐熱性的綜合評分作為考察指標，篩選出處方中油/水比例、乳化劑及輔助乳化劑最適加入量，確定制備乳膏劑的最優(yōu)工藝處方。根據(jù)該優(yōu)選處方，平行制備3批煙酰胺乳膏劑，初步研究25 ℃條件下煙酰胺乳膏劑的放置穩(wěn)定性，為其后期進一步應用奠定物質基礎。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

電子天平（Sartorius，BSA 223S）；超聲波清洗儀（昆山禾創(chuàng)儀器有限公司，KH5200B型）；紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；離心機（長沙湘儀儀器有限公司，H1650型）；電熱恒溫鼓風干燥箱（賽默飛世爾科技有限公司，DHG-9240A型）；醫(yī)用冷藏箱（青島海爾特種電器有限公司，HYC-360型）；恒溫水浴鍋等。

1.2 試藥

煙酰胺（江西兄弟醫(yī)藥有限公司，純度99%）；煙酰胺標準品（中國藥品生物制品檢定院，HPLC≥98%）；凡士林（天津奧淇洛譜商貿有限公司，分析純）；Span-60、Tween-80（天津市風船化學試劑有限公司，分析純）；其他試劑均為分析純。

2 試驗方法

2.1 乳膏劑的制備方法

采用水中乳化法制備空白乳膏劑（基質）以及載藥乳膏劑[13]。分別稱量處方量的蒸餾水與凡士林作為水相和油相，將其置于80 ℃的水浴條件下進行保溫。之后，將處方量的乳化劑以及輔助乳化劑分別加至油相中充分溶解。在磁力攪拌條件下將油相逐滴加至水相中并逐漸放冷，即得空白乳膏劑。

在制備載藥乳膏劑的過程中，取處方量的煙酰胺溶于水相中，后續(xù)制備過程與空白基質相同。

2.2 煙酰胺含量測定方法

2.2.1 紫外光區(qū)全波長掃描

稱取煙酰胺標準品10 mg置于容量瓶中，加入蒸餾水超聲溶解并稀釋至適當質量濃度之后，使用紫外-可見分光光度計測定其在200～400 nm波長區(qū)域內的紫外吸收情況，并記錄該區(qū)域內的掃描光譜圖。根據(jù)全波長掃描光譜圖選擇含量測定的最適波長。

2.2.2 標準曲線繪制

準確稱量煙酰胺標準品10 mg置于容量瓶中，加入蒸餾水超聲溶解并定容至100 mL，配制得到質量濃度為100 μg/mL的儲備液。精密量取適量儲備液，并用蒸餾水稀釋得到5、10、15、20、25、30 μg/mL梯度質量濃度的標準溶液。采用紫外分光光度法，在最適吸收波長條件下，測定上述系列標準溶液的吸光度。以標準溶液的質量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線，并通過最小二乘法擬合出線性回歸方程。

2.2.3 精密度測定

取2.2.2部分的低、中、高質量濃度的線性樣品連續(xù)測定5次，測定其在最適波長下的吸光度，記錄吸光度數(shù)值并計算相對標準偏差（RSD%）。

2.2.4 加樣回收試驗

精密稱取空白乳膏劑基質10 g，向其中加入已知質量濃度的煙酰胺標準溶液，使得其中煙酰胺的質量濃度分別為 5、15、30 μg/mL，10 000 r/min離心10 min，將水層和油層完全分離，分取水層后測定其在最適波長下的吸光度，使用標準曲線的回歸方程計算水層中煙酰胺的質量濃度及其加樣回收率。

2.3 單因素影響試驗

2.3.1 油相/水相質量比例范圍的篩選

根據(jù)前期試驗結果，在保持乳化劑 Span-60以及輔助乳化劑 Tween-80的加入量均為 1% 的前提下，設定油相與水相的質量比例分別為7/3、6/4、5/5、4/6、3/7，以離心穩(wěn)定性（6 000 r/min×20 min）對油相/水相的質量比例進行篩選。以篩選出能夠形成穩(wěn)定乳膏劑的油相/水相質量比例范圍。

2.3.2 乳化劑Span-60用量范圍的篩選

在保持油相/水相的質量比例為5/5以及輔助乳化劑Tween-80的加入量為1%的前提下，設定Span-60的加入量為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，以離心穩(wěn)定性（6 000 r/min×20 min）對 Span-60加入量的范圍進行篩選，以篩選出能夠形成穩(wěn)定乳膏劑的Span-60用量范圍。

2.3.3 輔助乳化劑Tween-80用量范圍的篩選

在保持油相/水相的質量比例為5/5以及乳化劑 Span-60的加入量為 1% 的前提下，設定Tween-80的加入量為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，以離心穩(wěn)定性（6 000 r/min×20 min）對Tween-80加入量的范圍進行篩選，以篩選出能夠形成穩(wěn)定乳膏劑的Tween-80用量范圍。

2.4 正交設計試驗

根據(jù)單因素影響試驗結果，乳膏劑的穩(wěn)定性受油相/水相質量比例（A）、乳化劑Span-60用量（B）以及輔助乳化劑 Tween-80用量（C）的影響。因此，進行三因素三水平的正交試驗，正交設計因素水平表如表1所示。

表1 正交設計因素水平表

本試驗以乳膏劑綜合評分[14-15]（根據(jù)外觀均一性、涂布延展性、離心穩(wěn)定性、耐寒性以及耐熱性的綜合評價）為指標進行篩選，以得到制備乳膏劑的最佳處方工藝。其中，外觀均一性、涂布延展性、離心穩(wěn)定性、耐寒及耐熱性的具體考察方法為：

（1）外觀均一性評價：取適量乳膏劑，目檢外觀是否均一，記錄結果并按照表2評分。

（2）涂布延展性評價：取適量乳膏劑，均勻涂布于濾紙上，觀察涂布過程是否細膩順滑，記錄結果并按照表2評分。

（3）離心穩(wěn)定性評價：取約0.5 g乳膏劑，置于離心管中，6 000 r/min離心20 min，觀察有無分層以及破乳現(xiàn)象，記錄結果并按照表2進行評分。

（4）耐寒性評價：取約2 g乳膏劑，于-20 ℃條件下保存24 h，觀察是否出現(xiàn)破乳分層，記錄結果并按照表2進行評分。

（5）耐熱性評價：取約2 g乳膏劑，于60 ℃條件下保存24 h，觀察是否出現(xiàn)破乳分層，記錄結果并按照表2進行評分。

W4#=0.6(0.6415,0.1279,0.7428,0.1056,0.0961)+0.4(0.2509,0.2159,0,0,0)T=(0.4853,0.1631,0.4457,0.0634,0.0577)T

表2 處方篩選各項考察指標評分表

2.5 優(yōu)選處方下煙酰胺乳膏劑的放置穩(wěn)定性考察

在優(yōu)選處方工藝下，制備3批煙酰胺乳膏劑，于25 ℃條件下密封放置0、1、2、3個月，分別對其煙酰胺含量、外觀均一性、涂布延展性、離心穩(wěn)定性、耐寒及耐熱性進行評價，并對該優(yōu)選處方下放置穩(wěn)定性進行評價。

3 結果與分析

3.1 煙酰胺含量的測定方法

3.1.1 紫外全波長掃描

按照既定試驗方法，使用紫外分光光度計測定煙酰胺溶液在200～400 nm波長區(qū)域內的紫外吸收情況，并繪制該區(qū)域內的掃描光譜圖，如圖1所示。根據(jù)紫外全波長掃描光譜圖可知，測定煙酰胺含量的最適波長為260 nm。

圖1 煙酰胺溶液的紫外全波長掃描光譜圖

3.1.2 標準曲線繪制

按照既定的試驗方法，配制不同質量濃度的煙酰胺標準品系列溶液，依法用紫外分光光度法進行檢測，并繪制標準曲線。如圖2所示。

圖2 煙酰胺標準品系列溶液標準曲線

由圖2可知，以吸光度（縱坐標，y）對濃度c（μg/mL，橫坐標，x）進行線性回歸，擬合得出的回歸方程為y＝ 0.026 1x＋ 0.007 3（R2＝0.999 45），煙酰胺標準品系列溶液在0～30 μg/mL的質量濃度范圍內線性關系良好。

3.1.3 精密度測定

按照既定的試驗方法，低、中、高質量濃度的煙酰胺標準品溶液的精密度測定結果如表 3所示。

表3 精密度試驗結果

測定結果表明，對低、中、高質量濃度對照品溶液分別連續(xù)重復 5次測定的RSD值均小于2%，表明該測定方法的精密度良好。

3.1.4 加樣回收率試驗

依法對煙酰胺對照品進行回收率測定，測定結果如表4所示。試驗結果表明，在既定的測定方法下，低、中、高質量濃度樣品的回收率均大于95%，并且平均回收率的RSD值均小于2%，表明該測定方法下煙酰胺對照品的回收率合格。

表4 加樣回收率測定結果

3.2 單因素影響試驗

3.2.1 油相/水相質量比例范圍的篩選

按既定試驗方法，以離心穩(wěn)定性（6 000 r/min×20 min）為評價指標，在保持乳化劑Span-60以及輔助乳化劑 Tween-80的加入量均為 1% 的前提下，對油相/水相的質量比例范圍進行篩選，以篩選出能夠形成穩(wěn)定乳膏劑的油相/水相質量比例范圍。結果表明，當油相/水相的質量比例為7/3、6/4、5/5時，乳膏劑的離心穩(wěn)定性良好，如表 5所示。

表5 油相/水相質量比例篩選表

3.2.2 乳化劑Span-60用量范圍的篩選

根據(jù)既定試驗方法，以離心穩(wěn)定性（6 000 r/min×20 min）為評價指標，在保持油相/水相質量比例為5/5以及輔助乳化劑Tween-80的加入量為1%的前提下，對Span-60加入量的范圍進行篩選，以篩選出能夠形成穩(wěn)定乳膏劑的Span-60用量范圍。結果表明，當Span-60加入量為1%～2%時，乳膏劑的離心穩(wěn)定性良好。如表6所示。

表6 乳化劑Span-60用量范圍篩選表

3.2.3 輔助乳化劑Tween-80用量范圍的篩選

按既定試驗方法，以離心穩(wěn)定性（6 000 r/min×20 min）為評價指標，在保持油相/水相質量比例為5/5以及乳化劑Span-60的加入量為1% 的前提下，對Tween-80加入量的范圍進行篩選，以篩選出能夠形成穩(wěn)定乳膏劑的Tween-80用量范圍。

結果表明，當Tween-80加入量為0～1%時，乳膏劑的離心穩(wěn)定性良好。如表7所示。

表7 輔助乳化劑Tween-80用量范圍篩選表

3.3 正交設計試驗

通過三因素三水平（L9，34）正交設計，以乳膏劑外觀均一性、涂布延展性、離心穩(wěn)定性、耐寒耐熱性的綜合評分作為評價指標，對油相/水相質量比例（A）、乳化劑Span-60用量（B）、輔助乳化劑Tween-80用量（C）進行正交篩選，篩選出制備煙酰胺乳膏劑的最佳處方，正交分析結果如表8所示。

結果表明，在影響該乳膏劑成型性的三大因素中，乳化劑Span-60用量對乳膏劑成型性的影響最大，其次是輔助乳化劑Tween-80用量和油相/水相質量比例。通過正交極差分析得出最優(yōu)處方為 A2B1C2，即油相/水相質量比例為 6/4、乳化劑Span-60用量為1%（m/m）、輔助乳化劑Tween-80用量為0.5%（m/m）。在該優(yōu)選處方下，乳膏劑成型性（外觀均一性、涂布延展性、離心穩(wěn)定性、耐寒性耐熱性的綜合評分）最優(yōu)。

表8 乳膏劑處方篩選的正交試驗結果

3.4 優(yōu)選處方下煙酰胺乳膏劑的穩(wěn)定性評價

按最優(yōu)處方條件制備了3批煙酰胺乳膏劑，并對其放置穩(wěn)定性進行了初步性評價表征，結果如表9所示。

表9 煙酰胺乳膏劑的放置穩(wěn)定性評價（4 ℃）

結果表明，優(yōu)選處方下，所制備的3批煙酰胺乳膏劑載藥量為（3.3±0.51）%，外觀呈均勻的乳白色膏體，涂抹延展時細膩無顆粒感，離心穩(wěn)定性、耐寒及耐熱性均良好。將上述3批載藥乳膏劑置于25 ℃條件下進行放置穩(wěn)定性評價，結果表明，放置3個月內的煙酰胺乳膏劑穩(wěn)定性良好，藥物含量、外觀均一性、涂布延展性、耐寒耐熱性以及離心穩(wěn)定性均未發(fā)生顯著變化。

4 討論

4.1 煙酰胺乳膏劑類型的選擇

根據(jù)油水比例及所使用乳化劑的性質和用量的不同，乳膏劑可分為水包油（O/W）型和油包水（W/O）型，經查閱大量文獻，本研究擬制備煙酰胺油包水（W/O）型乳膏劑。原因主要為以下兩點：

（1）增加主藥煙酰胺的化學穩(wěn)定性。研究表明，煙酰胺中的酰胺鍵在水溶液中不夠穩(wěn)定，容易受pH和氧氣的影響而生成煙酸，不僅會導致有效成分煙酰胺的藥理活性降低，同時所生成的煙酸具有一定的刺激性，對于某些敏感人群造成過敏反應。而在油包水（W/O）型軟膏劑中，通過復合乳化劑的作用，形成油相包覆水相的乳化結構，外層油相能夠將內層水相與空氣隔離開，從而避免內層有效成分煙酰胺在貯存過程中發(fā)生氧化反應。因此本研究將煙酰胺乳膏劑制成油包水（W/O）型，使之更好地發(fā)揮多種藥理作用的同時降低其可能產生的不良反應。

（2）油脂保護作用。在實際應用中，外用油包水（W/O）型軟膏劑相較于水包油（O/W）型乳膏劑不易揮發(fā)、失水，因此作用時間更持久，且能夠在皮膚表層覆蓋一層油脂膜，增強皮膚的水合作用，易于有效成分經皮遞送。因此，將煙酰胺制成油包水（W/O）型外用乳膏劑更利于其發(fā)揮藥理作用。

4.2 輔助乳化劑的作用

本研究中選擇Span-60作為乳化劑，但由于其親水親油平衡值較低，可能會造成乳膏劑分層、不穩(wěn)定等不良后果，因此，在乳膏劑制備過程中多采取加入輔助乳化劑的形式，通過乳化劑復配來調節(jié)Span-60的親水親油平衡值至適宜的范圍，有利于形成更穩(wěn)定的乳膏劑。

本研究中通過系統(tǒng)的處方篩選制備了煙酰胺乳膏劑，采用油包水型乳膏劑的形式，增加了煙酰胺的穩(wěn)定性，并有利于其經皮遞送，具有很大的發(fā)展空間以及實際應用價值。在后期研究中，會考慮向其中加入其他抗氧劑，以進一步增加煙酰胺的貯存穩(wěn)定性。