富榮威，張英輝

（1沈陽(yáng)二四五醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 沈陽(yáng)110042；2北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 沈陽(yáng)110016）

結(jié)腸癌屬于胃腸道常見腫瘤，其發(fā)生及發(fā)展屬于多步驟及多基因過(guò)程，由于結(jié)腸癌處于腹腔內(nèi)，影像學(xué)檢查及內(nèi)鏡檢查難度較大，影響早期診斷［1］。微小RNA （miR）屬于非蛋白質(zhì)編碼小分子RNA，其中miR-192屬于抑癌基因，miR-23a屬于促癌基因，在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中均起到重要作用［2-3］?；诖?，本研究旨在探討結(jié)腸癌患者血清miR-192及miR-23a水平的變化情況及其臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取我院2016年3月至2019年2月期間收治的64例結(jié)腸癌患者作為結(jié)腸癌組，選取同期我院收治的42例腫瘤性息肉患者作為良性息肉組，并選取同期我院30例健康體檢者作為對(duì)照組。結(jié)腸癌組：男28例，女36例；年齡32～73歲，平均 （52.63±4.28）歲。良性息肉組：男18例，女24例；年齡31～72歲，平均 （52.49±4.22）歲。對(duì)照組：男13例，女17例；年齡32～70歲，平均 （52.14±4.19）歲。三組的一般資料比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＞0.05），具有可比性。

1.2 檢驗(yàn)方法入院時(shí)所有入選者均空腹抽取肘靜脈血，結(jié)腸癌組術(shù)后2周再次抽取肘靜脈血，將標(biāo)本裝入試管中，于室溫下靜置1 h，3 000 r／min離心5 min，取血清，置于-70℃冰箱內(nèi)保存待測(cè)。采用PCR技術(shù)測(cè)定血清miR-192及miR-23a，取5 mL血液置于真空管內(nèi)，2 000 r／min離心10 min，取1 mL血清，加入1 mL TRIzo1，充分混勻，4℃下1 200 r／min離心10 min，取上清液，加入0.2 mL氯仿，靜置約3 min，再次離心15 min，取上清液，加入0.5 mL異丙醇，于-70℃冰箱內(nèi)靜置過(guò)夜。第2 d，溶解后，4℃下1 200 r／min離心10 min，去除上清液，采用DEPC水配置的75%乙醇洗清，稍微晾干，加入20 μL經(jīng)DEPC處理的雙蒸水，溶解。采用紫外線分度計(jì)測(cè)定中 RNA量及 A260、A280值。于各組 RNA抽提物中取 1 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲取cDNA；樣品混合均勻后進(jìn)行離心，置于37℃下孵育60 min。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于保存于-20℃下，采用primer express 3.0軟件，結(jié)合目標(biāo)基因的miRNA序列及引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)，合成qPCR檢測(cè)引物及探針。目標(biāo)基因探針及內(nèi)參基因探針均為5'端，標(biāo)記采用FAM報(bào)告熒光，3'端標(biāo)記采用TAMRA淬滅熒光。取中RNA 2 μg加入內(nèi)參U6和目的小分子RNA miR-192及miR-23a逆轉(zhuǎn)錄引物，置于70℃下反應(yīng)約10 min，再給予冰育約2 min，加入其他試劑。反應(yīng)程序：置于42℃及70℃下反應(yīng)，時(shí)間為60 min與10 min，立即取出cDNA產(chǎn)物，置于冰上冷卻、備用；模板選取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，擴(kuò)增時(shí)采用實(shí)時(shí)定量PCR儀，置于95℃下反應(yīng)，反應(yīng)3 min與15 s，以促進(jìn)起始模板及PCR循環(huán)模板變性；再置于60℃下反應(yīng)45 s，達(dá)到退火效果，循環(huán)35次。采用相對(duì)定量法計(jì)算miRNA相對(duì)量表達(dá)，以2-△△CT法分析基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Pearson法檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組的血清miR-192及miR-23a水平比較miR-192水平：結(jié)腸癌組＜良性息肉組＜對(duì)照組；miR-23a水平：結(jié)腸癌組＞良性息肉組＞對(duì)照組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。 見表 1。

表1 三組的血清miR-192及miR-23a水平比較 （±s）

表1 三組的血清miR-192及miR-23a水平比較 （±s）

組別 n miR-192 miR-23a結(jié)腸癌組 64 0.76±0.34 3.47±1.12良性息肉組 42 1.43±0.61 1.30±0.59對(duì)照組 30 3.14±1.02 0.96±0.25 F 126.361 115.209 P 0.000 0.000

2.2 結(jié)腸癌組手術(shù)前后miR-192及miR-23a水平比較與術(shù)前相比，結(jié)腸癌組術(shù)后miR-192水平較高，miR-23a水平較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。見表2。

表2 結(jié)腸癌組手術(shù)前后miR-192及miR-23a水平比較 （±s）

表2 結(jié)腸癌組手術(shù)前后miR-192及miR-23a水平比較 （±s）

時(shí)間 n miR-192 miR-23a術(shù)后 64 2.43±0.89 1.09±0.48術(shù)前 64 0.76±0.34 3.47±1.12 t 14.023 15.626 P 0.000 0.000

2.3 結(jié)腸癌組血清miR-192與miR-23a相關(guān)性相關(guān)性分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組血清miR-192與miR-23a水平呈負(fù)相關(guān)（r＝ -0.997，P＝ 0.000）。

3 討論

miR-192基因位于人體11號(hào)染色體，多表達(dá)于肝臟、結(jié)腸、腎臟等組織中，其在結(jié)腸癌、肺癌、肝癌等疾病中表達(dá)水平較低，被稱為腫瘤抑制性miRNA［4］。miR-192的差異性表達(dá)可用于惡性腫瘤的早期診斷，且在其轉(zhuǎn)移、分期、預(yù)后判定中具有重要意義，其可有效抑制二氫葉酸還原酶的作用，進(jìn)而控制細(xì)胞周期；機(jī)體還可通過(guò)上調(diào)miR-192基因表達(dá)，使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯［5］。本研究結(jié)果顯示，miR-192表達(dá)水平：結(jié)腸癌組＜良性息肉組＜對(duì)照組，結(jié)腸癌組術(shù)后miR-192表達(dá)水平高于術(shù)前，表明機(jī)體下調(diào)miR-192表達(dá)水平與結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，結(jié)腸癌原發(fā)病去除后，使機(jī)體微環(huán)境有效改善，機(jī)體miR-192的表達(dá)水平也隨之升高。

miR-23a屬于miR-23的亞型，參與了細(xì)胞發(fā)育的各個(gè)階段，且在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用，屬致癌基因，在結(jié)腸癌、肺癌等惡性腫瘤中呈高表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移中起促進(jìn)作用［6］。miR-23a通過(guò)靶向性抑制作用，使抑制因子1蛋白發(fā)生轉(zhuǎn)移，進(jìn)而使細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲進(jìn)程不斷加快；此外，miR-23a表達(dá)上調(diào)還可反映浸潤(rùn)深度、結(jié)腸癌分期情況、腸道黏膜惡性轉(zhuǎn)化情況等，在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)等方面也發(fā)揮重要作用［3-4］。本研究結(jié)果顯示結(jié)腸癌組miR-23a表達(dá)水平＞良性息肉組＞對(duì)照組，結(jié)腸癌組術(shù)后miR-23a表達(dá)水平低于術(shù)前，表明miR-23a表達(dá)增加與結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，結(jié)腸癌原發(fā)病去除后，機(jī)體微環(huán)境有效改善，機(jī)體miR-192表達(dá)水平也隨之降低；同時(shí)相關(guān)性分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組血清miR-192與miR-23a水平呈負(fù)相關(guān)，表明兩者存在內(nèi)在聯(lián)系。

綜上所述，血清miR-192及miR-23a水平變化在結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用，兩項(xiàng)指標(biāo)有望作為結(jié)腸癌診斷的重要腫瘤標(biāo)記物。