黃 蓉，吳慶慶，李光建，祝金津，汪萌芽

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.細(xì)胞電生理研究室；2.啟明星小組，安徽 蕪湖 241002)

更年期綜合征(climacteric syndrome，CMS)是圍絕經(jīng)前后婦女因卵巢功能逐漸衰退以致雌激素水平下降，引起的以植物神經(jīng)功能紊亂代謝障礙為主的一系列癥候群[1]。研究表明[2]近日節(jié)律紊亂對(duì)于女性的身心也有不良影響，但對(duì)更年期綜合征的影響未見(jiàn)報(bào)道。故本研究通過(guò)在體同步記錄技術(shù)記錄觀察更年期綜合征大鼠在近日節(jié)律紊亂影響下相關(guān)核團(tuán)室旁核(PaPo)和視交叉上核(SCh)的電活動(dòng)及各項(xiàng)生理指標(biāo)的變化，以探討近日節(jié)律紊亂是否對(duì)CMS模型大鼠產(chǎn)生影響及CMS的心理生理學(xué)機(jī)制，為CMS治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供35只(257±23)g育齡未孕雌性SD大鼠，隨機(jī)均分為CMS組(模型組)、近日節(jié)律紊亂組、模型+近日節(jié)律紊亂組、假手術(shù)組和正常組。

1.2 儀器和藥品 PowerLab八通道生理信號(hào)采集系統(tǒng)及其Chart Pro分析軟件(AD Instruments，Australia)、生物電放大器(美國(guó)A-M Systems，MODEL 1800)、腦立體定位儀和保溫毯系統(tǒng)(上海奧爾科特生物科技有限公司)、電生理屏蔽罩、防震臺(tái)、20%烏拉坦、玻璃微電極和金屬參考電極等。

1.3 造模

1.3.1 模型和假手術(shù) 10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠后,背部摘除模型組和模型+近日節(jié)律紊亂組卵巢[3]；摘除假手術(shù)組卵巢周圍脂肪組織[4]。

1.3.2 近日節(jié)律紊亂[5]近日節(jié)律紊亂組和模型+近日節(jié)律紊亂組放于近日節(jié)律紊亂箱，白熾燈光照兩周。

1.4 模型鑒定 呂氏美蘭染色法[6]檢測(cè)各組大鼠的陰道涂片鑒定造模成功率。術(shù)后3 d對(duì)各組大鼠連續(xù)5 d(早晚各1次)陰道脫落細(xì)胞涂片，觀察有無(wú)發(fā)情跡象(觀察角化上皮細(xì)胞、有核上皮細(xì)胞和白細(xì)胞3種細(xì)胞比例)，無(wú)發(fā)情期即造模成功[7]。

1.5 心理生理學(xué)記錄與分析方法

1.5.1 外周多項(xiàng)生理指標(biāo)的同步記錄 20%烏拉坦(1.5 g/kg)腹腔注射麻醉大鼠后將大鼠俯臥位固定在配有恒溫(37℃)保溫毯的腦立體定位儀上，在右前肢腕關(guān)節(jié)和左后肢踝關(guān)節(jié)上部的皮下插入針式電極，記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖，右后肢針式電極接地；在右側(cè)腋中線第9肋下緣肋間外肌插入兩根針式電極，記錄呼吸肌肌電圖。

1.5.2 細(xì)胞外腦內(nèi)雙核團(tuán)記錄及鑒定[8]大鼠咬合門齒桿后，插入耳桿并保持左右對(duì)稱，固定頭部后手術(shù)刀劃開(kāi)頭皮，用3%H2O2擦至顱骨前囟、人字縫顯示，調(diào)節(jié)兩者水平面一致。定位情況如下，PaPo，AP:-2.04～-2.28 mm,ML:0.1～1.55 mm,DV:7.9～8.05 mm；SCh，AP:-0.48～-0.60 mm，ML:0～0.42 mm，DV:8.9～9.3 mm[9]。冷光源照明下，牙科鉆鉆顱開(kāi)窗，彎針頭挑破硬腦膜、蛛網(wǎng)膜和軟腦膜，操作臂牽引玻璃電極(內(nèi)含滂胺天藍(lán))緊貼腦組織，放好參考電極及接地電極，記錄電極接入記錄放大系統(tǒng)后，緩慢下至目標(biāo)腦區(qū)尋到明確、合適的細(xì)胞外放電信號(hào)，雙核團(tuán)及外周多項(xiàng)生理指標(biāo)信號(hào)穩(wěn)定后，記錄20 min并存盤。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，4%PFA固定鼠腦再冠狀面切片觀察標(biāo)記位置，鑒定記錄位點(diǎn)(圖1)。僅將記錄位點(diǎn)正確的樣本納入結(jié)果的統(tǒng)計(jì)和分析。

左：PaPo；右：SCh。

圖1 雙核團(tuán)定位圖

1.5.3 信號(hào)采集及分析[10-11]用Chart 5軟件采集、存盤各項(xiàng)信號(hào)，心電為低通200 Hz、高通10 Hz，采樣頻率4 kHz，呼吸肌肌電為低通200 Hz、高通0.1 Hz，PaPo和SCh為高通1 Hz、低通5000 Hz。對(duì)核團(tuán)記錄電信號(hào)原始數(shù)據(jù)分析放電頻率。對(duì)核團(tuán)放電原始數(shù)據(jù)帶寬濾波得各神經(jīng)振蕩信號(hào)：delta(1～4 Hz)，theta(4～10 Hz)，beta(10～30 Hz),gamma(30～80 Hz)，fast(80～200 Hz)，用FFT功能分析各神經(jīng)振蕩的能量。使用直接計(jì)數(shù)法對(duì)呼吸頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用記錄一段時(shí)間內(nèi)心率的平均值代表心率值。

2 結(jié)果

2.1 模型鑒定 連續(xù)5 d每天上午9時(shí)和下午4時(shí)檢測(cè)觀察各組大鼠陰道涂片(圖2)以鑒定是否處于動(dòng)情周期的動(dòng)情期階段[12]，涂片結(jié)果可知模型組未處于動(dòng)情期，造模成功。

從左至右分別是正常組、假手術(shù)組、模型組、近日節(jié)律紊亂組和模型+近日節(jié)律紊亂組。

圖2 陰道涂片圖(標(biāo)尺:50 μm)

2.2 核團(tuán)放電活動(dòng)

2.2.1 核團(tuán)放電活動(dòng)的記錄 PaPo和SCh細(xì)胞外電活動(dòng)、心電(ECG)、呼吸肌電(EMG)記錄(圖3),分波段進(jìn)行帶寬濾波則得到各神經(jīng)振蕩記錄(圖4)。

2.2.2 核團(tuán)放電頻率的比較 在PaPo放電頻率上(圖5)，模型組、近日節(jié)律紊亂組、模型+近日節(jié)律紊亂組高于假手術(shù)組和正常組(P<0.05或P<0.01)。在SCh放電頻率上(圖5)，正常組低于其余4組(P<0.01)(圖6)。

2.2.3 神經(jīng)振蕩能量的比較 在PaPo核團(tuán)比較上(表1)，beta和fast振蕩能量上模型組高于其余4組(P<0.05)。在SCh核團(tuán)比較上(表2)，delta和theta振蕩能量上假手術(shù)組高于其余4組(P<0.05)。

2.2.4 核團(tuán)放電頻率的相關(guān)性分析 對(duì)5組PaPo和SCh的放電頻率進(jìn)行直線相關(guān)分析(圖7)，模型+近日節(jié)律紊亂組PaPo和SCh呈高度正相關(guān)(圖7E，r=0.902,P=0.014)，與其余4組基礎(chǔ)放電頻率相關(guān)系數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，正常組基礎(chǔ)放電頻率相關(guān)系數(shù)呈弱相關(guān)或無(wú)相關(guān)(圖7A，r=0.076,P=0.342)，與其余4組基礎(chǔ)放電頻率相關(guān)系數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

從上往下依次為PaPo(mV)、SCh(mV)的生物電信號(hào)，ECG(mV)和EMG(mV)。

圖3 近日節(jié)律紊亂組腦內(nèi)雙核團(tuán)細(xì)胞外電活動(dòng)和外周生理指標(biāo)同步記錄圖

從上到下依次為delta、theta、beta、gamma、fast波段的神經(jīng)振蕩(mV)。

圖4 近日節(jié)律紊亂組雙核團(tuán)神經(jīng)振蕩同步記錄

A:PaPo，B:SCh，橫坐標(biāo)為截取的放電信號(hào)時(shí)間長(zhǎng)度，縱坐標(biāo)為放電頻率。

圖5 模型組雙核團(tuán)的放電頻率直方圖

1.模型組;2.近日節(jié)律紊亂組;3.模型+近日節(jié)律紊亂組;4.假手術(shù)組;5.正常組;

圖6 5組雙核團(tuán)的放電頻率比較

組別ndeltathetabetagammafast正常組6802±809420±477510±6322168±2482229±227假手術(shù)組71276±2799757±17371381±2438*5177±1083910557±26121*模型組62567±24102032±16527298±6808#28586±40924143083±214744#近日節(jié)律紊亂組71426±33861131±24311215±2624*1845±26713378±180*模型+近日節(jié)律紊亂組6903±640423±320758±1082*4203±42671279±1542*F0.5351.0654.2012.3032.755P0.7110.3930.0090.0840.048

*與模型組比較：P<0.05；#與正常組比較：P<0.05。

組別ndeltathetabetagammafast正常組6707±695257±285207±1872795±355382±521假手術(shù)組73218±2763#1394±1350#3542±47196125±88177024±15881模型組6820±741△506±547△2026±33969225±1357886065±157284近日節(jié)律紊亂組7692±1003△285±379△242±2825096±11756414±453模型+近日節(jié)律紊亂組6817±561△248±177△177±154499±543541±312F3.8293.1932.1400.7851.860P0.0140.0290.1030.5450.147

△與假手術(shù)組比較：P<0.05；#與正常組比較：P<0.05。

A：正常組；B：假手術(shù)組；C：模型組；D：近日節(jié)律紊亂組；E：模型+近日節(jié)律紊亂組。

圖7 5組PaPo和SCh放電頻率的相關(guān)性分析

2.3 外周生理指標(biāo)比較 生理指標(biāo)各組相似(P>0.05)。

3 討論

研究表明室旁核是雌激素的關(guān)鍵核團(tuán)[13]和下丘腦重要的神經(jīng)內(nèi)分泌核團(tuán)。視交叉上核是生物節(jié)律中樞[14]。研究表明促覺(jué)醒環(huán)路的成員含室旁核[15]。室旁核放電頻率結(jié)果顯示，模型組和模型+近日節(jié)律紊亂組比假手術(shù)組和正常組放電頻率高，即證明CMS模型的成功，也提示生物節(jié)律對(duì)室旁核有一定影響。另視交叉上核放電頻率結(jié)果顯示，正常組低于其余4組，表明近日節(jié)律紊亂模型成功。基于手術(shù)后褪黑素分泌紊亂[16]，在結(jié)果中假手術(shù)組高于正常組，證明術(shù)后對(duì)節(jié)律有影響。雙核團(tuán)放電頻率比較發(fā)現(xiàn)模型+近日節(jié)律紊亂組與近日節(jié)律紊亂組、模型組比較均無(wú)差異，說(shuō)明更年期綜合征和近日節(jié)律紊亂是兩個(gè)獨(dú)立因素，各自產(chǎn)生影響。

鑒于大腦在不同時(shí)空尺度的局部場(chǎng)電位、腦電等神經(jīng)電生理活動(dòng)信息的傳遞與交流機(jī)制的研究[17]。故探究雌激素分泌相關(guān)腦區(qū)[13]的神經(jīng)振蕩的影響中，模型組的beta和fast振蕩能量顯著高于其他組別。由于beta振蕩主要調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)中動(dòng)作電位的時(shí)間同步性[18]，是抑制運(yùn)動(dòng)的振蕩[19]。女性更年期易發(fā)多種疾病,包含骨質(zhì)疏松癥[20]，其會(huì)阻礙運(yùn)動(dòng)，進(jìn)一步佐證了模型組會(huì)增加beta振蕩能量且高于其余4組。fast振蕩多研究應(yīng)用于癲癇疾病[21]，研究表明雌激素具有延遲癲癇發(fā)作的作用[22]，故雙側(cè)卵巢摘除后雌激素水平下降，相關(guān)腦區(qū)的fast振蕩能量會(huì)高于其余4組。手術(shù)是一種應(yīng)激原,因術(shù)后疼痛及并發(fā)癥等原因,患者睡眠質(zhì)量常受到影響[23]，delta振蕩和theta振蕩與睡眠相關(guān)，在探究生物節(jié)律相關(guān)腦區(qū)[14]的神經(jīng)振蕩影響時(shí)，手術(shù)確實(shí)顯著增加了delta和theta振蕩能量。

結(jié)果顯示正常組PaPo和SCh放電頻率基礎(chǔ)值之間相關(guān)性弱，與其余4組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明正常組在這幾種條件刺激下會(huì)提高PaPo和SCh的正相關(guān)關(guān)系；模型+近日節(jié)律紊亂組PaPo和SCh放電頻率基礎(chǔ)值之間相關(guān)性強(qiáng)，與其余4組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見(jiàn)近日節(jié)律紊亂可能通過(guò)改變PaPo和SCh的相關(guān)性而影響CMS的心理生理學(xué)特征。但是引起PaPo和SCh相關(guān)關(guān)系發(fā)生改變的具體機(jī)制，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)闡明。綜上暗示了CMS對(duì)大鼠心理和生理方面的影響，也為進(jìn)一步關(guān)注夜班人員的身心健康和CMS治療提供理論依據(jù)，為室旁核和視交叉上核的進(jìn)一步密切關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)。