朱健偉，李玉娟

（樂(lè)山市中醫(yī)醫(yī)院 1.肺病科，2.腎病科，四川 樂(lè)山 614000）

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA）屬于一類(lèi)進(jìn)行性系統(tǒng)性自身免疫疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多累及肺臟[1]。有研究顯示，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)間質(zhì)性肺疾?。╮heumatoid arthritis related interstitial lung disease, RA-ILD）是導(dǎo)致RA患者死亡的主要原因之一[2]。因此，加強(qiáng)RA-ILD的早期篩查，及時(shí)給予防治措施，是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。但由于RA-ILD起病隱匿，發(fā)病早期缺乏典型的臨床指征，診斷困難[3]。肺活檢創(chuàng)傷性較大，取材受限；肺部高分辨CT（high resolution computer tomography, HRCT）不僅檢查成本高，而且RA-ILD患者發(fā)病早期的影像學(xué)特征不典型，易發(fā)生誤診[4]。MicroRNAs（miRNAs）屬于一類(lèi)小的非編碼RNA，可參與多種疾病的生理過(guò)程[5]。而且循環(huán)miRNAs具有高度的穩(wěn)定性和特異性，分離和檢測(cè)操作簡(jiǎn)單易行，對(duì)疾病的診斷具有其獨(dú)特的臨床優(yōu)勢(shì)。既往已有動(dòng)物[6]和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[7]證實(shí)，miR-200c在肺纖維化過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本項(xiàng)研究旨在探討RAILD患者血清miR-200c表達(dá)水平與肺間質(zhì)纖維化評(píng)分的相關(guān)性，探討兩者對(duì)RA-ILD患者的早期診斷價(jià)值，以及與間質(zhì)病變程度的相關(guān)性，從而為臨床早期診斷和治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月—2018年8月在樂(lè)山市中醫(yī)醫(yī)院肺病科就診的RA患者87例作為研究對(duì)象（RA組）。其中，男性26例，女性61例；年齡21～78歲，平均（58.65±10.44）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有RA患者符合2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟制定的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；②年齡≥18歲，男女不限；③臨床資料及治療過(guò)程完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①由環(huán)境、物理因素、藥物因素、吸煙、塵肺及吸入有機(jī)藥物等因素引起的間質(zhì)性肺疾?。╥nterstitial lung disease, ILD）以及特發(fā)性ILD；②伴有明確診斷的其他自身免疫性疾??；③有惡性腫瘤、肺結(jié)核、慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴(kuò)張及肺部急慢性感染等呼吸系統(tǒng)疾病史。根據(jù)臨床癥狀、胸部HRCT及X射線檢查評(píng)估結(jié)果，將RA組分為RA-ILD組34例及非ILD組53例。RA-ILD組符合2002年美國(guó)胸科協(xié)會(huì)和歐洲呼吸學(xué)會(huì)達(dá)成共識(shí)的相應(yīng)的RA-ILD分類(lèi)診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，并且為ILD初診患者。其中，男性14例，女性20例；年齡41～78歲，平均（61.36±7.82）歲。非ILD組男性12例，女性41例；年齡21～77歲，平（56.81±10.70）歲。另選取同期30例健康志愿者作為對(duì)照組。其中，男性9例，女性21例；年齡33～75歲，平均（59.12±11.34）歲。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵從赫爾辛基宣言原則，并通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集分析患者的年齡、性別、體重指數(shù)（BMI）、病程、吸煙史、臨床癥狀和體征等。

1.2.2 生物化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)白細(xì)胞（WBC）、血小板（PLT）、紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate, ESR）、免疫球蛋白及類(lèi)風(fēng)濕因子（rheumatoid factor, RF）等生物化學(xué)指標(biāo)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）采用Trizol法提取血液總RNA；進(jìn)一步采用mirPremier? microRNA Isolation Kit（美國(guó)Sigma公司） 試劑盒分離miRNAs，根據(jù)SuperScript RT Kit（日本TaKaRa公司）說(shuō)明書(shū)合成cDNA。以細(xì)胞或組織cDNA為模板，以小分子U6作為內(nèi)參。按照SYBR Green PCR Master Mix（美國(guó)Thermo-Fisher公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共計(jì)40次循環(huán)，60℃繼續(xù)延伸5 min。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的資料設(shè)計(jì)引物，由武漢金凱瑞生物工程有限公司合成。根據(jù)使用說(shuō)明調(diào)整基線，將閾值設(shè)定在熒光值對(duì)數(shù)圖的線性部分，從軟件中讀取Ct值。ΔCt=樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-（隨機(jī)陰性對(duì)照樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值），以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 肺功能檢查采用FGC-A+型全自動(dòng)肺功能測(cè)試儀（蘇州同科科教設(shè)備有限公司）測(cè)試患者的肺部功能，包括通氣功能和一氧化氮彌散功能（diffusion rate for carbon monoxide, DLCO）。肺通氣功能損害程度分級(jí)為①輕度：1秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second, FEV1）≥80%；②中度：FEV1 50%～＜80%；③重度：FEV1＜50%。DLCO損害程度分級(jí)為①輕度：DLCO 60%～＜80%；②中度：DLCO 40%～＜60%；③重度：DLCO＜40%。

1.2.5 HRCT采用Asteion 4層螺旋CT（日本東芝公司）進(jìn)行HRCT掃描，HRCT掃描參數(shù)為135 kV，200 mA，軸距掃描，層厚1 mm，層距5 mm，骨窗計(jì)算方法，于主動(dòng)脈弓、隆突、和膈肌上方1 cm 3個(gè)基準(zhǔn)水平各做1×4層掃描。分別計(jì)算3個(gè)層面纖維化占相應(yīng)肺野面積的百分比。根據(jù)毛玻璃影、小葉間隔增厚、蜂窩影的累及范圍進(jìn)行評(píng)分，①0分：無(wú)異常；②1分：累及范圍1%～25%；③2分：累及范圍＞25%～50%；④3分：累計(jì)范圍＞50%～75%；⑤4分：累及范圍＞75%。將評(píng)分相加即為間質(zhì)性肺病評(píng)分。所有HRCT均由2位副主任醫(yī)師以上職稱(chēng)放射科醫(yī)師共同評(píng)分，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）或中位數(shù)和四分位數(shù)間距[M（P25，P75）]表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析或秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)分析用Spearman法，繪制ROC曲線，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA組與對(duì)照組血清miR-200c水平比較

RA組與對(duì)照組血清miR-200c水平分別為（1.35±0.47）和（1.07±0.38），經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.945，P=0.004），RA組高于對(duì)照組。RA-ILD組與非ILD組血清miR-200c水平分別為（1.48±0.32）和（1.24±0.30），經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.547，P=0.001），RAILD組高于非ILD組。

2.2 RA-ILD組與非ILD組一般資料比較

RA-ILD組與非ILD組年齡、BMI、吸煙史及ILD評(píng)分比較，經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），RA-ILD組高于非ILD組。RA-ILD組與非ILD組病程、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)及壓痛關(guān)節(jié)數(shù)比較，經(jīng)秩和檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），RA-ILD組多于非ILD組。RA-ILD組與非ILD組性別、WBC、PLT、ESR、RF、免疫球蛋白G（Immunoglobulin G,IgG）、免疫球蛋白A（Immunoglobulin A, IgA）及免疫球蛋白M（Immunoglobulin M, IgM）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 RA-ILD組與非ILD組一般資料比較

續(xù)表1

2.3 不同肺功能RA-ILD患者血清miR-200c水平比較

檢查肺功能中的通氣功能，34例RA-ILD組患者中，13例為輕度肺通氣功能障礙，12例為中度肺通氣功能障礙，9例為重度肺通氣功能障礙，不同通氣功能患者血清miR-200c水平比較，經(jīng)方差分析，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且兩兩比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

檢查肺功能中的彌散功能，34例RA-ILD組患者中，15例為輕度肺彌散功能障礙，11例為中度肺彌散功能障礙，8例為重度肺彌散功能障礙，不同彌散功能患者血清miR-200c水平比較，經(jīng)方差分析，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且兩兩比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著肺通氣功能障礙和肺彌散功能障礙程度的加重，患者血清miR-200c水平逐漸升高。見(jiàn)表2。

表2 不同肺功能RA-ILD患者血清miR-200c水平比較 （n =34，±s）

表2 不同肺功能RA-ILD患者血清miR-200c水平比較 （n =34，±s）

注：①與輕度者比較，P ＜0.05；②與中度者比較，P ＜0.05。

肺功能 n miR-200c F值 P值通氣功能 輕度 13 1.22±0.27 11.638 0.000 中度 12 1.54±0.26① 重度 9 1.79±0.25①②彌散功能 輕度 15 1.22±0.25 9.971 0.001 中度 11 1.61±0.39① 重度 8 1.78±0.29①②

2.4 RA-ILD患者血清miR-200c水平與ILD評(píng)分的相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，RA-ILD患者血清miR-200c水平與HRCT檢查的ILD評(píng)分呈正相關(guān)（rs=0.889，P=0.000）。見(jiàn)圖1。

圖1 RA-ILD組患者血清miR-200c水平與ILD評(píng)分的相關(guān)性分析

2.5 血清miR-200c診斷RA-ILD的效能分析

繪制ROC曲線分析，血清miR-200c診斷RAILD的AUC為0.787（95% CI：0.687，0.887），敏感性為78.79%（95% CI：0.734，0.792），特異性為62.96%（95% CI：0.601，0.684），約登指數(shù)為0.420，截?cái)嘀禐?.195。見(jiàn)圖2。

圖2 血清miR-200c診斷RA-ILD的ROC曲線

3 討論

RA發(fā)病原因復(fù)雜，是由多種細(xì)胞因子、趨化因子和黏附因子等共同參與的免疫過(guò)程，易侵犯全身血管和結(jié)締組織，尤其以肺臟為主要受累對(duì)象，發(fā)病率高達(dá)20%以上，可能與肺臟具有豐富的血管和結(jié)締組織有關(guān)[10]。但是因肺部受累臨床表現(xiàn)及影像學(xué)特征并不典型，易與常見(jiàn)的原發(fā)性肺部疾病混淆，所以在臨床診療中漏診和誤診率較高。本研究共納入87例RA患者，經(jīng)胸部HRCT和X射線檢查評(píng)估，34例患者發(fā)生ILD，但并非所有RA-ILD患者都表現(xiàn)出典型的臨床癥狀。目前胸部HRCT和X射線檢查是我國(guó)臨床最常使用診斷ILD的金標(biāo)準(zhǔn)。但是多年來(lái)的臨床經(jīng)驗(yàn)證實(shí)，X射線檢查不僅具有輻射性，而且敏感性相對(duì)也較低[11]；HRCT雖然敏感性及特異性均高于X射線，但是檢查費(fèi)用較貴，在縣級(jí)以下的醫(yī)療機(jī)構(gòu)中無(wú)法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模推廣。因此，從我國(guó)現(xiàn)實(shí)國(guó)情和醫(yī)療水平出發(fā)，尋找高?；颊卟⑦M(jìn)行針對(duì)性的監(jiān)測(cè)是最切實(shí)可行的方案之一。

本研究中的RA患者以女性為主，且年齡越高，發(fā)生ILD的風(fēng)險(xiǎn)越大。有研究證實(shí)，＞65歲結(jié)締組織疾病患者發(fā)生ILD風(fēng)險(xiǎn)較≤65歲患者增加4倍以上。其原因可能是隨著年齡增長(zhǎng)，機(jī)體免疫功能下降[12]。另外，BMI、病程、吸煙史及受累關(guān)節(jié)數(shù)量等也是影響RA患者發(fā)生ILD的危險(xiǎn)因素。BMI越高，身體對(duì)關(guān)節(jié)尤其是膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)的壓力越大；而受累關(guān)節(jié)越多，關(guān)節(jié)破壞程度越嚴(yán)重，則機(jī)體內(nèi)炎癥因子、趨化因子及免疫因子等水平越高，更易造成肺損傷[13]。本研究還發(fā)現(xiàn)，RA-ILD組血清miR-200c水平高于非ILD組，并且隨著病情加重，miR-200c表達(dá)水平逐漸升高。

有動(dòng)物研究顯示，肺纖維化模型小鼠的肺泡上皮細(xì)胞中miR-200c表達(dá)上調(diào)，可能與肺纖維化過(guò)程中上皮細(xì)胞間質(zhì)化轉(zhuǎn)化有關(guān)[14]。LIU等[15]也進(jìn)一步證實(shí)，miR-200c主要表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞，是參與肺上皮細(xì)胞間質(zhì)化轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因，通過(guò)調(diào)控下游靶基因ZEB1的轉(zhuǎn)錄和翻譯，促使肺組織發(fā)生纖維化。但是目前臨床研究較少探討miR-200c與ILD的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，RA組血清miR-200c高于對(duì)照組，說(shuō)明miR-200c可能也是參與炎癥反應(yīng)或免疫反應(yīng)的關(guān)鍵分子。RA-ILD組血清miR-200c水平高于非ILD組，而且與肺通氣功能障礙和彌散功能障礙嚴(yán)重程度關(guān)系密切。進(jìn)一步通過(guò)ROC曲線分析miR-200c的診斷效能，發(fā)現(xiàn)血清miR-200c診斷RA-ILD的效能較高。

綜上所述，高齡、超重、RA病史長(zhǎng)、吸煙及受累關(guān)節(jié)數(shù)量多均為RA-ILD發(fā)生的危險(xiǎn)因素。對(duì)有高危因素的RA患者，應(yīng)密切監(jiān)測(cè)，并建議定期行HRCT或X射線檢查復(fù)查，早診斷、早干預(yù)以改善預(yù)后；另外，血清miR-200c水平有望成為RA-ILD患者的有效診斷指標(biāo)，且與患者ILD的嚴(yán)重程度有關(guān)。