徐小存 胡銀燕

摘 要：目的：建立免疫親和柱凈化液相色譜柱后光化學(xué)衍生法測定調(diào)味品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2。方法：樣品經(jīng)甲醇-水（7+3）提取過濾，稀釋后，濾液經(jīng)免疫親和柱凈化，采用HPLC柱后光化學(xué)衍生-熒光檢測器測定其含量。結(jié)果：黃曲霉毒素B1、G1、B2、G2檢出限分別為0.12、0.28、0.04、0.12 μg·kg-1，

其相關(guān)系數(shù)均大于0.999 5，回收率為66%～97%，RSD小于10%。結(jié)論：該方法具有操作簡單、快速、準(zhǔn)確度高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于調(diào)味品中黃曲霉毒素的測定。

關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素;柱后光化學(xué)衍生;調(diào)味品;高效液相色譜;免疫親和柱

Abstract：Objective： To establish a method for the determination of aflatoxin B1， B2， G1， G2 in condiment by immune-affinity column cleaning up and HPLC with post-column photochemical derivation. Methods： Samples were extracted with methanol-water （7+3） solution， the extractions were purified by immune-affinity column after filteration and dilution， separation of aflatoxin were measured by post-column photochemical instrument. Results： the limits of detection of aflatoxin B1、G1、B2 and G2 were 0.12， 0.28， 0.04， 0.12 μg·kg-1 respectively， the correlation coefficient of all aflatoxins was greater than 0.999 5， and the recovery rates were from 66% to 97%， RSD was below 10%. Conclusion： The method is easy， quick， precise and high-sensitive， which is suitable for the determination of aflatoxins in condiments.

Key words：Aflatoxins; Post-column photochemical derivation; Condiment; HPLC; Immune-affinity column

中圖分類號(hào)：O657.7

黃曲霉毒素是一種天然毒素，它的產(chǎn)生與環(huán)境密切相關(guān)。調(diào)味品在日常生活中必不可少，在其加工、運(yùn)輸、存儲(chǔ)過程中易發(fā)生霉變。為保證飲食安全，需建立黃曲霉毒素檢測方法。目前黃曲霉毒素檢測方法有薄層色譜法[1]、酶聯(lián)免疫法[2]、液相色譜法[3]等。本文采用免疫親和柱凈化-光化學(xué)柱后衍生-液相色譜熒光法檢測調(diào)味品中4種黃曲霉毒素。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料。72種調(diào)味品（花椒、辣椒）來自于江西省九江市、區(qū)、縣各超市及集貿(mào)市場，包括散裝及定型包裝;黃曲霉毒素六合一免疫親和柱（IAC-SEP）;甲醇，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;玻璃纖維濾紙（直徑11 cm）;黃曲霉毒素總量標(biāo)準(zhǔn)品（美國SUPELCO，批號(hào)：LB96951）;B1、B2、G1、G2分別為1.039、0.314、1.056、0.288μg·mL-1;實(shí)驗(yàn)用水經(jīng)Water Purifer超純水機(jī)制備，0.45 μm濾膜過濾后使用。

儀器。島津LC-20AT高效液相色譜儀配熒光檢測器，Coloversil HPLC Column 4.6 mm×250 mm，5 μm），購自美國CLOVER;光化學(xué)衍生器（型號(hào)：PHRED美國AURA）;泵流操作架，購自北京中檢維康技術(shù)有限公司;真空泵（型號(hào)：AP-01P VACUUM PUMP，天津奧特賽恩斯儀器有限公司）;渦旋混勻器（型號(hào)：VORTEX-GENIE2，上海易擴(kuò)儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

流動(dòng)相：甲醇-水（45+55）在線混合;流速：1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量：50 μL;柱溫：35 ℃;檢測波長：激發(fā)波長360 nm;發(fā)射波長440 nm。

1.2.2 樣品前處理

（1）樣品提取及稀釋。準(zhǔn)確稱取調(diào)味品粉末2.5 g

于50 mL離心管中，加入1 g氯化鈉，25 mL甲醇-水（7+3），混合均勻。定性濾紙過濾，準(zhǔn)確移取10 mL濾液并加入20 mL純水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，備用。

（2）樣品凈化。將免疫親和柱連接于10 mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取20 mL樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以2 mL·min-1流速緩慢通過免疫親和柱，直至2～3 mL空氣流過柱體。以10 mL水淋洗柱子3次，棄去全部淋出液，并使2～3 mL空氣通過柱體。準(zhǔn)確加入1.0 mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液于玻璃試管中，加入1.0 mL純水，混勻，待測定。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：用甲醇-水（1+1）將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋10倍，至黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2濃度分別為103.9、31.4、105.6、28.8 ng·mL-1。將儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋到適宜的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣液在上述色譜條件下測定，進(jìn)樣量50μL，以保留時(shí)間定性，峰面積定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 光化學(xué)柱后衍生效果

黃曲霉毒素B1、G1具有很強(qiáng)的熒光性，但接觸水后易發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象，熒光性消失液相色譜難以檢測，要用衍生的方法增強(qiáng)其熒光性。用光化學(xué)的方法對(duì)B1、G1進(jìn)行衍生，B2、G2則不受衍生的影響，操作簡單、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，靈敏度高，適用于大批量樣品的檢測。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及標(biāo)準(zhǔn)品圖譜

標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1，標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1。

2.3 方法檢出限及定量限

將0.16 ng·mL-1的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣25 μL進(jìn)行多次測定，其峰高均約為基線噪聲高度的3倍，因此儀器檢出限為0.08 ng·mL-1，方法檢出限為0.12 μg·kg-1，黃曲霉毒素B2、G1、G2的儀器檢出限依次為0.03、0.19、0.08 ng·ml-1，方法檢出限依次為：0.04、0.28、0.12μg·kg-1。B1、B2、G1、G2方法定量限依次為0.4、0.13、0.9、0.4 μg·kg-1。

2.4 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

用不含黃曲霉毒素的花椒和辣椒樣品作為空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，在樣品中分別添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品后，按照樣品前處理步驟進(jìn)行前處理，按照1.2.1色譜條件測定其回收率。每個(gè)加標(biāo)樣品連續(xù)測定6次，結(jié)果見表2、表3。對(duì)被測組分含量小于0.1 mg·kg-1的樣品，回收率范圍應(yīng)在66%～97%，花椒、辣椒回收率均符合要求，該方法精密度高，RSD<10%。

2.5 實(shí)際樣品的測定

采用本法對(duì)72種調(diào)味品進(jìn)行檢測，樣品圖譜基本無干擾雜質(zhì)峰，測定結(jié)果70種調(diào)味品均未檢出黃曲霉毒素，其中有2種檢出黃曲霉毒素B1，含量分別為2.7μg·kg-1、0.6 μg·kg-1，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)暫未對(duì)調(diào)味品花椒、辣椒中真菌毒素限量進(jìn)行規(guī)定[4]。

3 結(jié)論

本方法采用免疫親和柱凈化-柱后光化學(xué)衍生-液相色譜熒光法測定了調(diào)味品中黃曲霉毒素，凈化效果好，方法簡單，適用于大批量樣品中黃曲霉毒素的檢測，同時(shí)該方法也滿足我國對(duì)黃曲霉毒素限量的檢測要求。

參考文獻(xiàn)：

[1]張 鵬，趙衛(wèi)東，張藝兵.高效薄層色譜法測定黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2[J].分析化學(xué)，2000（3）：392.

[2]王彩云，王政綱，云戰(zhàn)友.酶聯(lián)免疫法測定食品和飼料中的黃曲霉毒素[J].食品工程，2007（4）：58-60.

[3]Ibá?ez-Vea M，Corcuera L A，Remiro R，et al.

Validation of a UHPLC-FLD method for the simultaneous quantification of aflatoxins， ochratoxin A and zearalenone in barley[J].Food Chemistry，2011，（1271）：351-358.

[4]國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì) 國家食品藥品監(jiān)督管理總局.GB 2761-2017食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2017.