邵 飛，沈山梅，劉佳怡，張冰潔，喬程程，李憶昆，楊家苗，燕 歌，畢 艷，朱大龍

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院,南京 210008；2. 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院內(nèi)分泌科,南京 210008)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是較常見的引起育齡婦女內(nèi)分泌紊亂的疾病，累及5%～10%的育齡婦女[1]。我國育齡期婦女的患病率約為5.6%[2]。PCOS的特點(diǎn)是排卵功能障礙和雄激素過多，其主要臨床表現(xiàn)為月經(jīng)不調(diào)、多毛癥、痤瘡、脫發(fā)和不孕癥等[3]。但PCOS發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確，胰島素抵抗(insulin resistance，IR)及其代償表現(xiàn)高胰島素血癥(hyperinsulinism，HI)在PCOS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[4]，慢性炎癥、卵巢間質(zhì)纖維化也與PCOS發(fā)病有著密切關(guān)系[5]。卵泡細(xì)胞間隙增大，間質(zhì)膠原纖維增多是引起PCOS患者卵泡發(fā)育的重要生理病理原因之一[6]。轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-beta TGF-β1)、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)能夠促進(jìn)卵巢纖維化，導(dǎo)致卵巢功能下降[7]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討津力達(dá)顆粒對(duì)模型大鼠卵巢TGF-β1、CTGF表達(dá)的改變，以期為津力達(dá)顆粒治療PCOS提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及飼料

50只體質(zhì)量為40～50 g清潔級(jí)21 d齡雌性SD大鼠，購買于南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物繁殖中心，飼養(yǎng)于南京鼓樓醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)室溫度(23±2)℃，相對(duì)濕度40%～60%，光照時(shí)間每天9∶00～21∶00，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由攝食飲水。動(dòng)物墊料及飼料均由南京鼓樓醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 藥物及試劑

注射用脫氫表雄酮(購自武漢華美華科技(集團(tuán))有限公司上海分公司)；二甲雙胍(購自中美上海施貴寶制藥有限公司)；注射用油劑(購自安徽宇博化工有限公司)；津力達(dá)顆粒(購自石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司)；SYBR green(購自美國ABI生物公司)；GAPDH、TGF-β1、CTGF兔抗鼠源性一抗(購自Santa CRUZshen生物公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗(購自武漢博士生物科技公司)；PCR引物(北京奧科生物有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型建立 SD大鼠常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨機(jī)取40只，于頸背部皮下注射DHEA(6 mg/100 g)+ 注射用油劑(0.2 mL)，連續(xù)20 d。20 d后在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠的陰道涂片，連續(xù)4 d，即大鼠的1個(gè)動(dòng)情周期。觀察到大鼠陰道上皮持續(xù)角化，失去動(dòng)情周期則造模成功，否則為造模失敗應(yīng)予剔除。同時(shí)模型組隨機(jī)處死4只大鼠，行卵巢HE染色，以進(jìn)一步證實(shí)造模結(jié)果。

1.3.2 動(dòng)物分組及給藥 造模第21天后給藥，將成模大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、津力達(dá)組、二甲雙胍組及津力達(dá)+二甲雙胍組。藥物干預(yù)組給予相對(duì)應(yīng)藥物灌胃：二甲雙胍0.265 g/(kg·d)以265 mg/mL溶于生理鹽水中；津力達(dá)顆粒 50 mg/(kg·d)以10 mg/mL溶于生理鹽水中，每日1次灌胃，連續(xù)28 d(約7個(gè)大鼠動(dòng)情周期)?？瞻捉M和模型組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)28 d。模型組及各藥物干預(yù)組持續(xù)皮下注射DHEA，以防止其自身恢復(fù)排卵。

1.3.3 血清中TGF-β1、CTGF水平測定 腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，下腔靜脈取血4～5 mL，以3000 r/min離心10 min，留取上清。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELASA法)檢測血清中TGF-β1、CTGF、INS，最低檢測濃度分別為<0.1 ng/mL、<0.1 ng/mL、<0.1 mU/L。各指標(biāo)板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。取出反應(yīng)板，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫浴并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色，顏色的深淺和樣品呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD 值)，計(jì)算樣品濃度。

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測卵巢TGF-β1、CTGF蛋白表達(dá) 將冰凍的卵巢組織解凍并稱量重量，加入組織裂解液提取蛋白。取30ug蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯模，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入1∶2000稀釋的GAPDH抗體、TGF-β1抗體、CTGF抗體，4 ℃過夜。第2天洗膜后加入1∶5000稀釋二抗，室溫孵育1 h再次洗膜，最后采用化學(xué)發(fā)光試劑盒暗室顯影。

1.3.5 qRT-PCR檢測卵巢TGF-β1、CTGF mRNA表達(dá) Trizol法提取卵巢組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA, qRT-PCR采用Syber Green I GoTaq qPCR Master Mix試劑盒，檢測卵巢TGF-β1、CTGF mRNA表達(dá), 以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參。TGF-β1 Forward 5’-TGAGTGGCTGTCTTTTGACG- 3’，Reverse 5’-TGGGACTGATCCCATTGATT- 3’；CTGF Forward 5’-GGGCCTCTTCTGCGATTC-3’， Reverse 5’- ATCCAGGCAAGTCAGGTA- 3’；GAPDH Forward 5’-TGGATTTGGACGCATTGGTC- 3’，Reverse 5’- TTTGCACTGGTACGTGTTGAT- 3’。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 SD大鼠造模結(jié)果評(píng)估

圖1顯示，空白組模型大鼠陰道涂片可見大量核上皮細(xì)胞、角化上皮以及白細(xì)胞，提示空白組大鼠存在動(dòng)情周期變化；模型組大鼠陰道涂片僅見大量白細(xì)胞，提示模型組大鼠失去動(dòng)情周期變化。空白組大鼠卵巢HE染色未見卵巢多囊樣變，可見卵母細(xì)胞及其周圍原始卵泡，以及不同發(fā)育階段的卵泡及多個(gè)黃體，顆粒細(xì)胞呈多層，形態(tài)完整，排列整齊。其余各組大鼠卵巢HE染色，見卵巢呈多囊樣改變，卵泡體積增大，閉鎖卵泡增多，顆粒層細(xì)胞減少，卵泡細(xì)胞之間間隙增大。本實(shí)驗(yàn)中SD大鼠均造模成功。

2.2 各組血清TGF-β1、CTGF水平

表1顯示，模型組TGF-β1、CTGF水平較空白組顯著升高(P<0.01)，各治療組TGF-β1水平較模型組均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，二甲雙胍組血清CTGF較模型組降低(P<0.05)；津力達(dá)+二甲雙胍組血清CTGF較模型組顯著降低(P<0.01)。

表1 各組TGF-β1、CTGF血清學(xué)結(jié)果比較

注：正常對(duì)照組比較：△P<0.01；與模型組比較：#P<0.05

2.3 各組卵巢TGF-β1、CTGF蛋白表達(dá)及mRNA水平

圖2表2顯示，模型組TGF-β1、CTGF蛋白表達(dá)及mRNA水平較空白組增高(P<0.05)；二甲雙胍組、津力達(dá)+二甲雙胍組卵巢TGF-β1、CTGF蛋白表達(dá)及mRNA水平低于模型組(P<0.05)；津力達(dá)組卵巢TGF-β1蛋白表達(dá)低于模型組(P<0.05)，在TGF-β1、CTGF mRNA水平低于模型組(P<0.05)。

注：1：空白組；2：模型組；3：津力達(dá)組；4：二甲雙胍組；5：津力達(dá)+二甲雙胍組圖2 各組大鼠卵巢組織中TGF-β1、CTGF表達(dá)比較

表2 各組TGF-β1、CTGF蛋白及mRNA表達(dá)結(jié)果比較

注：正常對(duì)照組比較:△P<0.01；與模型組比較:#P<0.05

3 討論

PCOS的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，與遺傳及環(huán)境因素密切相關(guān)，涉及神經(jīng)內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[8]。近年研究表明，卵巢纖維化是多囊卵巢因素的發(fā)病機(jī)制之一，主要引起卵巢結(jié)構(gòu)破壞和功能紊亂[9]。卵巢纖維化可由不同因素引起，如手術(shù)、炎癥以及免疫異常。在組織修復(fù)期間，細(xì)胞因子如TGF-β1、CTGF等相互作用促進(jìn)ECM沉積，最終引起卵巢纖維化的發(fā)生發(fā)展。Wang等研究發(fā)現(xiàn)，在DHEA誘導(dǎo)的大鼠卵巢中，纖維蛋白和膠原蛋白具有更高的水平，而主要纖維化標(biāo)志物如TGF-β1、CTGF明顯上調(diào)[6]。本研究結(jié)果提示，在造模結(jié)束后模型組大鼠陰道上皮持續(xù)角化，失去動(dòng)情周期；同時(shí)HE染色鏡下可見卵巢多囊樣變,卵泡腔增大，白膜明顯增厚，閉鎖卵泡增多，顆粒細(xì)胞層減少；卵巢組織蛋白水平提示模型組TGF-β1、CTGF顯著高于空白組，提示PCOS模型制造成功。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，PCOS發(fā)病三臟功能失調(diào)及痰濕、瘀血、內(nèi)熱等多種病理因素有關(guān)。PCOS患者卵巢在病變初期表現(xiàn)為脾虛濕盛，脾失健運(yùn)，水濕內(nèi)停，聚濕成痰，久則濕熱內(nèi)蘊(yùn)、濕熱交阻、灼津?yàn)樘?；病至后期，則內(nèi)生痰濁、痰瘀互結(jié)、郁阻血脈、膠固難除。肝脾腎功能不全以及痰、瘀、濕等停聚于卵巢可引起卵巢增大、卵泡發(fā)育不全以及局部炎癥因子增多引起卵泡細(xì)胞間隙增大、間質(zhì)膠原纖維增生等變化。津力達(dá)顆粒由人參、黃精、麩炒蒼術(shù)、苦參、麥冬、地黃、制何首烏、山茱萸、茯苓、佩蘭、黃連、知母、炙淫羊藿、丹參、粉葛、荔枝核、地骨皮等17味中藥組成，以益氣養(yǎng)陰、健脾運(yùn)津兼以補(bǔ)腎活血祛瘀。痰、瘀、濕等病理因素改善，一定程度可改善卵巢病理變化。本研究中，模型組TGF-β1、CTGF水平在血清學(xué)水平、蛋白及mRNA水平要明顯高于空白組。TGF-β1水平異常升高可引起卵泡發(fā)育不良和排卵障礙[9]。Lee等研究表明，TGF-β1表達(dá)的降低可防止DHEA誘導(dǎo)的高雄激素狀態(tài)[12]。CTGF是目前所發(fā)現(xiàn)的與PCOS相關(guān)且較為重要的生長因子之一。既往研究發(fā)現(xiàn)，CTGF在PCOS模型大鼠中的卵巢顆粒細(xì)胞中高表達(dá)[13]。國內(nèi)學(xué)者證實(shí)，CTGF在PCOS模型大鼠中高表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)抑制CTGF的表達(dá)可通過PI3K/AKT通路降低顆粒細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[14]，以及促進(jìn)組織修復(fù)功能和恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)功能。CTGF是TGF-β1的下游反應(yīng)元件，與TGF-β1相似的生物學(xué)功能，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞的表達(dá)黏附分子，促進(jìn)膠原蛋白合成和特定細(xì)胞分泌ECM[15-16]。TGF-β1和CTGF之間的相互作用調(diào)節(jié)組織纖維化的發(fā)展和進(jìn)展[17]。TGF-β1誘導(dǎo)的CTGF進(jìn)一步作用于間充質(zhì)成纖維細(xì)胞，通過旁分泌機(jī)制反過來刺激TGF-β1的分泌。纖維發(fā)生時(shí)發(fā)生，過表達(dá)TGF-β1上調(diào)表達(dá)其下游反應(yīng)元件CTGF和刺激物ECM的生產(chǎn)，二者相互影響并進(jìn)一步促進(jìn)膠原蛋白生成的增加并加速發(fā)展。阻斷TGF-β1可抑制TGF-β1信號(hào)通路，阻止纖維化的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，津力達(dá)顆粒干預(yù)后大鼠血清TGF-β1及CTGF有降低趨勢(shì)，與二甲雙胍聯(lián)用二者降低趨勢(shì)更加明顯。卵巢組織蛋白及mRNA水平也提示，津力達(dá)顆粒能夠降低TGF-β1、CTGF表達(dá)，與單用二甲雙胍組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與二甲雙胍聯(lián)用后可顯著降低TGF-β1、CTGF水平。

綜上所述，DHEA誘導(dǎo)的PCOS模型大鼠經(jīng)津力顆粒達(dá)干預(yù)后TGF-β1、CTGF水平明顯下降，提示津力達(dá)對(duì)PCOS的卵巢纖維化有一定預(yù)防和改善作用，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)卵巢組織中TGF-β1、CTGF的表達(dá)水平。