殷少文，葉世蕓，趙琳珺，王維，鄭立肯

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，貴陽(yáng) 550000)

風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatic arthritis)及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)屬于中醫(yī)“痹癥”范疇[1]，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、變形伴有晨僵，發(fā)病率和致殘率高[2-3]。其病因復(fù)雜，誘導(dǎo)因素眾多，且可引發(fā)心理障礙，如抑郁癥和焦慮癥[4]。目前西醫(yī)對(duì)該病以對(duì)癥治療為主，通過(guò)解熱、鎮(zhèn)痛、消除關(guān)節(jié)腫脹等緩解病情。除常規(guī)用藥和手術(shù)治療外，還可采用自體干細(xì)胞移植、T細(xì)胞疫苗以及間充質(zhì)干細(xì)胞治療，但使用范圍受到很大限制[5-7]。中醫(yī)藥對(duì)于“痹癥”“尪痹”“歷節(jié)”等的治療有獨(dú)特理論體系，并且在臨床取得良好的治療效果。

強(qiáng)筋祛濕液基于“虛邪淤”理論，以補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕、止痹痛、散淤血、消腫痛為治療原則，處方由防己、川牛膝、尋骨風(fēng)、松節(jié)、羌活、續(xù)斷、杜仲、海風(fēng)藤、路路通、紅花等藥組成，具有祛風(fēng)除濕、活血化瘀之功效，臨床用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、關(guān)節(jié)腫脹、皮下?lián)p傷淤血、皮膚擦傷潰破等。該處方及工藝已經(jīng)獲得國(guó)家專利技術(shù)[8]。但處方缺乏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及藥效學(xué)研究，僅限于門(mén)診使用。筆者在本實(shí)驗(yàn)建立該藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以期達(dá)到質(zhì)量可控、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)明確、推廣有據(jù)的目的。

1 薄層色譜(TLC)實(shí)驗(yàn)

1.1儀器與試藥 CAMAG Reprostar3薄層色譜成像系統(tǒng)、LINOMAT V半自動(dòng)點(diǎn)樣儀(瑞士卡瑪公司)。防己對(duì)照藥材(批號(hào)：120919-200304)、延胡索對(duì)照藥材(批號(hào)：120928-201007)、獨(dú)活對(duì)照藥材(批號(hào)：120940-200809)、何首烏對(duì)照藥材(批號(hào)：120934-201009)、丁香對(duì)照藥材(批號(hào)：121039-201304)、川牛膝對(duì)照藥材(批號(hào)：121065-200503)、杯莧甾酮對(duì)照品(批號(hào)：111804-201504，含量≥99%)、丁香酚對(duì)照品(批號(hào)：110725-201414，含量≥99%)、2，3，5，4-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品(批號(hào)：110844-200404，含量≥99%)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。強(qiáng)筋祛濕液(貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心制備，批號(hào)：20150501，20150502，20150503)，其他試劑均為分析純。

1.2方法與結(jié)果

1.2.1防己的TLC鑒別 取強(qiáng)筋祛濕液10 mL，水浴蒸干，殘?jiān)右掖? mL溶解，作為供試品溶液；另取防己對(duì)照藥材0.35 g，加乙醇10 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，濾液作為對(duì)照藥材溶液。按處方工藝，取缺防己藥材的強(qiáng)筋祛濕液，按供試品溶液處理方式，得缺防己的陰性溶液。

吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液和缺防己的陰性溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-甲醇-5%濃氨試液(6：1：1：0.1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同的橙色斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。

1.供試品；2.陰性對(duì)照；3.對(duì)照藥材。

1.test sample；2.negative control；3.medicinal material control.

Fig.1TLCofStepheniaTephtetrandra

1.2.2延胡索的TLC鑒別 取強(qiáng)筋祛濕液20 mL，水浴蒸干，殘留加水10 mL使溶解，加濃氨水調(diào)pH值至10，乙醚振搖萃取3次，每次10 mL，合并乙醚，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；另取延胡索對(duì)照藥材0.35 g，加乙醇10 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，濾液作為對(duì)照藥材溶液。按處方工藝，取缺延胡索藥材的強(qiáng)筋祛濕液，按供試品溶液處理方式，得缺延胡索的陰性溶液。

吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、陰性溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮(9：2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置碘缸中3 min后取出，揮盡板上吸附的碘，紫外燈(波長(zhǎng)365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯亮綠色熒光斑點(diǎn)，陰性溶液無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖2。

1.2.3獨(dú)活的TLC鑒別 取強(qiáng)筋祛濕液25 mL，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，超聲處理30 min，作為供試品溶液。另取獨(dú)活對(duì)照藥材0.35 g，加甲醇10 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，作為對(duì)照藥材溶液；按處方工藝，制備缺獨(dú)活藥材的強(qiáng)筋祛濕液，按供試品溶液處理方式，得缺獨(dú)活的陰性溶液。

吸取供試品、對(duì)照藥材和陰性溶液各20 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(15：15：4)為展開(kāi)劑，展開(kāi)2次，取出，晾干，紫外光燈(波長(zhǎng)365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的粉色熒光斑點(diǎn)，陰性溶液無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖3。

1.供試品；2.陰性對(duì)照；3.對(duì)照藥材。

1.test sample；2.negative control；3.medicinal material control.

Fig.2TLCofRhizomaCorydalis

1.2.4何首烏的TLC鑒別 取強(qiáng)筋祛濕液25 mL，水浴蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。另取何首烏對(duì)照藥材0.35 g，加乙醇10 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，濾液作為對(duì)照藥材溶液。按處方工藝，取缺何首烏藥材的強(qiáng)筋祛濕液，按供試品溶液處理方式，得缺何首烏的陰性溶液。取2，3，5，4-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每毫升含0.2 mg的溶液，即得對(duì)照品溶液。

吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液和陰性溶液各20 μL、對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(7：3)為展開(kāi)劑，展至約3.5 cm，取出，晾干，再以三氯甲烷-甲醇(10：1)為展開(kāi)劑，展至約7 cm，取出，晾干，紫外光燈(波長(zhǎng)365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同藍(lán)色的熒光斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖4。

1～3.供試品；4.對(duì)照藥材；5.陰性對(duì)照。

1-3.test sample；4.medicinal material control；5.negative control.

Fig.3TLCofradixangelicaepubescentis

1～3.供試品；4.對(duì)照藥材；5.二苯乙烯苷；6.陰性對(duì)照。

1-3.test sample；4.medicinal material control；5.stilbene glycoside；6.negative control.

Fig.4TLCofpolygonummultiflorum

1.2.5丁香的TLC鑒別 取強(qiáng)筋祛濕液25 mL，加石油醚(60～90 ℃)5 mL，搖勻，靜置至完全分層，取上層液，作為供試品溶液；另取丁香對(duì)照藥材0.35 g，加乙醇10 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，濾液作為對(duì)照藥材溶液。

按處方工藝，取缺丁香藥材強(qiáng)筋祛濕液25 mL，按供試品溶液制備方法制備，得缺丁香的陰性溶液。取丁香酚對(duì)照品適量，精密稱定，加石油醚(60～90 ℃)制成每毫升含2 mg溶液，即得對(duì)照品溶液。

吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液和陰性溶液各20 μL、對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(9：1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，紫外燈(波長(zhǎng)365 nm)下檢視[6]，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同淡綠色熒光斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖5。

1～3.供試品；4.對(duì)照藥材；5.丁香酚；6.陰性對(duì)照。

圖5 處方中丁香的薄層色譜圖

1-3.test sample； 4.medicinal material control； 5.eugenol； 6.negative control.

Fig.5TLCofSyzygiumaromaticum

1.2.6川牛膝的TLC鑒別 取強(qiáng)筋祛濕液25 mL，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，加于中性氧化鋁柱上(100～200目，3.5 cm，內(nèi)徑2 cm)，用甲醇-乙酸乙酯(1：1)40 mL洗脫，收集洗脫液，水浴揮干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，定容? mL，即得，作為供試品溶液。另取川牛膝對(duì)照藥材0.35 g，加甲醇10 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，濾液作為對(duì)照藥材溶液。按處方工藝，取缺川牛膝的強(qiáng)筋祛濕液，按供試品溶液制備方法制備，得缺川牛膝的陰性溶液。取杯莧甾酮對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含25 μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。

分別吸取供試品、對(duì)照藥材、陰性溶液各20 μL，對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(10：1.5：0.3)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，白熾燈下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同紅褐色斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖6。

1～3.供試品；4.川牛膝對(duì)照藥材；5.杯莧甾酮；6.陰性對(duì)照。

圖6 川牛膝薄層色譜圖

1-3.test sample； 4.SichuanAchyranthes bidentata control；5.amaranth；6.negative control.

Fig.6TLCofCyathulaofficinaliskuam

2 高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定粉防己堿

2.1儀器與試藥 Agilent1260(美國(guó)安捷倫科技有限公司)，Agilent1260 series(色譜工作站，美國(guó)安捷倫科技有限公司)，DAD檢測(cè)器(型號(hào)：G4212-60008)，XS205電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司，感量：0.01 mg)，CH-250 型超聲波清洗機(jī)(天津恒奧科技公司)，粉防己堿對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110711-200708，含量≥99%)，其余試劑均為分析純。

2.2方法與結(jié)果

2.2.1色譜條件 Agilent C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-磷酸二氫鉀(0.03 mol·L-1)(70：5：25)；流速：1.0 mL·min-1。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備 取粉防己堿適量，精密稱定，置25 mL量瓶，加甲醇定容配制成粉防己堿濃度為0.62 mg· mL-1對(duì)照品母液，再稀釋成所需濃度。

2.2.3供試品溶液的制備 精密量取強(qiáng)筋祛濕液25 mL，置水浴鍋上揮干，殘?jiān)蛹状级ㄈ葜?0 mL，作為供試品溶液。

2.2.4專屬性考察 取除去防己后處方規(guī)定的其余藥材(藥品量為處方量的1/10)，按處方工藝，制成缺味陰性供試品。精密量取缺防己的強(qiáng)筋祛濕液25 mL，按照供試液制備的方法處理。HPLC分析結(jié)果顯示粉防己堿無(wú)陰性干擾，結(jié)果見(jiàn)圖7。

2.2.5線性關(guān)系考察 精密吸取不同濃度對(duì)照品溶液，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以對(duì)照品濃度(C，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算并求得粉防己堿的濃度和峰面積的線性關(guān)系為：Y=4 216.1X-12.193(r=0.999 7)，濃度在0.073 8～0.246 0 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取粉防己堿對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，粉防己堿平均峰面積為513.7，RSD為0.93%，表明精密度良好。

2.2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批供試品(批號(hào)：20150502)，每份25 mL，精密量取，按供試品溶液制備方法制備，測(cè)定含量，粉防己堿平均含量為0.10 μg·mL-1，RSD為2.5%(n=6)，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

A.粉防己堿；B.強(qiáng)筋祛濕液樣品；C.陰性對(duì)照。

2.2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10 μL，分別于0，4，8，12，16 h，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，其平均峰面積為291.73，RSD為1.3%(<3.0%)。表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.9加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知粉防己堿含量的同一供試品9份，每份5 mL，精密量取，分別精密加入已知粉防己含量的50%，100%，150%對(duì)照品。按供試品溶液處理，測(cè)定含量，加樣回收率在95%～105%，符合含量測(cè)定要求，該方法可行，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 粉防己堿加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.10樣品含量測(cè)定 量取不同批號(hào)強(qiáng)筋祛濕液各25 mL，按供試品處理方法處理樣品。吸取樣品注入高效液相色譜儀，進(jìn)樣量5 μL。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 強(qiáng)筋祛濕液含量測(cè)定結(jié)果

Table.2ContentdeterminationofQiangjinqushiye

批號(hào)取樣量/mL峰面積含量/(μg·mL-1)20150501251 0550.1020150502259740.0920150503259410.09

3 討論

筆者在本實(shí)驗(yàn)建立了強(qiáng)筋祛濕液處方中防己、延胡索、獨(dú)活、何首烏、丁香、川牛膝藥材的TLC鑒別和粉防己堿的含量測(cè)定方法。通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)，可以達(dá)到對(duì)強(qiáng)筋祛濕液質(zhì)量的控制。

粉防己堿屬于雙芐基異喹啉類生物堿，是天然鈣通道阻斷藥，具有消炎鎮(zhèn)痛作用，被廣泛應(yīng)用于心血管系統(tǒng)和炎性疾病的防治[9-10]。粉防己堿是強(qiáng)筋祛濕液藥效物質(zhì)，治療風(fēng)濕痹痛癥時(shí)可能機(jī)制是抑制炎癥因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、iNOS的釋放而起到鎮(zhèn)痛抗炎效果[11]。粉防己堿通過(guò)對(duì)心肌缺血-再灌注過(guò)程中炎癥因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-6的影響減輕缺血-再灌注損傷，也可抑制NLRP3、caspase-1、IL-1β表達(dá)[12]。并且粉防己堿可以抑制NLRP3炎性小體活化，減輕肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織炎性浸潤(rùn)，對(duì)肺動(dòng)脈高壓具有一定逆轉(zhuǎn)作用[13]。烏司他丁聯(lián)合粉防己堿對(duì)HIRI具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化作用、增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化能力及下調(diào)肝組織中NF-κB p65表達(dá)有關(guān)[14]。由此可見(jiàn)，強(qiáng)筋祛濕液中粉防己堿對(duì)風(fēng)濕痹痛的治療是多靶點(diǎn)的，是該制劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

處方中延胡索、獨(dú)活、何首烏、丁香、川牛膝都具有祛風(fēng)濕、止痹痛、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨作用?，F(xiàn)代藥理研究表明，延胡索、獨(dú)活通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)對(duì)多種痛癥具有良好的緩解效果[15-17]。何首烏具有降血脂、抗炎、增強(qiáng)免疫功效[18-19]。丁香及其主要成分丁香酚具有抗氧化、殺菌、解熱鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)記憶、麻醉等多種藥理作用[20-21]。川牛膝中的三萜皂苷對(duì)關(guān)節(jié)炎癥有一定緩解作用[22-23]。

筆者在本實(shí)驗(yàn)中結(jié)合前期藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定上述藥材和粉防己堿進(jìn)行TLC鑒別和含量測(cè)定，能確保該制劑療效的穩(wěn)定性。