劉榮榮，李麗娟，王楠，張海珠

（大理大學(xué) 1.公共衛(wèi)生學(xué)院，2.云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3.藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理 671000）

創(chuàng)傷、燒燙傷及手術(shù)切口等均可導(dǎo)致傷口愈合異常，引起病理性瘢痕的產(chǎn)生，增生性瘢痕（hypertrophic scars,HS）是病理性瘢痕的一種，可引起組織潮紅、瘙癢、疼痛等癥狀，影響美觀，造成局部組織或器官功能障礙，甚至發(fā)生畸形，嚴(yán)重影響患者身心健康及生存質(zhì)量[1-2]。HS 的形成主要是以成纖維細(xì)胞的異常增殖、細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積及膠原蛋白表達(dá)異常為特征[3]。目前其治療方法主要有藥物、手術(shù)、放射、激光及壓迫等，但均無(wú)特效的治療方法[4-5]。因此，尋找預(yù)防和治療的有效方法調(diào)控瘢痕使其增生至適當(dāng)程度，已成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。美洲大蠊含有多種化學(xué)成分，具有抗肝纖維化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛，增強(qiáng)免疫、保肝，促進(jìn)血管增生、組織修復(fù)等作用[6-10]。本研究以體外培養(yǎng)人胚胎皮膚成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，采用美洲大蠊提取物進(jìn)行干預(yù)，觀察美洲大蠊提取物對(duì)人胚胎皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與藥物

人胚胎皮膚成纖維細(xì)胞株（CCC-ESF-1，編號(hào)：BNCC339675）購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，美洲大蠊提取物（乙醇提?。〦nto-A（黃褐色濃稠 膏狀）、Ento-B、Ento-C 和Ento-D（褐色濃稠膏狀）、Ento-E（黃褐色凍干粉末）、Ento-F（褐色液體）為云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 試劑與耗材

H-DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司），碳酸氫鈉（NaHCO3）、Hepes（北京索萊寶科技有限公司），胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司），0.25%胰蛋白酶（美國(guó)Millipore 公司），噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（美國(guó)Sigma 公司），雙抗青鏈霉素混合液（美國(guó)Millipore 公司），磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國(guó)Hyclone公司）。

1.3 儀器

低速離心機(jī)（SC-2546）（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），多功能酶標(biāo)儀（Spectra Max M2）（美國(guó)Molecular Devices 公司），立式壓力蒸汽滅菌器（YXQLS-50SII）（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)），電熱恒溫水浴鍋（HWS-12 型）（上海一恒科技有限公司），水套式二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司），潔凈工作臺(tái)（SW-CJ-1FD）（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），冰箱（BCD-232MB/A）（廣東容聲電器股份有限公司），立式超低溫保存箱（DW-86L386）（青島海爾股份有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) CCC-ESF-1 于H-DMEM（含1%雙抗、10%胎牛血清）完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底80%以上，用PBS 沖洗2 次，加入1ml 0.25%胰蛋白酶常溫消化1～2min，輕拍瓶壁使細(xì)胞脫落，加入2 倍體積的完全培養(yǎng)基終止消化，移至15ml 離心管，1000r/min 離心6min，去上清液，沉淀加入適量完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度，取生長(zhǎng)狀況良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期成纖維細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 美洲大蠊提取物對(duì)CCC-ESF-1增殖活性的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CCC-ESF-1 以1×105個(gè)/ml 接種于96 孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，每孔接種90μl，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24h 后取出設(shè)立美洲大蠊提取物不同濃度的實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)不加藥的陰性對(duì)照組（含等量細(xì)胞重懸液）和只加培養(yǎng)液的空白組。實(shí)驗(yàn)組分別加入美洲大蠊提取物10μl/孔，使其終濃度分別為300、100、30、10 和3μg/ml，每種濃度至少設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，振蕩均勻后繼續(xù)培養(yǎng)，于24、48、72 及96h 后取出加MTT（20μl/孔），繼續(xù)培養(yǎng)4h 后加入DMSO 150μl/孔，振蕩2min，于酶標(biāo)儀490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)各孔的吸光度（A）值。細(xì)胞增殖抑制率公式：抑制率%=[1-（實(shí)驗(yàn)組A 值-空白組A 值）/（陰性對(duì)照組A 值-空白組A 值）]×100%，即抑制率%=（陰性對(duì)照組A 值-實(shí)驗(yàn)組A 值）/（陰性對(duì)照組A 值-空白組A 值）×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件和Excel 軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組不同時(shí)間點(diǎn)的比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度美洲大蠊提取物作用24 h 對(duì)CCCESF-1 細(xì)胞形態(tài)的影響

低倍光學(xué)電子顯微鏡下觀察可見(jiàn)，陰性對(duì)照組CCC-ESF-1 細(xì)胞似長(zhǎng)梭形或三角形，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。30μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-C 作用細(xì)胞24h 后，細(xì)胞狀態(tài)較陰性對(duì)照組無(wú)變化。3μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-B、Ento-E 和300μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-F分別作用細(xì)胞24h 后，與陰性對(duì)照組比較，細(xì)胞數(shù)有少量減少，細(xì)胞形態(tài)有皺縮，發(fā)生變形，三者細(xì)胞狀態(tài)相似。10μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-D 作用細(xì)胞24h 后，細(xì)胞數(shù)有一定減少，細(xì)胞形態(tài)皺縮，間隙變大，棱角變鈍，散布存在。3μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-A 作用細(xì)胞24h 后，細(xì)胞數(shù)變少明顯，細(xì)胞形態(tài)變短，細(xì)胞纖維樣逐漸消失，甚至可以看到漂浮的細(xì)胞（見(jiàn)圖1）。

2.2 美洲大蠊提取物對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖的抑制作用

不同濃度美洲大蠊提取物給藥后24、48、72 及96h 細(xì)胞增殖抑制率比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①CCC-ESF-1 細(xì)胞在美洲大蠊提取物Ento-A 作用下，不同時(shí)間點(diǎn)間的細(xì)胞增殖抑制率有差異（F=7.790，P=0.000）；不同藥物濃度的美洲大蠊提取物對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖抑制率有差異（F=13.351，P=0.000）；作用時(shí)間與藥物濃度存在交互作用，藥物作用時(shí)間隨藥物濃度的變化有差異（F=5.042，P=0.000）。②CCC-ESF-1 細(xì)胞在美洲大蠊提取物Ento-B 作用下，不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率有差異（F=22.485，P=0.000）；不同藥物濃度的美洲大蠊提取物對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖抑制率有差異（F=12.091，P=0.000）；作用時(shí)間與藥物濃度存在交互作用，藥物作用時(shí)間隨藥物濃度的變化有差異（F=3.678，P=0.000）。③CCC-ESF-1 細(xì)胞在美洲大蠊提取物Ento-C 作用下，不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率有差異（F=7.251，P=0.000）；不同藥物濃度的美洲大蠊提取物對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖抑制率無(wú)差異（F=2.061，P=0.102）；作用時(shí)間與藥物濃度存在交互作用，藥物作用時(shí)間隨藥物濃度的變化有差異（F=2.600，P=0.003）。④CCC-ESF-1 細(xì)胞在美洲大蠊提取物Ento-D 作用下，不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率有差異（F=5.940，P=0.000）；不同藥物濃度的美洲大蠊提取物對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖抑制率有差異（F=13.176，P=0.000）；作用時(shí)間與藥物濃度存在交互作用，藥物作用時(shí)間隨藥物濃度的變化有差異（F=3.126，P=0.000）。⑤CCC-ESF-1 細(xì)胞在美洲大蠊提取物Ento-E 作用下，不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率有差異（F=7.553，P=0.000）；不同藥物濃度的美洲大蠊提取物對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖抑制率有差異（F=6.183，P=0.001）；作用時(shí)間與藥物濃度不存在交互作用，藥物作用時(shí)間隨藥物濃度的變化無(wú)差異（F=1.585，P=0.096）。⑥CCC-ESF-1 細(xì)胞在美洲大蠊提取物Ento-F 作用下，不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率無(wú)差異（F=0.824，P=0.484）；不同藥物濃度的美洲大蠊提取物對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖抑制率無(wú)差異（F=0.961，P=0.459）；作用時(shí)間與藥物濃度不存在交互作用，藥物作用時(shí)間隨藥物濃度的變化無(wú)差異（F=1.700，P=0.067）。見(jiàn)表1。

圖1 不同濃度美洲大蠊提取物作用24 h CCC-ESF-1 細(xì)胞的形態(tài)（光學(xué)電子顯微鏡×40）

與陰性對(duì)照組比較，終濃度為3 及10μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-A 在不同作用時(shí)間（24、48、72 及 96h）對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖均有抑制作用（P＜0.05），且3μg/ml 作用24h 時(shí)細(xì)胞增殖抑制率（53.691± 4.539）%最突出；終濃度為3μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-B 在不同作用時(shí)間（24、48、72 及96h）對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖均有抑制作用（P＜0.05），且3μg/ml 作用72h 時(shí)細(xì)胞增殖抑制率（56.609±9.161）%最明顯；終濃度為3 及10μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-C 在作用72 和96h 時(shí)對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖均 有抑制作用（P＜0.05），且10μg/ml 作用96h 時(shí)細(xì)胞增殖抑制率為（36.555±17.423）%；終濃度為3μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-D 在不同作用時(shí)間（24、48、72 及96h）對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖均有抑制作用（P＜ 0.05），10μg/ml 作用96h 時(shí)細(xì)胞增殖抑制率（42.367± 2.257）%最明顯；終濃度為3μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-E 在不同作用時(shí)間（24、48、72 及96h）對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖均有抑制作用（P＜0.05），且3μg/ml作用96h時(shí)細(xì)胞增殖抑制率（50.820±16.563）%最明顯；美洲大蠊提取物Ento-F 對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖的抑制作用不明顯。見(jiàn)表1。

2.3 同一濃度美洲大蠊提取物作用不同時(shí)間對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖的抑制作用

美洲大蠊提取物（Ento-A、Ento-B、Ento-C、Ento-D、Ento-E、Ento-F）對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞的增殖有 抑制作用，其中低濃度（3 和10 μg/ml）Ento-B、Ento-C、Ento-D、Ento-E 作用72 和96 h 時(shí)抑制效果較好；低濃度（3 和10 μg/ml）Ento-A 作用24 h 時(shí)抑制效果最好；中高濃度（30～300 μg/ml）Ento-F 作用24 h 時(shí)抑制效果較好。

表1 各組不同作用時(shí)間的CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖抑制率的比較（±s）

表1 各組不同作用時(shí)間的CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖抑制率的比較（±s）

?

續(xù)表1

2.4 同一時(shí)間不同濃度美洲大蠊提取物對(duì)CCCESF-1 細(xì)胞增殖的抑制作用

美洲大蠊提取物Ento-A、Ento-B、Ento-C、Ento- D、Ento-E、Ento-F 對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞的增殖有抑制 作用，其中Ento-A、Ento-B、Ento-C、Ento-D、Ento-E 在低濃度（3 及10 μg/ml）時(shí)抑制效果較好；Ento-F在中高濃度（30～300 μg/ml）時(shí)抑制效果較好。

3 討論

瘢痕形成和創(chuàng)面愈合機(jī)制是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，其機(jī)制尚未完全清楚，一般認(rèn)為增生性瘢痕的成因來(lái)源于成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性異常，由于成纖維細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)失控，膠原過(guò)度沉積導(dǎo)致真皮纖維化。增生性瘢痕的治療方法有中藥療法、抗腫瘤藥治療、手術(shù)治療、壓力治療、放射治療、激光治療、基因治療等，目前尚無(wú)特效的治療方法。盡管增生性瘢痕屬于良性病變[11-14]，但由于影響體表美觀，關(guān)節(jié)部位的瘢痕還可影響關(guān)節(jié)活動(dòng)，降低生活質(zhì)量，易復(fù)發(fā)，因此是目前臨床上亟待解決的課題[15]。

許多中藥被用來(lái)治療增生性瘢痕，中藥中的昆蟲(chóng)藥具有資源廣、活性高、作用強(qiáng)、劑量小等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于治療各種疑難雜癥。美洲大蠊是蜚蠊科大蠊屬動(dòng)物，具有散瘀、消積、解毒、利水、消腫等功效，主治兒童疳積、扁桃體炎、身體包塊和癰等。近年來(lái)以大理大學(xué)李樹(shù)楠教授為代表的專(zhuān)家學(xué)者對(duì)美洲大蠊的藥理作用和臨床應(yīng)用進(jìn)行深入的研究，取得良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。大量研究顯示，美洲大蠊提取物對(duì)多種細(xì)胞增殖都有一定的抑制作用[16-21]，其對(duì)機(jī)體的創(chuàng)傷愈合有修復(fù)作用[22-23]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊提取物具有減輕瘢痕和使瘢痕增生的雙向作用，但減輕瘢痕的增生及修復(fù)瘢痕才具有臨床實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，因此藥物的最佳用量及增生的時(shí)期成為關(guān)鍵因素。本研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊提取物對(duì)CCC-ESF-1增殖有抑制作用，美洲大蠊提取物Ento-A、Ento-B、Ento-C、Ento-D、Ento-E 在3 和10 μg/ml 時(shí)對(duì)CCC- ESF-1 細(xì)胞的增殖抑制作用效果較好，美洲大蠊提取物Ento-F 在300 μg/ml 時(shí)對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞的增殖有抑制作用，且藥物Ento-F 對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞的增殖抑制作用均弱于其他5 種。提示美洲大蠊提取物能抑制體外CCC-ESF-1 的增殖，可能起到抑制瘢痕增生的作用，有成為治療增生性瘢痕藥物的可能性，其實(shí)際臨床療效尚需經(jīng)過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或結(jié)合臨床開(kāi)展進(jìn)一步研究。該結(jié)論為美洲大蠊提取物應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或者其他成纖維細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的研究提供依據(jù)，也為增生性瘢痕的臨床治療提供新的思路，為進(jìn)一步研究制備美洲大蠊相應(yīng)藥物制劑奠定基礎(chǔ)。