劉榮榮,李麗娟,王楠,張海珠
(大理大學(xué) 1.公共衛(wèi)生學(xué)院,2.云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,3.藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院,云南 大理 671000)
創(chuàng)傷、燒燙傷及手術(shù)切口等均可導(dǎo)致傷口愈合異常,引起病理性瘢痕的產(chǎn)生,增生性瘢痕(hypertrophic scars,HS)是病理性瘢痕的一種,可引起組織潮紅、瘙癢、疼痛等癥狀,影響美觀,造成局部組織或器官功能障礙,甚至發(fā)生畸形,嚴(yán)重影響患者身心健康及生存質(zhì)量[1-2]。HS 的形成主要是以成纖維細(xì)胞的異常增殖、細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積及膠原蛋白表達(dá)異常為特征[3]。目前其治療方法主要有藥物、手術(shù)、放射、激光及壓迫等,但均無(wú)特效的治療方法[4-5]。因此,尋找預(yù)防和治療的有效方法調(diào)控瘢痕使其增生至適當(dāng)程度,已成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。美洲大蠊含有多種化學(xué)成分,具有抗肝纖維化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛,增強(qiáng)免疫、保肝,促進(jìn)血管增生、組織修復(fù)等作用[6-10]。本研究以體外培養(yǎng)人胚胎皮膚成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象,采用美洲大蠊提取物進(jìn)行干預(yù),觀察美洲大蠊提取物對(duì)人胚胎皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響。
人胚胎皮膚成纖維細(xì)胞株(CCC-ESF-1,編號(hào):BNCC339675)購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院,美洲大蠊提取物(乙醇提?。〦nto-A(黃褐色濃稠 膏狀)、Ento-B、Ento-C 和Ento-D(褐色濃稠膏狀)、Ento-E(黃褐色凍干粉末)、Ento-F(褐色液體)為云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制。
H-DMEM 培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco 公司),碳酸氫鈉(NaHCO3)、Hepes(北京索萊寶科技有限公司),胎牛血清(美國(guó)Gibco 公司),0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Millipore 公司),噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(美國(guó)Sigma 公司),雙抗青鏈霉素混合液(美國(guó)Millipore 公司),磷酸鹽緩沖液(PBS)(美國(guó)Hyclone公司)。
低速離心機(jī)(SC-2546)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司),多功能酶標(biāo)儀(Spectra Max M2)(美國(guó)Molecular Devices 公司),立式壓力蒸汽滅菌器(YXQLS-50SII)(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)),電熱恒溫水浴鍋(HWS-12 型)(上海一恒科技有限公司),水套式二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo 公司),潔凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司),冰箱(BCD-232MB/A)(廣東容聲電器股份有限公司),立式超低溫保存箱(DW-86L386)(青島海爾股份有限公司)。
1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) CCC-ESF-1 于H-DMEM(含1%雙抗、10%胎牛血清)完全培養(yǎng)液中,置于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底80%以上,用PBS 沖洗2 次,加入1ml 0.25%胰蛋白酶常溫消化1~2min,輕拍瓶壁使細(xì)胞脫落,加入2 倍體積的完全培養(yǎng)基終止消化,移至15ml 離心管,1000r/min 離心6min,去上清液,沉淀加入適量完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整濃度,取生長(zhǎng)狀況良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期成纖維細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
1.4.2 美洲大蠊提取物對(duì)CCC-ESF-1增殖活性的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CCC-ESF-1 以1×105個(gè)/ml 接種于96 孔培養(yǎng)板培養(yǎng),每孔接種90μl,置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),24h 后取出設(shè)立美洲大蠊提取物不同濃度的實(shí)驗(yàn)組,同時(shí)設(shè)不加藥的陰性對(duì)照組(含等量細(xì)胞重懸液)和只加培養(yǎng)液的空白組。實(shí)驗(yàn)組分別加入美洲大蠊提取物10μl/孔,使其終濃度分別為300、100、30、10 和3μg/ml,每種濃度至少設(shè)3 個(gè)復(fù)孔,振蕩均勻后繼續(xù)培養(yǎng),于24、48、72 及96h 后取出加MTT(20μl/孔),繼續(xù)培養(yǎng)4h 后加入DMSO 150μl/孔,振蕩2min,于酶標(biāo)儀490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)各孔的吸光度(A)值。細(xì)胞增殖抑制率公式:抑制率%=[1-(實(shí)驗(yàn)組A 值-空白組A 值)/(陰性對(duì)照組A 值-空白組A 值)]×100%,即抑制率%=(陰性對(duì)照組A 值-實(shí)驗(yàn)組A 值)/(陰性對(duì)照組A 值-空白組A 值)×100%。
數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件和Excel 軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組不同時(shí)間點(diǎn)的比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析,P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
低倍光學(xué)電子顯微鏡下觀察可見(jiàn),陰性對(duì)照組CCC-ESF-1 細(xì)胞似長(zhǎng)梭形或三角形,生長(zhǎng)狀態(tài)良好。30μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-C 作用細(xì)胞24h 后,細(xì)胞狀態(tài)較陰性對(duì)照組無(wú)變化。3μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-B、Ento-E 和300μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-F分別作用細(xì)胞24h 后,與陰性對(duì)照組比較,細(xì)胞數(shù)有少量減少,細(xì)胞形態(tài)有皺縮,發(fā)生變形,三者細(xì)胞狀態(tài)相似。10μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-D 作用細(xì)胞24h 后,細(xì)胞數(shù)有一定減少,細(xì)胞形態(tài)皺縮,間隙變大,棱角變鈍,散布存在。3μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-A 作用細(xì)胞24h 后,細(xì)胞數(shù)變少明顯,細(xì)胞形態(tài)變短,細(xì)胞纖維樣逐漸消失,甚至可以看到漂浮的細(xì)胞(見(jiàn)圖1)。
不同濃度美洲大蠊提取物給藥后24、48、72 及96h 細(xì)胞增殖抑制率比較,采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析,結(jié)果:①CCC-ESF-1 細(xì)胞在美洲大蠊提取物Ento-A 作用下,不同時(shí)間點(diǎn)間的細(xì)胞增殖抑制率有差異(F=7.790,P=0.000);不同藥物濃度的美洲大蠊提取物對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖抑制率有差異(F=13.351,P=0.000);作用時(shí)間與藥物濃度存在交互作用,藥物作用時(shí)間隨藥物濃度的變化有差異(F=5.042,P=0.000)。②CCC-ESF-1 細(xì)胞在美洲大蠊提取物Ento-B 作用下,不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率有差異(F=22.485,P=0.000);不同藥物濃度的美洲大蠊提取物對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖抑制率有差異(F=12.091,P=0.000);作用時(shí)間與藥物濃度存在交互作用,藥物作用時(shí)間隨藥物濃度的變化有差異(F=3.678,P=0.000)。③CCC-ESF-1 細(xì)胞在美洲大蠊提取物Ento-C 作用下,不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率有差異(F=7.251,P=0.000);不同藥物濃度的美洲大蠊提取物對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖抑制率無(wú)差異(F=2.061,P=0.102);作用時(shí)間與藥物濃度存在交互作用,藥物作用時(shí)間隨藥物濃度的變化有差異(F=2.600,P=0.003)。④CCC-ESF-1 細(xì)胞在美洲大蠊提取物Ento-D 作用下,不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率有差異(F=5.940,P=0.000);不同藥物濃度的美洲大蠊提取物對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖抑制率有差異(F=13.176,P=0.000);作用時(shí)間與藥物濃度存在交互作用,藥物作用時(shí)間隨藥物濃度的變化有差異(F=3.126,P=0.000)。⑤CCC-ESF-1 細(xì)胞在美洲大蠊提取物Ento-E 作用下,不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率有差異(F=7.553,P=0.000);不同藥物濃度的美洲大蠊提取物對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖抑制率有差異(F=6.183,P=0.001);作用時(shí)間與藥物濃度不存在交互作用,藥物作用時(shí)間隨藥物濃度的變化無(wú)差異(F=1.585,P=0.096)。⑥CCC-ESF-1 細(xì)胞在美洲大蠊提取物Ento-F 作用下,不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率無(wú)差異(F=0.824,P=0.484);不同藥物濃度的美洲大蠊提取物對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖抑制率無(wú)差異(F=0.961,P=0.459);作用時(shí)間與藥物濃度不存在交互作用,藥物作用時(shí)間隨藥物濃度的變化無(wú)差異(F=1.700,P=0.067)。見(jiàn)表1。
圖1 不同濃度美洲大蠊提取物作用24 h CCC-ESF-1 細(xì)胞的形態(tài)(光學(xué)電子顯微鏡×40)
與陰性對(duì)照組比較,終濃度為3 及10μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-A 在不同作用時(shí)間(24、48、72 及 96h)對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖均有抑制作用(P<0.05),且3μg/ml 作用24h 時(shí)細(xì)胞增殖抑制率(53.691± 4.539)%最突出;終濃度為3μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-B 在不同作用時(shí)間(24、48、72 及96h)對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖均有抑制作用(P<0.05),且3μg/ml 作用72h 時(shí)細(xì)胞增殖抑制率(56.609±9.161)%最明顯;終濃度為3 及10μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-C 在作用72 和96h 時(shí)對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖均 有抑制作用(P<0.05),且10μg/ml 作用96h 時(shí)細(xì)胞增殖抑制率為(36.555±17.423)%;終濃度為3μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-D 在不同作用時(shí)間(24、48、72 及96h)對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖均有抑制作用(P< 0.05),10μg/ml 作用96h 時(shí)細(xì)胞增殖抑制率(42.367± 2.257)%最明顯;終濃度為3μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-E 在不同作用時(shí)間(24、48、72 及96h)對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖均有抑制作用(P<0.05),且3μg/ml作用96h時(shí)細(xì)胞增殖抑制率(50.820±16.563)%最明顯;美洲大蠊提取物Ento-F 對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖的抑制作用不明顯。見(jiàn)表1。
美洲大蠊提取物(Ento-A、Ento-B、Ento-C、Ento-D、Ento-E、Ento-F)對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞的增殖有 抑制作用,其中低濃度(3 和10 μg/ml)Ento-B、Ento-C、Ento-D、Ento-E 作用72 和96 h 時(shí)抑制效果較好;低濃度(3 和10 μg/ml)Ento-A 作用24 h 時(shí)抑制效果最好;中高濃度(30~300 μg/ml)Ento-F 作用24 h 時(shí)抑制效果較好。
表1 各組不同作用時(shí)間的CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖抑制率的比較(±s)
表1 各組不同作用時(shí)間的CCC-ESF-1 細(xì)胞增殖抑制率的比較(±s)
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續(xù)表1
美洲大蠊提取物Ento-A、Ento-B、Ento-C、Ento- D、Ento-E、Ento-F 對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞的增殖有抑制 作用,其中Ento-A、Ento-B、Ento-C、Ento-D、Ento-E 在低濃度(3 及10 μg/ml)時(shí)抑制效果較好;Ento-F在中高濃度(30~300 μg/ml)時(shí)抑制效果較好。
瘢痕形成和創(chuàng)面愈合機(jī)制是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程,其機(jī)制尚未完全清楚,一般認(rèn)為增生性瘢痕的成因來(lái)源于成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性異常,由于成纖維細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)失控,膠原過(guò)度沉積導(dǎo)致真皮纖維化。增生性瘢痕的治療方法有中藥療法、抗腫瘤藥治療、手術(shù)治療、壓力治療、放射治療、激光治療、基因治療等,目前尚無(wú)特效的治療方法。盡管增生性瘢痕屬于良性病變[11-14],但由于影響體表美觀,關(guān)節(jié)部位的瘢痕還可影響關(guān)節(jié)活動(dòng),降低生活質(zhì)量,易復(fù)發(fā),因此是目前臨床上亟待解決的課題[15]。
許多中藥被用來(lái)治療增生性瘢痕,中藥中的昆蟲(chóng)藥具有資源廣、活性高、作用強(qiáng)、劑量小等優(yōu)點(diǎn),被廣泛用于治療各種疑難雜癥。美洲大蠊是蜚蠊科大蠊屬動(dòng)物,具有散瘀、消積、解毒、利水、消腫等功效,主治兒童疳積、扁桃體炎、身體包塊和癰等。近年來(lái)以大理大學(xué)李樹(shù)楠教授為代表的專(zhuān)家學(xué)者對(duì)美洲大蠊的藥理作用和臨床應(yīng)用進(jìn)行深入的研究,取得良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。大量研究顯示,美洲大蠊提取物對(duì)多種細(xì)胞增殖都有一定的抑制作用[16-21],其對(duì)機(jī)體的創(chuàng)傷愈合有修復(fù)作用[22-23]。本課題組前期發(fā)現(xiàn),美洲大蠊提取物具有減輕瘢痕和使瘢痕增生的雙向作用,但減輕瘢痕的增生及修復(fù)瘢痕才具有臨床實(shí)際應(yīng)用價(jià)值,因此藥物的最佳用量及增生的時(shí)期成為關(guān)鍵因素。本研究發(fā)現(xiàn),美洲大蠊提取物對(duì)CCC-ESF-1增殖有抑制作用,美洲大蠊提取物Ento-A、Ento-B、Ento-C、Ento-D、Ento-E 在3 和10 μg/ml 時(shí)對(duì)CCC- ESF-1 細(xì)胞的增殖抑制作用效果較好,美洲大蠊提取物Ento-F 在300 μg/ml 時(shí)對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞的增殖有抑制作用,且藥物Ento-F 對(duì)CCC-ESF-1 細(xì)胞的增殖抑制作用均弱于其他5 種。提示美洲大蠊提取物能抑制體外CCC-ESF-1 的增殖,可能起到抑制瘢痕增生的作用,有成為治療增生性瘢痕藥物的可能性,其實(shí)際臨床療效尚需經(jīng)過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或結(jié)合臨床開(kāi)展進(jìn)一步研究。該結(jié)論為美洲大蠊提取物應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或者其他成纖維細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的研究提供依據(jù),也為增生性瘢痕的臨床治療提供新的思路,為進(jìn)一步研究制備美洲大蠊相應(yīng)藥物制劑奠定基礎(chǔ)。
中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志2020年5期