李天翔，祝志波，郝祥宇，郭建強

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

同型半胱氨酸（Homocysteine,Hcy）是導(dǎo)致或加重動脈粥樣硬化的獨立危險因素，可直接引起內(nèi)皮損傷及功能障礙、炎癥細(xì)胞通透性增加、平滑肌細(xì)胞凋亡、增強氧化應(yīng)激反應(yīng)、血小板聚集性增加、凝血因子活化增強等血栓前狀態(tài)[1-6]，Hcy 與斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)，但其機制尚不清楚。本文擬探討血管緊張素Ⅱ1 型受體（angiotension Ⅱ type 1 receptor,AT1）在Hcy 致病過程的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

21只6周齡雄性清潔級小鼠購自北京維通利華公司，動物合格證號：CNAS0004，C57BL/6L 為背景的載脂蛋白E 敲除（apolipoprotein E knocked out,ApoE-/-）小鼠于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動物實驗室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度18～23℃，濕度50%～60%，保持室內(nèi)空氣新鮮，每只籠具7只小鼠，照明12 h，無污染飲水，所有飼料購自北京科奧協(xié)力有限公司。小鼠背毛濃密有光澤，眼睛明亮活潑，行動迅速，反應(yīng)靈敏，食欲良好，發(fā)育正常，體型豐滿。

1.2 動物分組

將21只ApoE-/-小鼠稱重，按體重從輕到重編號1～21，按隨機數(shù)字表法進行分組，分別為對照組（CTL組）、高同型半胱氨酸組（HHcy 組）、高同型半胱氨酸+替米沙坦（HHcy+TLM 組）[1.5%蛋氨酸+替米沙坦10 ng/（kg·d）灌胃]，每組7只，共飼養(yǎng)12周。3組均采用含21%豬油和0.15%膽固醇的高膽固醇飼料喂養(yǎng)。參考文獻[7-8]在飼料中加入1.5%蛋氨酸復(fù)制高同型半胱氨酸血癥模型，并采用替米沙坦10 mg/（kg·d）（勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司）[9]+5 g/L 羧甲基纖維素的磷酸鹽緩沖液（PBS）[10]配制的混懸液灌胃，CTL 組和HHcy 組均給予5 g/L 羧甲纖維素液灌胃。

1.3 小鼠體重、血壓的檢測

從第7周（灌胃前）開始，每周1 次規(guī)律測量小鼠體重，直至治療結(jié)束，記錄平均值；從第10周開始用無創(chuàng) 鼠尾測壓儀（BP-300A，成都泰盟軟件公司，2014年）測量鼠尾動脈血壓，每2周測量1 次，測量前將箱體加溫至36℃，鼠尾加熱后，保證動物在清醒狀態(tài)及安靜環(huán)境中測量血壓，血壓重復(fù)測量3～5 次，取平均值，記錄收縮壓（SBP）值。

1.4 小鼠血清學(xué)指標(biāo)的檢測

飼養(yǎng)12周后，應(yīng)用2%戊巴比妥鈉注射液80 mg/kg 麻醉，摘眼球取血于1.5 ml 無菌EP 管，4℃、3 000 r/min 離心10 min，吸取上清液，儲存于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩２捎萌詣由治鰞x測量血脂，循環(huán)酶直接法檢測Hcy。

1.5 小鼠主動脈硬化斑塊面積的檢測

解剖顯微鏡下剝離主動脈弓，剝離周圍脂肪組織，用鑷子小心提起主動脈弓，于無名動脈分叉處剪斷，置于含有0.1 mmol/L PBS 的EP 管中，置于冰上，用手術(shù)刀在平行左右心耳連線下方1 mm 處將心臟下部切除，心臟上部進行OCT 包埋，10 μm 厚度切片。顯微鏡下觀察，3 個主動脈瓣同時出現(xiàn)的第1 張組織切片標(biāo)記為0，向上第2 張標(biāo)記為10，以此類推。從主動脈0 點開始每間隔100 μm 取1 張切片進行斑塊的面積測量，共測量6 張，計算這6 張切片斑塊面積的均值，即為主動脈根部斑塊的面積。切片后進行油紅O 染色，用4 倍物鏡采集圖像后，用Image-Pro Plus 6.0 軟件測量油紅O 染色陽性斑塊面積，并計算斑塊面積占血管管腔面積的百分比。

1.6 HE 和Masson 染色

HE 染色：將OCT 包埋的主動脈根部組織以6 μm 厚度進行切片；用10%中性甲醛固定1 min；1 mmol/L PBS 洗3 次，3 min/次，主要以浸泡的方式，防脫片；Weigert 鐵蘇木精染液3～5 min；流水（自來水）洗去蘇木精染液5～10 s；1%鹽酸乙醇分化1～3 s，自來水中返藍(lán)20 s；伊紅染色10～20 s；脫水、透明、中性樹膠封片。染色結(jié)果：細(xì)胞核藍(lán)染，細(xì)胞漿紅染。

Masson 染色（北京卡柏萊公司）：將厚度為5 μm 冷凍切片，用10%中性甲醛固定1 min；Weigert 鐵蘇木精染液3～5 min；1%鹽酸乙醇分化1～3 s，流水（自來水）洗3 min，至返藍(lán)；麗春紅品紅染液染色5 min；0.1%～0.3%乙酸溶液洗1 min；1%磷鉬酸液洗1 min；重復(fù)步驟0.1%～0.3%乙酸溶液洗1 min；直接放入苯胺藍(lán)染液1 min；重復(fù)步驟0.1%～0.3%乙酸溶液洗1 min；95%乙醇快速脫水，100%乙醇脫水3 次，5～10 s/次；二甲苯透明3 次，1～2 min/次；中性樹膠封片。染色結(jié)果：膠原纖維、細(xì)胞核藍(lán)染，肌肉、細(xì)胞漿紅染。

1.7 免疫組織化學(xué)SP 法

制備5 μm 冷凍切片，4%多聚甲醛固定15 min，PBS 沖洗3 次，每次5 min，吸水紙吸干載玻片上的殘余水分，按照試劑盒（SP0022）（北京博奧森公司）說明書的步驟進行操作，首先加3%過氧化氫溫孵育10 min，為減少內(nèi)源性過氧化物酶的活性；采用A 液血清封閉15 min，分別加入抗巨噬細(xì)胞表面分子（mac-3）抗體（1∶100，AB13524）、抗IL-6 抗體（1∶100，AB7737）、抗MCP-1抗體（1∶100，AB7202）、MMP-9 抗體（1∶100，AB76003），DAB 顯色（購自福州邁新公司），Leica 顯微鏡用4 倍物鏡采集圖像后，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 軟件計算斑塊內(nèi)平均光密度，平均光密度=積分光密度（IOD）/區(qū)域面積（Area）。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠血脂、Hcy、SBP、體重情況

3組小鼠甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度 脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；3組小鼠Hcy 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），HHcy 組較CTL 組高（P＜ 0.05）；治療前3組小鼠SBP、體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療后3組小鼠SBP、體重比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），治療后HHcy+TLM 組SBP、體重比HHcy 組低。見表1、2。

2.2 3組小鼠主動脈根部斑塊面積占血管管腔面積百分比的比較

油紅O 染色陽性斑塊面積占血管管腔面積的百分比，CTL 組為（18.72±1.96）%，HHcy 組為（22.17± 2.07）%，HHcy+TLM 組為（10.02±1.96）%，3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=73.269，P=0.000）；HHcy 組油紅O 染色陽性斑塊面積占血管管腔面積的百分比較CTL 組、HHcy+TLM 組大（P＜0.05）。見圖1、2。

表1 3組小鼠Hcy 和血脂指標(biāo)比較（n =7，±s）

表1 3組小鼠Hcy 和血脂指標(biāo)比較（n =7，±s）

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表2 3組小鼠SBP 及體重情況（n =7，±s）

表2 3組小鼠SBP 及體重情況（n =7，±s）

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圖1 3組小鼠主動脈根部陰性斑塊面積（油紅O 染色×40）

圖2 3組小鼠主動脈根部斑塊面積占血管管腔面積 百分比的比較（±s）

2.3 3組小鼠主動脈根部斑塊穩(wěn)定性

HHcy 組可見纖維帽變薄，大量泡沫細(xì)胞，較大的脂質(zhì)/壞死核心，可見膽固醇結(jié)晶；HHcy+TLM 組纖維帽較厚，少許泡沫細(xì)胞，脂質(zhì)/壞死核心減小。見圖3。

2.4 3組小鼠炎癥因子表達

免疫組織化學(xué)SP 法結(jié)果顯示，HHcy 組斑塊內(nèi)mac-3、MCP-1、IL-6 的棕黃色顆粒沉積最多，半定量分析平均光密度值最高，HHcy+TLM 組炎癥因子的表達下降。mac-3 的值分別為：CTL 組（0.123±0.015）、HHcy 組（0.633±0.035）、HHcy+TLM 組（0.167±0.021），3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=235.947，P=0.000），HHcy 組較CTL 組、HHcy+TLM 組多（P＜0.05）；MCP-1 的值分別為：CTL 組（0.150±0.021）、HHcy 組（0.637± 0.086）、HHcy+TLM 組（0.187±0.025），3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=78.075，P=0.000），HHcy 組較CTL 組、HHcy+TLM 組多（P＜0.05）；IL-6 的值分別為：CTL 組（0.103±0.015）、HHcy 組（0.337±0.032）、HHcy+TLM組（0.167±0.021），3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=77.08，P=0.000），HHcy 組較CTL 組、HHcy+TLM 組多（P＜0.05）。見圖4、5。

2.5 3組小鼠膠原蛋白分泌及MMP-9 的表達

Masson 染色結(jié)果顯示，HHcy+TLM 組與HHcy 組比較，藍(lán)染的膠原蛋白明顯增加（見圖6）。斑塊內(nèi)MMP-9 的表達水平分別為：CTL 組（0.237±0.021）、HHcy 組（0.393±0.031）、HHcy+TLM 組（0.187±0.015），3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=65.396，P=0.000），HHcy 組較CTL 組、HHcy+TLM 組多（P＜0.05）。見圖7、8。

圖3 3組小鼠主動脈根部斑塊形態(tài)觀察（HE 染色×200）

圖4 3組小鼠主動脈根部斑塊內(nèi)mac-3、MCP-1、IL-6 的表達（DAB 染色×40）

圖5 3組小鼠主動脈根部斑塊mac-3、MCP-1、IL-6 的平均光密度值比較（±s）

圖6 3組小鼠主動脈根部斑塊內(nèi)膠原蛋白比較（Masson 染色×40）

圖7 3組小鼠主動脈根部斑塊MMP-9 的表達（DAB 染色×40）

圖8 3組小鼠主動脈根部斑塊內(nèi)MMP-9 水平比較（±s）

3 討論

動脈粥樣硬化表現(xiàn)為動脈壁粥樣斑塊形成，致使管腔狹窄，斑塊破裂時會導(dǎo)致急性心血管不良事件發(fā)生[11]；ApoE-/-給予蛋氨酸飲食誘導(dǎo)，可導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥，HHcy 除具有可引起內(nèi)皮損傷、平滑肌細(xì)胞凋亡、增加血小板聚集等致動脈粥樣硬化形成的機制外，還有促動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性的作用[12]。Hcy 可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和腺苷酸活化蛋白激酶作用，上調(diào)腫瘤壞死因子-α 和MMP-9 的表達[13-14]，增加斑塊不穩(wěn)定性，但Hcy 結(jié)合受體并不清楚。本實驗結(jié)果顯示，HHcy+TLM組血清中Hcy含量高于CTL組，但HHcy+TLM 組Hcy 含量較HHcy 組無明顯下降，一方面說明模型復(fù)制成功，一方面說明TLM 并不是直接通過降低Hcy 的含量來減輕動脈粥樣硬化；HHcy 組主動脈根部斑塊面積占血管管腔面積的百分比與CTL 組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。文中主動脈根部HE 染色、免疫組織化學(xué)SP 法結(jié)果提示Hcy 不僅具有促動脈粥樣硬化斑塊形成作用，而且使斑塊內(nèi)出現(xiàn)較大的脂質(zhì)壞死核心，巨噬細(xì)胞大量浸潤，炎癥因子高表達，MMP-9分泌增加，細(xì)胞外基質(zhì)、膠原蛋白降解，纖維帽變薄，降低了斑塊的穩(wěn)定性，加速斑塊的進展及破裂；應(yīng)用AT1 受體阻斷劑替米沙坦干預(yù)后，能夠逆轉(zhuǎn)HHcy 的這些作用，斑塊面積明顯減小、穩(wěn)定性增加，表明AT1 受體與Hcy 存在一定的聯(lián)系。

腎素血管緊張素系統(tǒng)在動脈粥樣硬化的發(fā)生中具有重要作用，如細(xì)胞生長、增殖、分化、遷移和凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)、炎癥反應(yīng)等方面[15]，其中主要是通過血管緊張素Ⅱ與AT1 受體結(jié)合，在動脈粥樣硬化的起始、進展和并發(fā)癥發(fā)揮著多重生物活性作用。除血管緊張素Ⅱ之外，還有一些因素，如膜環(huán)境、機械拉伸、自身抗體相互作用等[16]亦可激活A(yù)T1 受體。

LIU 等[17]發(fā)現(xiàn)AT1 受體阻滯劑可消除高水平Hcy加重的腹主動脈瘤，還發(fā)現(xiàn)Hcy 可直接激活A(yù)T1 受體，加重血管炎癥。本研究也證實，替米沙坦阻斷AT1 受體可減小高水平Hcy 致動脈粥樣斑塊面積及促進斑塊的穩(wěn)定，也進一步證實Hcy 與AT1 受體有密切的關(guān)系。

同時發(fā)現(xiàn)HHcy+TLM 組治療后的SBP 較CTL 組和HHcy 組下降。學(xué)術(shù)界一直存在著一種爭議——降壓藥物在減輕動脈粥樣硬化的作用中，是得益于降壓作用，還是其本身獨立于降壓因素之外而起的作用？本研究中HHcy+TLM 組的SBP 降低比較明顯，因此尚不能確定動脈粥樣硬化的改善作用是否來源于替米沙坦的降壓作用，這需要進一步探索研究。但目前已有文獻表明，Hcy 和血管緊張素Ⅱ在動脈瘤的致病方面具有協(xié)同作用，Hcy 可促進血管內(nèi)皮細(xì)胞AT1 受體的活化[17]，因此，可以認(rèn)為Hcy 的致病作用可能部分與AT1 受體相關(guān)。

Hcy 可通過拮抗過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisomal proliferators activate receptors,PPARγ），促進脂肪的積累、導(dǎo)致代謝紊亂和血管重塑[18]；PPARγ 受體是脂肪代謝主要調(diào)節(jié)因子，在脂肪組織中高表達，血管緊張素受體阻滯劑亦有部分激活PPARγ受體的作用[19]，減少脂肪的堆積，可能是TLM 組體重下降的原因之一。本實驗替米沙坦拮抗Hcy 在動脈粥樣硬化斑塊易損性的作用中，是否包含PPARγ 這一因素并不明確，也是本實驗局限性所在，有待于下一步深入研究。

替米沙坦阻斷AT1 受體可減小高水平Hcy 致動脈粥樣硬化斑塊面積，促進斑塊的穩(wěn)定，表明Hcy 的致病機制與AT1 受體相關(guān)，本研究結(jié)果將Hcy 與腎素血管緊張素系統(tǒng)聯(lián)系在一起，豐富了動脈粥樣硬化的理論，也豐富了Hcy 的致病機制理論。