張菊華，李高陽，許彎，胡小琴，胡梓妍，劉偉*

1. 湖南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所（長沙 410125）；2. 湖南大學研究生院隆平分院（長沙 410125）

藍莓是杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）多年生落葉或常綠灌木果樹。藍莓營養(yǎng)豐富，富含VC、花色苷、酚酸、類黃酮等，清除自由基能力很強，具有潛在的抗癌、抗衰老以及預(yù)防心臟病等保健功能[1-3]。目前藍莓的主要加工制品有果干、果汁和果酒等，其中藍莓酒加工屬于冷加工方式，是以藍莓或藍莓汁為原料（加糖或不加糖），經(jīng)全部或部分發(fā)酵釀制而成的發(fā)酵酒[4]，可以較好地保留藍莓中的營養(yǎng)成分，發(fā)酵過程還產(chǎn)生新的風味物質(zhì)和活性成分，成為藍莓加工的主導(dǎo)產(chǎn)品。

目前國內(nèi)藍莓酒加工已有一些研究，如開展了藍莓果酒和藍莓浸泡酒的抗氧化及降血脂活性研究[5]；研究了發(fā)酵工藝對花色苷、類黃酮、有機酸、酚酸、香氣成分的影響[6-9]。酵母品種與酒的品質(zhì)關(guān)系密切，有關(guān)藍莓酒的釀造酵母篩選研究較少，酵母菌不同會改變果酒成分，從而影響果酒的口感、風味及色澤等。郭成宇等[10]研究了2種酵母對藍莓酒的香氣成分差異；任春光等[11]開展了自然界藍莓果酒酵母篩選及發(fā)酵性能研究。此次試驗探討了四種葡萄酒酵母對藍莓汁的發(fā)酵能力、總酸及花色苷等的影響，并研究優(yōu)良菌株發(fā)酵過程中主要營養(yǎng)成分的變化，旨在為藍莓酒的加工提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：成熟的粉藍（兔眼藍莓1號）果實；葡萄酒活性干酵母：Rhone、DV、BV、RV。

1.2 儀器、設(shè)備和試劑

1.2.1 儀器與設(shè)備

Oyoung（L18-Y929），九陽公司；電子天平（AL204），梅特勒-托利多；pH計（Mettler Toledo Delta 320），梅特勒-托利多；超凈工作臺（SWCJ-1B），蘇州凈化公司；智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱（HWS），寧波江南儀器廠；紫外分光光度計（UV-1800），日本Shimadzu；高效液相色譜儀（LC-20AT）、PDA檢測器，日本Shimadzu；色譜柱，YMC-Pack Polyamine Ⅱ，250 mm×4.6 mm I.D。

1.2.2 試劑

蔗糖，食品級；果糖、葡萄糖、蔗糖標準品，美國Sigma公司；乙腈，色譜純，美國天地；乙酸、乙醇、氫氧化鈉、濃鹽酸、鄰苯二甲酸氫鉀、亞硫酸等分析純，上海國藥集團；超純水（18 MΩ）Millipore Milli QRG超純水系統(tǒng)制備。

1.3 試驗方法

1.3.1 藍莓制汁

冷凍藍莓解凍后打漿，加入0.2%果膠酶和0.1%纖維素酶，于50 ℃酶解1 h，再離心冷藏備用。

1.3.2 活性干酵母篩選

取4份藍莓汁，每份500 mL，調(diào)整藍莓汁總酸0.6%，按預(yù)設(shè)酒精度12%vol加入白砂糖，攪拌溶解，加入60 mg/kg SO2，放置過夜。

酵母活化：四種活性干酵母分別按0.05%接種量，分2次活化后使用。

發(fā)酵溫度控制24 ℃，發(fā)酵15 d測指標。

1.3.3 藍莓酒發(fā)酵過程樣本的制備

分別取6份藍莓汁，每份500 mL，調(diào)整藍莓汁總酸含量0.6%，按預(yù)設(shè)酒精度12%vol加入白砂糖，攪拌溶解，加入60 mg/kg SO2，放置過夜，按0.05%接種活化好的BV酵母，24 ℃控溫發(fā)酵，發(fā)酵0，2，4，6，9和20 d分別取樣，每個樣品分成3個平行凍藏，待主發(fā)酵完成后測定。

1.3.4 藍莓酒指標測定及方法

1.3.4.1 蔗糖、葡萄糖、果糖含量測定

量取1.0 mL藍莓酒，加少量超純水溶解，然后用超純水定容到20 mL，超聲處理30 min，用0.45 μm的針頭濾器過濾后進行HPLC分析。蔗糖、果糖、葡萄糖標準品濃度梯度為20，10，5，2.5和0.5 mg/mL，每個濃度重復(fù)3次。進樣體積20 μL，柱溫25 ℃，流速1.00 mL/min。流動相為乙腈-水（75︰25，V/V），每個樣品重復(fù)3次。果糖、葡萄糖、蔗糖標準曲線方程分別為Y=5.79×10-6X-2.35×10-2（R2=0.999），Y=7.37×10-6X-1.88×10-2（R2=0.999）和Y=5.51×10-6X-0.63（R2=0.998）。其標準品的高效液相色譜圖如圖1所示。

圖1 多糖混合標準品的高效液相色譜圖

1.3.4.2 總酸的測定

采用電位滴定法[12]測定。

1.3.4.3 酒精度的測定

采用酒精計法[12]測定。將收集到的餾出液在20 ℃的恒溫水浴鍋中恒溫20 min，接著倒入潔凈干燥的量筒，用酒精計測量讀數(shù)。

1.3.4.4 總花色苷含量的測定

采用的pH示差法[13]測定。

1.3.4.5 感官評價

藍莓酒的評分標準參照表1品評標準，得分由項目組成員品評后打分，取平均值。

表1 藍莓酒感官評分標準

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有圖表繪制采用Origin 8和Excel 2003進行處理；利用SPSS 16.0進行顯著性分析，置信概率為0.95，p＜0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葡萄酒活性干酵母的發(fā)酵能力分析

酵母菌無氧呼吸產(chǎn)生酒精和CO2，不同酵母菌發(fā)酵時產(chǎn)酒精能力和殘?zhí)橇慷紩胁町?，如果初始含糖量相同，發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)橇康?，說明酵母對糖的轉(zhuǎn)化利用率高，發(fā)酵能力強。

從表2可以看出，主發(fā)酵結(jié)束后，四株活性干酵母發(fā)酵藍莓酒中均有殘?zhí)牵崽蔷礄z出，表明蔗糖經(jīng)過酵母分泌的轉(zhuǎn)化酶已全部分解成己糖（果糖和葡萄糖）。Rhone菌株發(fā)酵酒中葡萄糖殘留量為4.95±0.85 g/L；果糖殘留量較高，為16.83±0.53 g/L，說明該菌株發(fā)酵果糖能力相對較弱。其余三株酵母殘留糖均為果糖，含量為2～4 g/L，發(fā)酵較徹底。

Rhone發(fā)酵酒的可溶性固形物（TSS）含量為8.8%±0.1%，TSS含量高于其余三種酵母，與藍莓發(fā)酵酒中殘留糖含量情況一致。產(chǎn)酒精度與殘?zhí)乔闆r相反，BV菌株的產(chǎn)酒精能力最強，酒精度為10.8%vol±0.1%vol，Rhone酵母產(chǎn)酒精度最低，為8.6%vol±0.4%vol。從殘?zhí)?、TSS及產(chǎn)酒精能力方面評價，發(fā)酵能力排序為BV＞DV＞RV＞Rhone，BV和DV酵母較適宜藍莓汁的發(fā)酵。

表2 不同活性干酵母發(fā)酵酒中殘?zhí)羌熬凭群?/p>

2.2 不同葡萄酒活性干酵母發(fā)酵后總酸的變化

藍莓果實中有機酸主要以檸檬酸為主，占80%以上，其次為奎寧酸、蘋果酸和草酸，總酸含量最高可達25.14 mg/g鮮果[14]。適量的有機酸能增加酒的醇厚感和清爽感，但總酸含量過高會影響酵母的生長與發(fā)酵，將藍莓汁發(fā)酵前調(diào)整總酸含量為6.01±0.20 g/L。從圖2可以看出，四株菌發(fā)酵后的總酸有不同程度的升高，其中Rhone、BV、RV酵母發(fā)酵酒的總酸含量為6.5～7.0 g/L，酵母之間總酸差異不顯著，DV酵母發(fā)酵后總酸含量為8.25±0.18 g/L，顯著升高（p＜0.05）?？偹崤c果酒的風味有很大關(guān)系，果酒一般總酸量為5～8 g/L，Rhone、BV、RV酵母發(fā)酵產(chǎn)酸均在適宜的范圍內(nèi)，需結(jié)合感官評定，選出最佳的口感及其相應(yīng)的酵母。

2.3 不同葡萄酒活性干酵母對花色苷的影響

花青素對改善記憶有較好效果，Adrian等[15]研究表明采用急性富含類黃酮的藍莓飲品干預(yù), 學齡兒童更能有效地編碼記憶項目?；ㄉ帐撬{莓酒中的一類重要化合物，與酒的品質(zhì)密切相關(guān)，同時還與藍莓酒的抗氧化能力呈正相關(guān)關(guān)系[16], 因此藍莓酒加工中花色苷的保留具有重要意義。不同酵母發(fā)酵對花色苷保留能力不同，從圖3可以看出，BV菌株發(fā)酵酒的花色苷含量最高，為87.34±2.07 mg/L，與其他幾株相比有顯著性差異（p＜0.05），Rhone發(fā)酵酒的花色苷含量最低，DV和RV發(fā)酵酒的花色苷含量差異不顯著（p＞0.05）。從花色苷殘留量評價，BV酵母最優(yōu)，DV酵母次之。

圖2 不同活性干酵母發(fā)酵后的總酸含量

圖3 不同活性干酵母發(fā)酵后的總花色苷含量

2.4 不同葡萄酒活性干酵母發(fā)酵藍莓酒的感官評價

感官指標是描述和判斷藍莓酒品質(zhì)最直觀的指標，在一定主觀程度上對藍莓酒做出客觀分析的評價，能較好地反映藍莓酒的特征品質(zhì)和質(zhì)量要求。Rhone酵母發(fā)酵藍莓酒的得分相對較低，主要是相比其他酵母色澤偏淡、酒香及口感不足；DV和RV色澤相對較好，香氣較濃郁，果香、酒香較協(xié)調(diào)，酒體完整；BV色澤深紫紅、香氣口感均佳，具有藍莓酒的典型性，按表3的評分標準，感官評分為95分，BV為優(yōu)選酵母，不同活性干酵母的感官評分雷達圖見圖4。綜合不同酵母的發(fā)酵特性，BV為適宜藍莓發(fā)酵的優(yōu)良活性干酵母。

表3 藍莓酒感官評分

圖4 藍莓酒感官評分雷達圖

2.5 BV酵母發(fā)酵藍莓酒過程中蔗糖、葡萄糖及果糖的變化

酵母對蔗糖的吸收利用前，先將蔗糖水解成葡萄糖和果糖，后兩者再分別經(jīng)過磷酸化進入糖酵解途徑。從圖5可以看出，藍莓汁發(fā)酵前蔗糖為98.76±1.94 g/L，發(fā)酵4 d后蔗糖快速下降至19.16±0.69 g/L，發(fā)酵6 d藍莓酒中的蔗糖已全部轉(zhuǎn)化成葡萄糖和果糖。葡萄糖發(fā)酵2 d減少緩慢，發(fā)酵4～9 d呈急劇下降趨勢，發(fā)酵20 d藍莓酒的葡萄糖未檢測出。果糖利用呈階段性下降趨勢，發(fā)酵前4 d保持穩(wěn)定，果糖含量保持在72 g/L左右，發(fā)酵6 d快速降至57.60±1.18 g/L，發(fā)酵9 d的果糖與6 d水平一致，發(fā)酵20 d后果糖殘留量為3.36±0.21 g/L。葡萄糖和果糖下降趨勢表明：作為酵母可直接利用的單糖糖源，葡萄糖優(yōu)先被酵母利用。

圖5 藍莓酒發(fā)酵過程中糖含量變化

2.6 BV酵母發(fā)酵藍莓酒過程總酸的變化

調(diào)整藍莓汁發(fā)酵初始總酸含量6.01±0.20 g/L，從圖6可以看出，總酸的總體趨勢為：發(fā)酵初期緩慢上升，發(fā)酵4～6 d總酸快速上升，發(fā)酵6 d的總酸含量最高，為7.5±0.16 g/L，發(fā)酵后期下降并逐漸穩(wěn)定，主發(fā)酵結(jié)束時降至6.7±0.19 g/L。酵母發(fā)酵初期會產(chǎn)生乙酸、琥珀酸、蘋果酸、丙酮酸等[17]，導(dǎo)致藍莓酒總酸升高。發(fā)酵后期可能進行乳酸發(fā)酵，多元酸轉(zhuǎn)變成一元酸，使總酸又有所回落[18]；乙酸發(fā)酵期間部分被酵母還原成乙醇，蘋果酸也可能在適溫條件下被酵母降解[17]；同時部分酸與醇形成酯類物質(zhì)，使得藍莓酒的總酸含量降低。發(fā)酵過程總酸變化情況表明BV酵母具有良好的降酸能力。

圖6 藍莓酒發(fā)酵過程中總酸含量變化

2.7 BV酵母發(fā)酵藍莓酒過程酒精度的變化

乙醇對酒的穩(wěn)定性及感觀特征有重要意義，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乙醇抑制了大多數(shù)雜菌的生長，這種抑菌作用可保證低酸、無氧的果酒保存多年[17]。藍莓酒發(fā)酵初期，酵母利用糖類物質(zhì)大量繁殖并產(chǎn)生少量酒精，發(fā)酵2～9 d過程中，藍莓酒的酒精度快速增加至8.4%vol±0.3%vol；至發(fā)酵中后期（10～20 d），酵母發(fā)酵的速率降低，殘?zhí)橇繙p少，且藍莓酒中的酒精會對酵母產(chǎn)生一定的抑制作用，使酒精度增長緩慢，主發(fā)酵20 d酒精度達到11.5%vol±0.2%vol，基本達到預(yù)設(shè)酒度。

圖7 藍莓酒發(fā)酵過程中酒精度變化

2.8 BV酵母發(fā)酵藍莓酒過程總花色苷的變化

花色苷是一種易降解的類黃酮物質(zhì)，它的穩(wěn)定性易受到多種因素的影響[19]?；ㄇ嗨貥O不穩(wěn)定, 花青素首先降解形成查耳酮, 之后繼續(xù)降解, 形成如間苯三酚醛和原兒茶酸化合物[20], 降解影響其生物活性。如圖8所示，藍莓汁未發(fā)酵時的花色苷含量最高，達到279.87±3.32 mg/L，發(fā)酵9 d后降至153.46±2.39 mg/L，發(fā)酵20 d后花色苷含量為56.28±3.57 mg/L，藍莓酒中的花色苷呈現(xiàn)持續(xù)減少的趨勢，與劉慧等[6]的研究結(jié)果一致。酵母開始發(fā)酵后，花色苷在酸、氧、光、熱等共同因素作用下而分解，同時由于部分酵母自溶產(chǎn)生的酵母泥、果皮吸附部分花色苷，從而使花色苷在主發(fā)酵期間出現(xiàn)快速減少現(xiàn)象[18,21]。

圖8 藍莓酒發(fā)酵過程中總花色苷含量變化

3 結(jié)論與討論

活性干酵母具有易于保藏、發(fā)酵迅速、品質(zhì)穩(wěn)定、使用方便等特點，在果酒加工中得到廣泛應(yīng)用。酵母菌種是果酒發(fā)酵最關(guān)鍵的因素，同一原料采用不同菌種，果酒的品質(zhì)差別較大。陳趕林等[22]采用7種活性干酵母發(fā)酵蓮霧果汁，篩選出最適的Lalvin 71B降酸干酵母，其發(fā)酵的蓮霧果酒色、香、味俱佳。劉國明等[23]根據(jù)發(fā)酵效率和感官評分結(jié)果，從10種釀酒酵母中篩選出適宜荔枝發(fā)酵的菌種Lalvin EC1118。此次試驗選擇四種葡萄酒活性干酵母應(yīng)用于藍莓酒的發(fā)酵研究，旨在篩選一種適合藍莓發(fā)酵的優(yōu)良酵母，為藍莓酒的加工提供參考。結(jié)果表明，BV酵母的發(fā)酵能力較強，發(fā)酵酒的總花色苷含量高達87.34±2.07 mg/L，感官評分95分，適宜于藍莓酒發(fā)酵。對BV酵母發(fā)酵過程中糖組分、酒精度、總酸、總花色苷等營養(yǎng)成分變化規(guī)律進行研究，進一步明確了BV酵母加工藍莓酒的發(fā)酵特性，對于BV酵母的生理生化特性及應(yīng)用于藍莓酒的發(fā)酵工藝還有待于進一步研究。此次試驗為藍莓酒的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。