于殿宇 唐洪琳 周 琪 劉競陽 徐 博 王 利 羅淑年 秦蘭霞* 王立琦

（1 東北農(nóng)業(yè)大學食品學院 哈爾濱150030 2 哈爾濱商業(yè)大學計算機與信息工程學院 哈爾濱150028 3 黑龍江省完達山乳業(yè)股份有限公司 哈爾濱150020 4 九三集團哈爾濱惠康食品有限公司 哈爾濱150010）

大豆油原料豐富，營養(yǎng)價值高，是我國消費量最多的油脂，它含有豐富的不飽和脂肪等必需脂肪酸，有益于人體健康，其中亞油酸的含量為50%以上[1-3]。然而，在油脂精煉過程中，毛油要經(jīng)受高溫、酸堿和金屬設(shè)備，油脂的化學組成會發(fā)生變化，也會形成一定量的反式脂肪酸 （Trans fatty acid，TFA）[4-7]。研究證實長期攝入TFA 容易引發(fā)動脈粥樣硬化、血栓、冠心病和心臟病等心血管疾病，TFA 的攝入量每增加2%，患心血管疾病的危險性就增加25%[8-11]。此外，油脂在深度加熱或煎炸的過程中也會產(chǎn)生氫過氧化物及醛、酮、反式脂肪酸等物質(zhì)，造成油脂氧化酸敗，影響食品風味及正常食用，甚至危害人體健康[12-15]。蘇德森等[16]研究了5 種食用油在加熱過程中TFA 的形成和變化。結(jié)果表明：加熱溫度、加熱時間和食用油中脂肪酸組成均是影響反式脂肪酸形成和變化的因素，并且隨著加熱溫度的升高或加熱時間的延長，食用油中反式脂肪酸種類和含量都不斷增加。李安等[17]研究比較了大豆油加熱過程中的TFA 與酸價、羰基價和極性組分等理化指標的變化情況。研究發(fā)現(xiàn)隨著加熱時間的延長，油脂的品質(zhì)逐漸下降，酸價、羰基價和極性組分3 種指標含量極顯著增加。姚世勇等[18]對加熱的花椒籽仁油中的研究結(jié)果證實，反式脂肪酸生成的多少與加熱的油脂和時間呈正相關(guān)關(guān)系。

C=C 雙鍵在異構(gòu)化旋轉(zhuǎn)之前，雙鍵會受極端條件的影響而遭到明顯破壞。這樣就會直接打破π 鍵，跨越異構(gòu)化旋轉(zhuǎn)所需要的能量勢壘。隨著π鍵的斷裂，脂肪酸的反式異構(gòu)化更容易形成。Karabulut 等[19]研究發(fā)現(xiàn)在油氫化過程中被金屬（如鎳）和自由基（如硫代自由基）催化會導致C=C雙鍵的異構(gòu)化；蒲敏等[20]采用量子化學中的密度泛函理論計算方法，在B3LYP/6-31G** 和B3LYP/6-311++G** 基組水平上研究羥基丙烯醛的雙鍵旋轉(zhuǎn)異構(gòu)反應(yīng)機理，發(fā)現(xiàn)該異構(gòu)化反應(yīng)存在兩個過渡態(tài)和一個重排四元環(huán)骨架的中間體；Tsuzuki等[21]在研究油酸甘油三酯的熱致異構(gòu)化時，計算異構(gòu)化反應(yīng)所需的能量約為106 kJ/mol。Li 等[22]對加熱過程中油脂中的非共軛亞油酸的熱致異構(gòu)化進行研究，從量子化學的角度上揭示加熱油脂中非共軛亞油酸的分子結(jié)構(gòu)變化及能量途徑。溫度是導致不飽和脂肪酸熱異構(gòu)化的關(guān)鍵因素。順、反式脂肪酸分子本身的熱穩(wěn)定性與異構(gòu)化反應(yīng)發(fā)生的可能性明顯相關(guān)。目前對于強酸或強堿處理后的加熱油脂中雙鍵引起的熱誘導異構(gòu)化的機理鮮有報道。

本研究以大豆毛油為原料，在大豆毛油中加入85%的H3PO4（或18 Be°NaOH）溶液，添加量為0.3%，反應(yīng)一定時間后水洗，得到H3PO4處理后的油脂樣品或NaOH 處理后的油脂樣品。以大豆毛油常規(guī)加熱為對照，研究了H3PO4處理的油脂樣品或NaOH 處理的油脂樣品在不同加熱溫度、時間的條件下大豆油中反式亞油酸含量的變化，并對其損耗途徑及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行能壘分析，從分子角度能量入手研究異構(gòu)化反應(yīng)途徑，從分子本質(zhì)上揭示異構(gòu)化反應(yīng)機理，為尋找強酸或強堿處理后油脂熱致異構(gòu)化形成TFA 的控制措施提供了可能性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脂肪酸標樣，美國西格瑪奧德里奇公司；大豆毛油（C18∶2-9t，12c∶0%；C18∶2-9c，12t∶0%；C18∶2-9t，12t∶0%），九三糧油工業(yè)集團有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A 氣相色譜儀，美國安捷倫公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市英峪高科儀器廠；LD4-2A 型低速臺式離心機，北京京立離心機有限公司；VIC-612 型精密電子天平，德國Acculab 公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆油加熱試驗 稱取100 g 的大豆毛油加入85%的磷酸（或18 Be°氫氧化鈉）溶液，添加量為0.3%，攪拌10 min，靜置。水洗后4 000 r/min離心分離去上清液。開始進行加熱試驗，取上述處理后的油樣3 g 于5 mL 的安瓿瓶中，密閉封口（頂部留有空氣）。其它油樣的準備方法與上述方法相同。將安瓿瓶至于油浴鍋中分別達到220，240，260 ℃時，開始計時，加熱時間為2，4，6，8 h。新鮮大豆毛油作為對照樣本與加熱樣本進行比較。每個溫度與加熱時間都進行3 次重復試驗，溫差控制在±2 ℃。

1.3.2 反式脂肪酸的分析 按照參考文獻[23]的方法進行甲酯化。使用Aligent7890A 氣相色譜儀，安捷倫公司CP-Sil-88 強極性毛細管氣相色譜柱（100 m×0.25 nm×0.2 μm），氫火焰離子檢測器（FID）。載氣：N2，流量30 mL/min；燃氣：H2，流量30 mL/min；助燃氣：空氣，流量380 mL/min；進樣口溫度260 ℃，檢測溫度260 ℃；柱前壓281.7 kPa，柱溫170 ℃，分流比100∶1，進樣量1 μL。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用 Orgine 8.5 軟件和SPASS 軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析，鍵能的計算工作利用Gaussian09 軟件完成，計算級別采用B3LYP/-311++g**。

2 結(jié)果與分析

2.1 強酸、強堿對加熱大豆油脂產(chǎn)生反式亞油酸的影響

2.1.1 在220 ℃加熱條件下大豆油脂產(chǎn)生的反式亞油酸 將H3PO4處理后的油脂樣品，NaOH 處理后的油脂樣品，未經(jīng)處理的油脂樣品，分別置于油浴鍋中加熱，研究3 種樣品在220 ℃的條件下分別加熱2，4，6，8 h 后3 種反式亞油酸的含量，其變化規(guī)律如圖1所示。

由圖可知，當大豆油脂加熱時，經(jīng)過酸或堿處理后的油脂，產(chǎn)生的反式脂肪酸要多于常規(guī)加熱時產(chǎn)生的反式脂肪酸，當220 ℃加熱2 h 時，NaOH處理后的油脂樣品產(chǎn)生C18∶2-9c，12t 與C18∶2-9t，12c 分別為0.581%，0.587%，而產(chǎn)生的全反式脂肪酸僅為0.046%，可得C18∶2-9c，12t 和C18∶2-9t，12c 為加熱大豆油脂反式亞油酸中的主要反式異構(gòu)體[24]，并且單反式亞油酸含量顯著高于全反式亞油酸含量，這可能與每步異構(gòu)化反應(yīng)能壘有關(guān)；隨著加熱時間的不斷增加，加熱油脂受酸堿影響的效果也會隨之變大，其影響產(chǎn)生反式亞油酸的順序為：NaOH 處理后油樣＞H3PO4處理后油樣＞未處理油樣。這可能是亞油酸中的雙鍵受堿作用影響比較大，在加熱過程中更容易發(fā)生異構(gòu)化，產(chǎn)生一定量的反式亞油酸。

圖1 在220 ℃的溫度下反式亞油酸的含量Fig.1 The content of trans linoleic acid at 220 ℃

2.1.2 在240 ℃條件下加熱大豆油脂的結(jié)果 將H3PO4處理后的油脂樣品，NaOH 處理后的油脂樣品，未經(jīng)處理的油脂樣品，分別置于油浴鍋中加熱，研究3 種樣品在240 ℃的條件下分別加熱2，4，6，8 h 后3 種反式亞油酸的含量，其變化規(guī)律如圖2所示。

圖2 在240 ℃的溫度下反式亞油酸的含量Fig.2 The content of trans linoleic acid at 240 ℃

從圖中可以得出，隨著加熱時間的不斷增加，反式亞油酸的含量不斷增加，經(jīng)過酸、堿處理后的加熱油脂也隨著加熱的時間的增加，相差越大；當加熱至8 h 時，經(jīng)過NaOH 處理后的加熱油脂產(chǎn)生的C18∶2-9t，12c 最多，可達1.07%。

2.1.3 在260 ℃加熱條件下大豆油脂產(chǎn)生的反式亞油酸 將H3PO4處理后的油脂樣品，NaOH 處理后的油脂樣品，未經(jīng)處理的油脂樣品，分別置于油浴鍋中加熱，研究3 種樣品在260 ℃的條件下分別加熱2，4，6，8 h 后3 種反式亞油酸的含量，其變化規(guī)律如圖3所示。

與圖1和圖2相比，從圖中可知，隨著加熱溫度的增加，這3 種反式亞油酸的含量也隨著增加，說明溫度是不飽和脂肪酸熱致異構(gòu)化的主導和最關(guān)鍵因素，反應(yīng)溫度越高，順式雙鍵活性越高，越容易克服反應(yīng)能壘，產(chǎn)生的TFA 越多。這與Liu[25]，Meiyan Yang[26]，Tsuzuki[27]等的研究結(jié)果的趨勢一致。當油脂在260 ℃條件下進行加熱8 h時，產(chǎn)生的反式單亞油酸（C18∶2-9c，12t）最多，可達1.222%。這可能是酸或堿處理和溫度的增加使其中不飽和脂肪酸發(fā)生異構(gòu)化和雙鍵重排產(chǎn)生反式酸幾率增加。

2.2 加熱過程中反式亞油酸的異構(gòu)化的能壘分析

2.2.1 油脂中順-反雙鍵的靜電勢分析 利用Gaussian09 軟件，采用B3LYP/-311++g** 的計算級別，對油脂中的順式、反式雙鍵進行靜電勢圖分析，其分析結(jié)果如圖4所示。

圖4 順-反模型靜電勢圖Fig.4 Cis-trans model electrostatic potential

從圖中可以得出，順式雙鍵與反式雙鍵的靜電勢分布具有顯著差別，由圖4a 可知，順式雙鍵中兩個H 位于碳碳雙鍵的一側(cè)[28]，等靜電勢面包覆體積小，當受到外界條件進攻時所需越過的能壘小，并且進攻時在空間上的取向要求寬松。而從圖4b 可得，反式雙鍵中兩個H 位于碳碳雙鍵的兩側(cè)[29]，等靜電勢面包覆體積大，當受到外界條件進攻時所需越過的能壘較高。從定性的角度分析，順式分子比反式分子更加容易發(fā)生改變，這與李安等[30]的研究結(jié)果一致。因此很好地解釋了在外加的環(huán)境條件下（如加熱、酸處理、堿處理），不飽和脂肪酸向能量更低、分子更穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化。

2.2.2 常規(guī)加熱過程中反式亞油酸的異構(gòu)化的能壘分析 在240 ℃條件下加熱未處理的油脂4 h，利用Gaussian09 軟件，采用B3LYP/-311++g** 的計算級別，得到油樣異構(gòu)化的能量途徑變化，其分析結(jié)果如圖5所示。

從圖中可以看出，兩種過渡態(tài)處在反應(yīng)勢能面的鞍點位置，其一端連接反應(yīng)物，另一端連接產(chǎn)物。單反式異構(gòu)體和分別處在勢能曲線的極小值點，均為異構(gòu)化形成的中間產(chǎn)物。順式亞油酸跨越一座能壘異構(gòu)化形成單反式亞油酸后，再繼續(xù)克服一座能壘而形成雙反式亞油酸。順式亞油酸變成全反式亞油酸需要跨越兩個能量，分別為235.986，223.846 kJ/mol，這也解釋了上述3 種反式亞油酸中，單反式亞油酸的含量要多于雙反式亞油酸的含量。

2.2.3 強酸條件下加熱過程中反式亞油酸的異構(gòu)化的能壘分析 在240 ℃條件下加熱將H3PO4處理后的油脂樣品4 h，利用Gaussian09 軟件，采用B3LYP/-311++g** 的計算級別，得到油樣異構(gòu)化的能量途徑變化，其分析結(jié)果如圖6所示。

從圖中可以看出，順式亞油酸變成全反式亞油酸需要跨越兩個能量，當順式亞油酸跨越一座能壘異構(gòu)化形成單反式亞油酸后，需跨越232.812 kJ/mol 能量，當單反式亞油酸跨越一座能壘異構(gòu)化形成全反式亞油酸后，又需要跨越219.379 kJ/mol。與圖4相比，兩個能量都有所降低，分別降低了3.174，4.467 kJ/mol，說明強酸條件下處理后加熱油脂中的順式亞油酸更容易轉(zhuǎn)變成反式亞油酸。

2.2.4 強堿條件下加熱過程中反式亞油酸的異構(gòu)化的能壘分析 在240 ℃條件下加熱將NaOH 處理后的油脂樣品4 h，利用Gaussian09 軟件，采用B3LYP/-311++g** 的計算級別，得到油樣異構(gòu)化的能量途徑變化，其分析結(jié)果如圖7所示。

圖7表示NaOH 處理后加熱油脂中亞油酸異構(gòu)化反應(yīng)能量途徑。從圖中可以看出，當順式亞油酸跨越一座能壘異構(gòu)化形成單反式亞油酸后，需跨越225.471 kJ/mol 能量，當單反式亞油酸跨越一座能壘異構(gòu)化形成全反式亞油酸后，又需要跨越214.173 kJ/mol。兩個能量都低于圖5和圖6中的能量，說明NaOH 處理的加熱油脂反式異構(gòu)體的幾率影響最強，加熱油脂中的順式亞油酸更容易轉(zhuǎn)變成反式亞油酸的難易程度順序為：NaOH 處理后油樣＞H3PO4處理后油樣＞未處理油樣。這與加熱試驗中的氣相色譜分析相一致。

3 結(jié)論

圖5 常規(guī)加熱條件下亞油酸異構(gòu)化反應(yīng)能量途徑Fig.5 Energy pathway of linoleic acid isomerization under conventional heating conditions

圖6 H3PO4 處理后加熱油脂中亞油酸異構(gòu)化反應(yīng)能量途徑Fig.6 Heating oil in the linoleic acid isomerization reaction energy pathway after H3PO4 treatment

圖7 NaOH 處理后加熱油脂中亞油酸異構(gòu)化反應(yīng)能量途徑Fig.7 Heating oil in the linoleic acid isomerization reaction energy pathway after NaOH treatment

溫度是不飽和脂肪酸熱致異構(gòu)化的主導和最關(guān)鍵因素，3 種油樣加熱后產(chǎn)生反式亞油酸的順序為：NaOH 處理后油樣＞H3PO4處理后油樣＞未處理油樣。通過結(jié)構(gòu)和能量變化途徑理論揭示了直接異構(gòu)化反應(yīng)機理?；M水平上對反式雙鍵異構(gòu)化的靜電勢分析，從定性的角度分析了順式分子比反式分子更加容易發(fā)生改變。通過亞油酸異構(gòu)化反應(yīng)能量確認了反應(yīng)過渡態(tài)和反應(yīng)途徑，全順式亞油酸向全反式亞油酸異構(gòu)化過程包含4 個過渡態(tài)和2條途徑；H3PO4處理或NaOH 處理均會降低加熱過程中生成反式亞油酸的能量，其中強堿處理的降低的能量最大。從而進一步揭示了強酸或強堿處理對加熱油脂異構(gòu)化的反應(yīng)機理。