陳笑語 張力元 紀(jì)海玉 劉安軍

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院 天津300457）

渤海蝦醬醬色鮮艷，醬質(zhì)細(xì)膩，組織均勻，氣味鮮香、口感好，醬香味和蝦鮮味濃郁，含有優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)、鈣、鐵、硒、維生素A 和脂肪酸等營養(yǎng)元素。蝦醬中還有蝦青素和甲殼素兩個重要的因子，其中被稱為超等維生素的蝦青素，具有維生素A、維生素E 和β 胡蘿卜素，可以改善免疫力，阻擋紫外線的傷害，提高視力能力，還可避免不飽和脂肪酸被氧化。甲殼素具有降血壓、降低膽固醇以及抗菌等功能。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，蝦醬的風(fēng)味和保健活性與其中的微生物菌群密切相關(guān)。孫業(yè)盈等[1]通過研究蜢子蝦醬，分離鑒定出一株嗜鹽菌，經(jīng)鑒定確定為鹽脫氮枝芽孢桿菌，其屬于枝芽孢桿菌屬。連鑫等[2]對蝦醬中呈味優(yōu)勢菌種進(jìn)行挑選、分離鑒定，發(fā)現(xiàn)一株產(chǎn)香酵母，為季氏畢赤氏酵母，分析結(jié)果表明：菌株耐受高鹽環(huán)境，對菌株進(jìn)一步純化，提高耐鹽性，用于低鹽蝦醬的發(fā)酵，提高蝦醬發(fā)酵香氣，控制產(chǎn)品質(zhì)量。連鑫等[3]從蝦醬中分離出一株產(chǎn)蛋白酶霉菌，確定為黑曲霉，通過研究其在蝦醬生產(chǎn)中各種因素對于風(fēng)味變化的影響，對其產(chǎn)蛋白霉菌進(jìn)行改造，為傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)的菌株。

傳統(tǒng)蝦醬中由于含有多種多樣的微生物菌群，因此形成了比較穩(wěn)定的微生物系統(tǒng)[4]，風(fēng)味良好，營養(yǎng)豐富，具有多種保健功能。鑒于目前對蝦醬的研究主要集中在風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)菌群方面，而對其益消細(xì)菌鮮有研究報道。本研究用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對渤海蝦醬中的細(xì)菌進(jìn)行分離，采用PCR 測序技術(shù)對其進(jìn)行鑒定，并研究該菌株的耐熱性，為蝦醬在食品加工過程中的合理利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

渤海蝦醬：黃驊市王曼老李水產(chǎn)品有限公司。

培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖MRS 培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，購買于北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

試劑：無水乙醇，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；27F 引物和1492R 引物，北京鼎國盛世有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電泳儀，美國Thermo 公司；冷凍離心機(jī)，美國Thermo 公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 傳統(tǒng)蝦醬生產(chǎn)工藝 工藝流程：原料去雜洗滌→裝入瓷缸→加入鹽度為25%～30%的鹽水→拌勻→控制溫度25～30 ℃發(fā)酵→30 d 后油、醬分離→包裝巴氏滅菌。蝦醬中鹽度一般控制到27%左右為佳，鹽分過高過低都會直接影響微生物的生存以及蝦醬的口感。

1.3.2 細(xì)菌的分離和純化 在無菌條件下，取蝦醬樣品1 g 于錐形瓶中，注入9 mL 蒸餾水振蕩搖勻（8 000 r/min，5 min），按10-1，10-2，10-3 梯度稀釋并涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。然后用接種環(huán)挑取分離得到的細(xì)菌菌株，接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)進(jìn)行純化，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。

1.3.3 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)鑒定 用接種環(huán)挑取分離純化后的細(xì)菌菌株，接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察并記錄培養(yǎng)皿中菌落的形態(tài)特點(diǎn)，觀察菌落形態(tài)并計數(shù)，然后通過革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài)。

1.3.4 細(xì)菌的生理生化試驗 根據(jù)《The Yeasts：A Taxonomic Study》對分離菌株進(jìn)行糖、醇發(fā)酵試驗、V-P 試驗、甲基紅（Methyl Red）試驗、靛基質(zhì)吲哚試驗。

1）糖、醇發(fā)酵試驗：將分離純化后的菌株做糖發(fā)酵試驗，檢驗菌株對各種糖醇類碳源的利用情況，將菌株制備成菌懸液，將裝有培養(yǎng)液的杜氏小管倒置放入試管中，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)5 d，如果顏色為紫色無氣泡，不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣為陰性；如果顏色為黃色無氣泡，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣為陽性；如果顏色為黃色有氣泡，產(chǎn)酸產(chǎn)氣為0。測定的糖類（醇、糖苷）包括：葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖（1.5%）、半乳糖（1.5%）、D-山梨醇、果糖、阿拉伯糖、麥芽糖、纖維二糖、木糖、水楊苷等[5-7]。

2）乙酰甲基甲醇V-P 試驗：將分離純化后的菌株做V-P 試驗，將試驗菌接種于上述培養(yǎng)基，于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)4 d、培養(yǎng)液2.5 mL，先加入a 萘酚 （2-na-phthol）純酒精溶液0.6 mL，再加40%氫氧化鉀水溶液0.2 mL，搖動2～5 min，若出現(xiàn)紅色，可判定為陽性細(xì)菌，若無紅色出現(xiàn)，靜置于36 ℃±1 ℃恒溫箱，如2 h 內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色，可判定為陰性細(xì)菌。

3）甲基紅（Methyl Red）試驗：將分離純化后的菌株做甲基紅試驗，挑取新的待試純培養(yǎng)物少許，接種于通用培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，從第2 天起，每日取培養(yǎng)液1 mL，加甲基紅指示劑1～2 滴，陽性呈鮮紅色，弱陽性呈淡紅色，陰性為黃色。至發(fā)現(xiàn)陽性或至第5 天仍為陽性，即可判定結(jié)果。

4）靛基質(zhì)吲哚試驗 ：將分離純化后的菌株做靛基質(zhì)吲哚試驗，取裝有蛋白胨水培養(yǎng)液的試管5 支，分別標(biāo)記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形菌、枯草芽孢桿菌和空白對照。以無菌操作分別接種少量菌苔到以上相應(yīng)試管中，第5 管作空白對照不接種，置37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48 h。在培養(yǎng)液中加入乙醚1～2 mL，經(jīng)充分振蕩使吲哚萃取至乙醚中，靜置片刻后乙醚層浮于培養(yǎng)液的上面，此時沿管壁緩慢加入5～10 滴吲哚試劑，如有吲哚存在，乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，此為吲哚試驗陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)，陽性用“+”、陰性用“-”表示。

1.3.5 16 SrDNA 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建方法采用煮沸法提取目的基因，參照細(xì)菌的16sDNA序列分析，選取細(xì)菌1492R 與27F 通用引物（見表1），進(jìn)行PCR 反應(yīng)。選擇單菌落作為目的模板，反應(yīng)條件：變性94 ℃，1 min，退火58 ℃，45 s，延伸72 ℃，45 s，一共需要29 個循環(huán)。用移液器吸取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，開始瓊脂糖凝膠電泳反應(yīng)，根據(jù)圖判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的分子質(zhì)量大小，并保存觀察，將擴(kuò)增成功的PCR 產(chǎn)物送檢（PCR 產(chǎn)物的測序工作由北京鼎國盛世有限公司完成）。將測序結(jié)果登錄NCBI 網(wǎng)站用BLAST 程序進(jìn)行序列比對，用ClustalX 2 軟件進(jìn)行多序列比對（Multiplealignments），用軟件MEGA5.2 進(jìn)行分析獲得系統(tǒng)進(jìn)化樹[8-9]。

分子鑒定試驗步驟：

目的基因的提?。喝「粢沟木? mL 于離心管中，振蕩搖勻（11 000 r/min，1 min），棄上清液，再取1 mL 菌液，離心，然后取150 μL 滅菌水吹洗菌體沉淀物，離心，棄上清液，反復(fù)洗滌2 次。用一次性手套包上離心管，開水煮10 min（煮沸過程中實時拿出爆蓋離心管，排氣后，再放回，振蕩搖勻）。取上清液，即所需要的目的基因。

表1 引物堿基序列Table 1 Primer base sequence

PCR 擴(kuò)增目的基因：取一個干凈的小離心管，依次加入17 μL H2O，0.5 μL Mg2+，1 μL 基因模板，2 μL dNTP，2 μL Buffer，0.5 μL Taq 酶，1 μL 27F，1 μL 1492R，放入PCR 儀中反應(yīng)，設(shè)置程序（見表2）。制作膠體，取0.4 g 瓊脂糖，加25 mL EDTA 緩沖液，再加入0.9 mL EB 溴乙錠液體，放置15 min 膠體便制好，加樣跑膠，上機(jī)marker 跑膠出圖[10-15]。

表2 PCR 程序Table 2 PCR program

MEGA 5 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹：

1）準(zhǔn)備序列文件 準(zhǔn)備txt.格式序列文件。

2）多序列比對 開啟MEGA 5 系統(tǒng)，單擊Align→Edit/Build Alignment→Create a new alignment，點(diǎn)擊OK，選擇序列為核酸DNA。選好之后，單擊Edit→Insert Sequence From File，選擇需要的序列文件，點(diǎn)擊按鈕→Align DNA，在彈出的窗口中，選擇默許的比對參數(shù)，點(diǎn)OK，進(jìn)行序列比對，刪除兩端沒有比對上的序列，并保存文件。

3）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 在多序列比對窗口中，點(diǎn)擊Data→Phylogenetic Analysis，所用序列是否編碼蛋白質(zhì)，選Yes。返回MEGA 5 主界面，點(diǎn)擊Phylogeny →Construct/Test Neighbor-Joining Tree…彈出的對話框：使用當(dāng)前的數(shù)據(jù)，選Yes，Bootstrap 為1 000，點(diǎn)擊Compute。建樹完成后，注意點(diǎn)擊Bootstrap consensus tree 查看樹形。保存文件為filename.mts（可以用MEGA 5 打開）[16-24]。

1.3.6 細(xì)菌耐熱性分析 將細(xì)菌懸液 （2.2×1010CFU/mL，6×109個）平均分成6 份，分別置于20，40，60，80，100，120 ℃的溫度下處理5 min 和10 min，然后分別接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)（37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h）并計數(shù)，每組3 個平行，統(tǒng)計菌落數(shù)。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 采用ClustalX 2 對菌株Y8 及模式菌株序列進(jìn)行比對，MEGA5.2 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。采用Excel 軟件作圖，結(jié)果由3 個平行樣的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌菌株的形態(tài)學(xué)初步鑒定

從營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中挑取分離純化的菌株，利用光學(xué)顯微鏡觀察其顏色、形態(tài)特征（見圖1），并對比《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》，然后進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定分析。

根據(jù)對兩種細(xì)菌菌落形態(tài)及革蘭氏染色觀察，發(fā)現(xiàn)兩種菌株均呈短細(xì)桿狀，表面較粗糙扁平濕潤，半透明乳白色，且革蘭氏染色為藍(lán)紫色陽性。

2.2 細(xì)菌菌株的生理生化鑒定

對菌株進(jìn)行糖發(fā)酵試驗，結(jié)果如下。

菌株A1 和A2 的糖發(fā)酵試驗結(jié)果見表3。乙酰甲基甲醇V-P 試驗呈現(xiàn)紅色，判定其為陽性菌。甲基紅（Methyl Red）試驗呈鮮紅色，判定其為陽性菌。靛基質(zhì)吲哚試驗有吲哚存在，乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，確定為吲哚試驗陽性反應(yīng)。

2.3 對細(xì)菌的16SrDNA 序列基因片段的擴(kuò)增

本試驗以1492R 和27F 作為引物，來進(jìn)行PCR 擴(kuò)增目的基因，得到的DNA 片段，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳試驗，可以看到一條長度為1 100 bp左右的擴(kuò)增條帶，PCR 基因擴(kuò)增圖（見圖2）。

圖1 菌株的菌落形態(tài)及菌體形態(tài)（×40）Fig.1 Colony and thallus morphology of the strain（×40）

表3 菌株的糖發(fā)酵試驗Table 3 Strain sugar fermentation experiment

結(jié)果表明：菌株A2 沒有擴(kuò)增成功，舍去。菌株A1 的16SrDNA 基因片段擴(kuò)增成功，可以將其送到北京鼎國盛世有限公司直接測序。

2.4 測序結(jié)果的BLAST 比對

雙向測序結(jié)果如表4所示，將公司測序所得到的DNA 序列，輸入NCBI 的數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行BLAST 比對，發(fā)現(xiàn)其與地衣芽孢桿菌中的Bacillus licheniformis ZF23 序列的相似度為98%，確定菌株A1 為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

序列比對分值為1 871 bits，因為分?jǐn)?shù)值越高說明相似度越高；Expect 的期望值為0.0，說明比對效果很好；query cover 同源百分比為98%，Max ident 百分比為97%。確定菌株A1 為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

圖2 菌株A1 的16SrDNA 擴(kuò)增片段凝膠電泳圖Fig.2 The 16SrDNA amplifying fragment gel electrophoresis diagram of the strain A1

表4 菌株A1 的16SrDNA 序列的測序片段Table 4 Sequence of 16SrDNA sequences of strain A1

（續(xù)表4）

2.5 基于16SrDNA 序列分析的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建及分子鑒定

根據(jù)序列BLAST 比對結(jié)果，選擇同源性較高的菌株，建立系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析菌株的種屬地位。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。由圖3可以看出菌株A1 與地衣芽孢桿菌的親緣關(guān)系，菌株A1 與菌株Bacillus licheniformis strain ZF23 發(fā)育距離相近，其中bootstrap 值為99，可見菌株A1 與其同源性較高，確定其為地衣芽孢桿菌菌種。

2.6 菌株A1 的耐熱性分析

由圖4、圖5可以看到菌株A1 對于高溫具有一定的耐受性，在加熱溫度低于40 ℃時活菌體數(shù)量基本沒有影響，但隨著加熱溫度的繼續(xù)升高其耐受力下降，當(dāng)加熱溫度高于100 ℃時，加熱5 min 和加熱10 min 菌體個數(shù)基本都趨于0，菌體失活。結(jié)果表明本研究從渤海蝦醬中分離的菌株A1耐熱性不強(qiáng)，80 ℃以上加熱熟制后，菌體基本失活，其助消化能力急劇降低。

圖3 菌株A1 的16SrDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.3 16SrDNA sequence analysis of strain A1 analysis of the neighbor-joining tree

圖4 菌株A1 加熱5 min 的菌體個數(shù)變化Fig.4 The changes of bacteria strains A1 after heating 5 min

圖5 菌株A1 加熱10 min 的菌體個數(shù)變化Fig.5 The changes of bacteria strains A1 after heating 10 min

3 結(jié)論

以渤海蝦醬為研究對象，通過營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對蝦醬中細(xì)菌進(jìn)行分離純化鏡檢，采用PCR 技術(shù)提取目的基因，并測序進(jìn)行BLAST 比對，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，得到1 株細(xì)菌A1，與地衣芽孢桿菌中的Bacillus licheniformis strain ZF23 的同源相似度為98%，其中bootstrap 值為99。對該菌株進(jìn)行耐熱性分析，發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌對于高溫耐受性較差，隨著加熱時間和溫度的增加其存活率逐漸下降，結(jié)果表明蝦醬在實際應(yīng)用過程中80 ℃及以上的加熱處理將致使其助消化能力顯著降低。本研究為蝦醬在食品加工過程中的合理利用提供一定的理論依據(jù)。