任嬌艷 李宇娟 張 婷 梁 明 袁爾東*

（1 華南理工大學食品科學與工程學院 廣州510641 2 中新國際聯(lián)合研究機構(gòu) 廣州510000 3 無限極（中國）有限公司 廣州510665）

鰹魚，屬于深海洄游魚類，魚肉蛋白質(zhì)豐富，血脂含量低，氨基酸組成比例與人體肌肉蛋白相近，吸收利用度高，且鰹魚蛋白酶解物具有顯著的降尿酸活性和抗氧化活性[1-3]。研究表明，從鰹魚魚肉中鑒定合成的多肽DLDLRKDLYAN 具有顯著的氧自由基和ABTS 自由基清除能力[4]。據(jù)日本YSK 公司報道，從鰹魚蛋白中提取出兩種天然低聚肽--鵝肌肽和肌肽，發(fā)現(xiàn)其具有顯著降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的功效。與大分子蛋白質(zhì)和游離氨基酸相比，鰹魚蛋白酶解所得小分子多肽更容易被人體吸收利用[5]。酶解法制備多肽，生產(chǎn)條件溫和，易控制，產(chǎn)品安全性高，是工業(yè)制備活性多肽的常用方法。蛋白質(zhì)和多肽對溫度敏感，且均為兩親性物質(zhì)，其存在形式容易受溶液酸、堿度和溫度的影響。此外，酶活性和加酶量的變化易使酶解物中多肽鏈的結(jié)構(gòu)及氨基酸組成發(fā)生變化，進而導致多肽化學圖譜和化學活性的改變。酶解多肽的活性必需通過體外化學反應(yīng)才能檢測到，操作繁瑣，無法在工業(yè)生產(chǎn)中實時監(jiān)測酶解產(chǎn)物的活性變化。研究多肽化學活性與其分子質(zhì)量圖譜、總氨基酸含量圖譜和質(zhì)譜間的相關(guān)性，對于明晰鰹魚蛋白活性肽“工藝-結(jié)構(gòu)表征-生物活性”三者間的關(guān)系具有重要的意義。

本試驗在不同酶解工藝條件下制備鰹魚蛋白肽差異樣品，研究其蛋白質(zhì)回收率、分子質(zhì)量分布、總氨基酸含量與降尿酸活性、抗氧化活性之間的譜效關(guān)系；對鰹魚蛋白肽進行分離純化和質(zhì)譜鑒定，探討鰹魚蛋白肽純化組分的降尿酸活性、抗氧化活性與質(zhì)譜分析圖譜間的相關(guān)性，旨在為活性肽工業(yè)化制備過程中的質(zhì)控提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰹魚，購自山東；黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶、細胞色素C（12 384 u）、抑肽酶（6 511 u）、氧化型谷胱甘肽（651 u）、Gly-Gly-Gly（189 u），購自sigma 公司；Trolox、Fluorescein、AAPH、氯化硝基四氮唑藍（NBT），購自阿拉丁試劑公司；木瓜蛋白酶，購自南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 主要儀器、設(shè)備

KDN-1 型自動凱氏定氮儀，上?？茣钥茖W儀器有限公司；Synergy H1 全功能微孔板檢測酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；A300 全自動氨基酸分析儀，德國曼默博爾公司；Akta 蛋白純化儀，美國通用電氣公司；高分辨高效液相質(zhì)譜聯(lián)用分析儀，德國布魯克公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 鰹魚蛋白肽樣品制備 將鰹魚魚糜與蒸餾水按料液質(zhì)量比1∶3 攪拌均勻，煮沸10 min 預(yù)處理滅酶，以鰹魚蛋白肽的蛋白質(zhì)回收率為指標，制備得到不同單因素條件下的差異樣品：

1）不同pH 條件 制備3 個pH （6.0，6.5，7.0）條件下, 加酶量（E/S）為1%木瓜蛋白酶，酶解溫度55 ℃酶解4 h 后，煮沸10 min 滅酶，于4 ℃，8 000 r/min 離心20 min 后過濾濃縮，-20 ℃冷藏備用。

2）不同溫度條件 根據(jù)蛋白質(zhì)回收率最高pH 7.0 條件，制備兩個溫度（50，60 ℃）條件下，1%木瓜蛋白酶酶解4 h 后煮沸10 min 滅酶，離心過濾濃縮后于-20 ℃冷藏備用。

3）不同加酶量條件 根據(jù)蛋白質(zhì)回收率最高pH 7.0，溫度55 ℃時，制備3 個加酶量（0.35%，0.50%，0.75%）條件的鰹魚蛋白肽樣品，-20 ℃冷藏備用。

1.3.2 蛋白質(zhì)回收率的測定 鰹魚魚肉中蛋白質(zhì)為主要含氮物質(zhì)，故其蛋白質(zhì)回收率可通過氮回收率來表征。采用凱氏定氮法 （GB/T 5009.5-2003）測定鰹魚蛋白肽的總氮含量，依據(jù)以下計算方法確定其蛋白質(zhì)回收率：

蛋白質(zhì)回收率 （Nitrogen recovery ratio，%）=[酶解后上清液中的氮含量（g）/酶解前底物中的氮含量（g）]×100%

1.3.3 XOD 抑制活性的測定 XOD 是尿酸合成的關(guān)鍵酶，體外XOD 抑制活性可作為評價樣品降尿酸活性的有效方法[6-8]。在嘌呤代謝過程中，XOD可將黃嘌呤和次黃嘌呤氧化成尿酸，其反應(yīng)原理如下：

參照文獻[9]和[10]，并稍作修改。分別將50 μL 待測樣 品，50 μL 0.05 U/mL 的XOD 加入96酶標儀檢測板中，37 ℃孵育10 min，加入150 μL 0.4 mmol/L 黃嘌呤溶液后，酶促反應(yīng)被啟動，同時記錄2 min 內(nèi)反應(yīng)體系在290 nm 處吸光值的動力學變化，以pH 7.5 PBS 緩沖液做參比，酶促反應(yīng)體系的初始反應(yīng)速率記為V0，樣品存在時酶促反應(yīng)體系的初始速率記為VS，按照以下公式計算樣品對XOD 活性的抑制率：

XOD 抑制活性 （XOD inhibitory activity，%）=（V0-VS）/V01.3.4 超氧陰離子（O2-）清除能力的測定 XOD催化黃嘌呤產(chǎn)生尿酸的同時生成了超氧陰離子（O2-），O2-可與NBT 結(jié)合生成紫色甲瓚。參 照文獻[9-10]，并稍作修改。分別將50 μL 待測樣品，50 μL 0.05 U/mL 的XOD 加入96 酶標儀檢測板中，37 ℃孵育10 min 后，加入150 μL 混合液（0.4 mmol/L 黃嘌呤+0.24 mol/L NBT），并記錄2 min內(nèi)反應(yīng)體系在290 nm 處的吸光值，以pH 7.4 PBS做空白對照，酶促反應(yīng)體系的初始反應(yīng)速率記為V0′，樣品存在時酶促反應(yīng)體系的初始速率記為VS′，按照以下公式計算樣品對O2-的清除能力：

O2-清除活性 （O2-Scavenging activity，%）=（V0′-VS′）/V0′

1.3.5 氧自由基清除能力 （ORAC）的測定 ORAC 方法是評價抗氧化劑對過氧自由基的清除能力，以維生素E 水溶性類似物Trolox 作為標準溶液，AAPH 為自由基引發(fā)劑，F(xiàn)luorescein 為熒光物質(zhì)，在485 nm 光激發(fā)下，可發(fā)射538 nm 的熒光。在水溶液中，AAPH 釋放過氧自由基將Fluorescein 氧化，熒光衰減?？寡趸瘎┩ㄟ^與過氧自由基結(jié)合，抑制其氧化Fluorescein，從而減緩熒光衰減的速度。

參照文獻[11]和[12]，并稍作修改。采用酶標儀檢測熒光強度的變化，分別向96 酶標儀檢測板中加 入20 μL 待 測 樣 品、Trolox（6.25，12.5，25，50 μmol/L）定量標準液和pH 7.4 PBS 緩沖液，37 ℃孵育10 min 后，加入200 μL Fluorescein 孵育20 min，其中對照組加入20 μL PBS 緩沖液，其余每孔加入20 μL AAPH，檢測2 h 內(nèi)反應(yīng)液在538 nm 處吸光值的變化。氧自由基清除能力ORAC 值是通過相對熒光衰減曲線面積S 的變化計算得出，公式如下：

物質(zhì)的量濃度/樣品物質(zhì)的量濃度

1.3.6 HPLC 分析鰹魚蛋白肽分子質(zhì)量分布 將標準品細胞色素C、抑肽酶、氧化型谷胱甘肽和Gly-Gly-Gly 配置成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的溶液，鰹魚蛋白肽樣品稀釋成質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的待測溶液，所有溶液均用0.22 μm 的微孔膜過濾后，采用AKTA 蛋白純化儀分離鰹魚蛋白肽，并分析其分子質(zhì)量分布范圍。蛋白純化洗脫條件為：色譜柱：Superdex peptide GL10/300；流動相：0.02 mol/L PBS+0.25 mol/L NaCl （pH=7.2），流速：0.5 mL/min，檢測波長：214 nm；樣品質(zhì)量濃度：5 mg/mL，進樣量：500 μL。

1.3.7 鰹魚蛋白肽的總氨基酸含量分析 參照文獻方法[13]，并稍作修改。準確吸取1 mL 樣品于水解管中，加入1∶1 分析純鹽酸5 mL，酒精噴燈封管后置烘箱中于110 ℃水解24 h，水解后的樣品冷卻至室溫，過濾到50 mL 容量瓶中定容，吸取2 mL 樣品置于60 ℃烘箱中脫酸至底部留有少許痕漬，再加入1 mL 樣品緩沖液混合均勻，經(jīng)0.22 μm 過濾器過濾后備檢。采用全自動氨基酸分析儀分析：色譜柱：membraPureT259 鈉離子交換柱；流動相流速：160 μL/min；茚三酮溶液流速：80 μL/min；檢測波長：脯氨酸在440 nm 處檢測，其余氨基酸均在570 nm 處檢測。

1.3.8 鰹魚蛋白肽的分離純化 DEAE-52 纖維素層析填料裝柱，以0.5 mL/min 流速先后用去離子水、0.05 mol/L NaCl、0.15 mol/L NaCl、0.5 mol/L NaCl 溶液階段洗脫，收集洗脫組分并濃縮至一定濃度，測定其相應(yīng)的XOD 抑制活性和ORAC 值。鰹魚蛋白肽差異樣品經(jīng)DEAE-52 纖維素層析分離純化后，活性最好的組分進一步采用Sephadex G15 純化，0.5 mL/min 流速，去離子水洗脫并收集各分離組分，濃縮至一定濃度后，測定其相應(yīng)的XOD 抑制活性和ORAC 值。

1.3.9 LC-MS/MS 鑒定純化組分的多肽序列 將組分B1、D1 和F1 配制成濃度為1 mg/mL 的待測溶液，進一步進行高效液相質(zhì)譜聯(lián)用分析。參照文獻方法[14-15]，并稍作修改，洗脫條件為：Agilent 1290/maXis Impact，LC-Agilent Technologies 1290 Infinity 超高相液相色譜和MS-BRUKER maXis Impact 高分辨質(zhì)譜儀，C18 反相色譜柱：Agilent SB-C18，流動相為乙腈梯度洗脫，1～4 min：20%～80% 乙腈水溶液；4～9 min：80%等度洗脫；9～10 min：80%～20%乙腈梯度洗脫。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件分析，質(zhì)譜結(jié)果采用Bruker Compass Data Analysis 4.1 軟件解譜，以P＜0.05 為顯著性評定指標，數(shù)據(jù)用x±SD 表示，試驗數(shù)據(jù)采用Graph prism 和origin 2017 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鰹魚蛋白肽降尿酸活性及抗氧化活性評價

由圖1a 可知，酶解pH 和溫度變化時，鰹魚蛋白肽的蛋白質(zhì)回收率隨pH 變化呈上升趨勢，鰹魚蛋白肽樣品S3 蛋白質(zhì)回收率最高，原因是木瓜蛋白酶對溫度和pH 敏感，在pH 7.0、溫度55 ℃時活性最高，其蛋白質(zhì)回收率最大。酶解加酶量增加時，木瓜蛋白酶酶解效率提高，從而使鰹魚蛋白肽的蛋白質(zhì)回收率升高。

由圖1b 和圖1c 可知，當酶解pH 升高時，差異樣品的XOD 抑制活性呈上升趨勢，其中S1 和S2 的ORAC 值 相 當，S3 的XOD 抑 制 活 性 和ORAC 值均顯著高于S1 和S2（P＜0.05），說明弱酸性或中性鰹魚蛋白肽的XOD 抑制活性和抗氧化活性更顯著；當酶解溫度升高時，鰹魚蛋白肽的XOD 抑制活性和ORAC 值均表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，溫度為55 ℃的鰹魚蛋白肽，其XOD 抑制活性和ORAC 值均顯著升高（P＜0.05），說明酶在最適溫度酶解效率提高，鰹魚蛋白肽中活性小分子多肽種類和數(shù)目明顯增多。當增加木瓜蛋白酶的加酶量時，鰹魚蛋白肽的XOD 抑制活性和ORAC 值均呈先降低后上升的趨勢，加酶量為0.5%的S7 顯著低于加酶量為0.35%和0.75%的S6 和S8，原因是木瓜蛋白酶對蛋白質(zhì)和多肽的酶解是非特異性的，S7 中可能含有較多活性較弱的多肽片段。

由圖2c 可知，鰹魚蛋白肽的XOD 抑制活性與ORAC 值二者顯著相關(guān)（P＜0.05），而氧自由基清除能力ORAC 值與樣品中羥基的存在有關(guān)[16]，說明鰹魚蛋白肽的XOD 抑制活性可能與多肽分子中的羥基有關(guān)。由圖2a 和圖2b 可知，當pH 條件變化時，XOD 抑制活性與蛋白質(zhì)回收率的變化具有相關(guān)性，蛋白質(zhì)回收率一定程度上能夠反映樣品的降尿酸活性。與此不同的是，在溫度和加酶量變化時，XOD 抑制活性和ORAC 值隨蛋白質(zhì)回收率的升高呈先降低后上升的趨勢，由于木瓜蛋白酶酶解的非特異性，加酶量及酶活性變化時，處于不同分子質(zhì)量段的多肽，其數(shù)目和種類都存在較大的差異性，從而導致活性之間的差異。

圖1 不同工藝制備鰹魚蛋白肽的蛋白質(zhì)回收率（a）、XOD 抑制活性（b）和抗氧化能力ORAC 值（c）Fig.1 The nitrogen recovery ratio，XOD inhibitory activity and antioxidant activity of bonito protein hydrolysates

圖2 （a）蛋白質(zhì)回收率與XOD 抑制活性的相關(guān)性（b）蛋白質(zhì)回收率與ORAC 值的相關(guān)性和（c）XOD 抑制活性與ORAC 值的相關(guān)性Fig.2 （a）The correlation of nitrogen recovery ratio with XOD inhibitory activity，（b）the correlation of nitrogen recovery ratio with ORAC values and （c）the correlation of XOD inhibitory activity and ORAC values

2.2 鰹魚蛋白肽分子質(zhì)量分布與體外活性的相關(guān)性

由圖3a 中差異樣品的分子質(zhì)量分布可知，分子質(zhì)量＞1 ku 所占含量最高的為樣品S6，最低的為樣品S1。由圖3b 和圖3c 可知，差異樣品的活性與分子質(zhì)量＜1 ku 的含量之間并無直接的線性相關(guān)關(guān)系，S6 中存在較多酶解不完全且分子質(zhì)量較大的多肽，其XOD 抑制活性相對較高；當分子質(zhì)量＜1 ku 的含量大于62.5%時，XOD 抑制活性在60%～70%和72.5%～82.5%范圍內(nèi)集中分布，ORAC 值在62.5%～73.5%和74%～85%范圍內(nèi)集中分布，說明通過檢測多肽分子質(zhì)量＜1 ku 的含量在不同區(qū)段的分布，可初步了解樣品的XOD 抑制活性和ORAC 值水平。

圖3 （a）鰹魚蛋白肽分子質(zhì)量分布（b）分子質(zhì)量＜1 ku 的含量與XOD 抑制活性的相關(guān)性和（c）分子質(zhì)量＜1 ku 含量與ORAC 值的相關(guān)性Fig.3 The molecular weight （Mw）of bonito protein hydrolysates （a）, the correlation of the percentage of Mw ＜1 ku with XOD inhibitory activity （b）and ORAC values （c）

2.3 鰹魚蛋白肽總氨基酸含量與體外活性的相關(guān)性

由圖4a 和圖4b 可知，鰹魚蛋白肽樣品中總氨基酸含量的差異主要表現(xiàn)為脂肪族氨基酸含量的不同，說明脂肪族氨基酸含量的變化是影響其活性差異的重要指標。由圖4c 可知，脂肪族氨基酸含量與蛋白質(zhì)回收率的變化無線性相關(guān)性，而脂肪族氨基酸含量的變化與XOD 抑制活性和ORAC 值的變化趨勢基本呈負相關(guān)，說明差異樣品的降尿酸活性和抗氧化活性可以通過脂肪族氨基酸含量的變化來評估其活性變化的可能趨勢。

圖4 鰹魚蛋白肽總氨基酸含量與體外活性的相關(guān)性Fig.4 Correlation between total amino acid content and in vitro activity of bonito protein peptide

2.4 鰹魚蛋白肽的分離純化及活性評價

差異樣品S1-S8 經(jīng)DEAE-52 纖維素層析純化后，發(fā)現(xiàn)去離子水洗脫組分的XOD 抑制活性和ORAC 值均顯著高于其它溶液洗脫組分，故將去離子水組分進一步用Sephadex G15 分離純化，純化后組分分別記為A1、B1、C1、D1、E1、F1、G1 和H1。純化組分的ORAC 值、XOD 抑制活性、O2-清除活性及30 min 時290 nm 處尿酸吸收值測定結(jié)果如圖5所示。

由圖5a 可知，分離純化后的組分A1-H1，除組分E1 的ORAC 值降低之外，其余樣品的ORAC值均顯著升高，說明大部分樣品在純化過程中氧自由基清除能力較強的多肽得到富集。

由圖5b 和圖5c 可知，酶促反應(yīng)在30 min 達到反應(yīng)平衡后，純化組分均具有顯著的降低尿酸含量的功效。然而，純化組分對黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤生成尿酸初始速度的相對抑制率評價其XOD 抑制活性時，組分A1、B1、C1、E1 和G1 均表現(xiàn)為促進酶促反應(yīng)的進行，同時測定其反應(yīng)體系O2-的變化時，發(fā)現(xiàn)這些組分具有較強的O2-清除活性，說明樣品在逐級純化過程中，活性多肽富集，當組分中抗氧化肽的有效分子數(shù)目明顯高于降尿酸肽的有效分子數(shù)目時，抗氧化活性成為純化組分發(fā)揮功效的主導，從而使酶促反應(yīng)向生成產(chǎn)物方向進行，導致反應(yīng)初始階段呈現(xiàn)出尿酸生成速率加快的現(xiàn)象。與此不同的是，組分D1、F1 和H1在反應(yīng)初始階段便具有較強的O2-清除活性和XOD 抑制活性，在反應(yīng)平衡后F1 和H1 的尿酸水平顯著降低，而D1 的尿酸吸光值降低不明顯，說明抗氧化肽加速反應(yīng)進行的同時并不改變反應(yīng)平衡時降尿酸肽的XOD 抑制活性。這與上述分子質(zhì)量分布圖譜及總氨基酸含量的分析結(jié)果一致，不同活性肽在差異樣品中分子數(shù)目所占含量，使其分子質(zhì)量分布圖譜、總氨基酸含量及體外化學活性改變，但樣品的降尿酸活性和抗氧化活性主要取決于組分中多肽的氨基酸序列。

圖5 鰹魚蛋白肽的分離純化及活性評價Fig.5 Purification and activity evaluation of bonito protein peptide

2.5 鰹魚蛋白肽的結(jié)構(gòu)鑒定與體外活性的相關(guān)性

根據(jù)上述試驗結(jié)果，為進一步了解鰹魚蛋白肽質(zhì)譜圖譜、氨基酸序列變化與其降尿酸活性、抗氧化活性之間的相關(guān)性，篩選差異樣品純化組分中XOD 抑制活性較強的B1 和F1 與活性較弱的D1，分析其LC-MS/MS 質(zhì)譜圖譜及氨基酸序列。

由圖6可知，組分B1 和D1 在1～4 min 內(nèi)基峰圖的峰形相似，其中B1 的信號明顯高于D1，且具有3 個明顯的峰形。在0～1 min 時，B1 和F1 均具有一個較強信號峰，組分F1 在1～3 min 內(nèi)信號較弱，在3～5 min 時信號較強，峰形明顯，基本為高濃度乙腈溶液洗脫出的疏水性多肽。

圖6 純化組分B1、D1、F1 的BPC 圖Fig.6 The basic peak chromatogram （BPC）of the purified fractions B1，D1 and F1

由表1可知，經(jīng)過DEAE-52 纖維素層析和Sephadex G15 分離純化后，組分F1 中多肽片段相對較純，WML 為疏水性多肽，組分B1 中LEYE、LPVI 和LPVPAF 為疏水性多肽，組分F1中LEYE 為疏水性多肽，其余多肽序列均為親水性多肽，其中親水性多肽AMPF 同時存在于組分B1 和F1 中，疏水性多肽LEYE 同時存在于組分D1 和F1 中。色氨酸及含有色氨酸的多肽已被證明具有顯著的XOD 抑制活性[17]，疏水肽WML 可能具有XOD 抑制活性。因此，結(jié)合圖6純化組分的基峰圖與圖5組分的活性分析結(jié)果，說明B1 和D1 的抗氧化活性可能與1～3 min 內(nèi)信號強的多肽片段相關(guān)，而B1 和F1 的XOD 抑制活性可能是由0～1 min 內(nèi)親水性多肽和3～5 min 內(nèi)疏水性多肽共同作用的結(jié)果，故1～3 min 內(nèi)信號最強的B1具有顯著的抗氧化活性，在XOD 活性測定時表現(xiàn)為加速酶促反應(yīng)的進行，使其反應(yīng)初始速率上升，而F1 在1～3 min 內(nèi)信號弱，故其抗氧化活性相對較低。

表1 組分B1、D1 和F1 鑒定出的多肽序列Table 1 The amino acid sequence of peptides identified from B1，D1 and F1

3 結(jié)論

不同工藝條件制備的鰹魚蛋白肽差異樣品，其XOD 抑制活性與氧自由基清除能力ORAC 值之間具有顯著的相關(guān)性。單因素pH 條件改變時，蛋白質(zhì)回收率的變化與鰹魚蛋白肽活性的變化趨勢一致。鰹魚蛋白肽的XOD 抑制活性和ORAC 值在多肽分子質(zhì)量＜1 ku 所含占比的不同分布區(qū)段集中，且與脂肪族氨基酸的含量呈相反的趨勢變化，從而可通過分子質(zhì)量分布和脂肪族氨基酸含量的變化對其化學活性進行初步評估。分離純化和質(zhì)譜結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果表明，純化組分質(zhì)譜基峰圖在0～1 min、1～3 min 和3～5 min 峰形分布可能與降尿酸肽和抗氧化肽在鰹魚蛋白中的分布顯著相關(guān)。因此，通過分析樣品的分子質(zhì)量分布圖譜、脂肪族氨基酸含量圖譜及純化后質(zhì)譜基峰圖圖譜，可進一步對鰹魚蛋白降尿酸肽和抗氧化肽的制備工藝進行質(zhì)控。