黃德良， 胡瑩

廣州現(xiàn)代醫(yī)院腫瘤科8病區(qū)(廣東廣州 511400)

肺癌，在我國男性群體，發(fā)病率和病死率居惡性腫瘤之首，為引起男性癌癥死亡的主要原因，在女性群體，發(fā)病率僅次于乳腺癌，病死率居首位[1]，嚴(yán)重威脅著人類的身體健康。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)構(gòu)成了不同個(gè)體對(duì)同質(zhì)群體中慢性復(fù)雜疾病(包括惡性腫瘤)的易感性，以及不同個(gè)體對(duì)藥物和環(huán)境因素不同反應(yīng)的遺傳基礎(chǔ)[2-4]。通過研究 SNP與疾病易感性、單基因疾病表型和藥物療效的相關(guān)性，可以進(jìn)一步探討人類疾病的遺傳基礎(chǔ)。既往對(duì)程序性死亡因子-1(PD-1)基因多態(tài)性與疾病關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，PD-1基因多態(tài)性與不同疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)間的關(guān)系不盡相同[5-6]。rs41386349位點(diǎn)為PD-1啟動(dòng)子多態(tài)性位點(diǎn)，其與PD-1基因啟動(dòng)子活性密切相關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)[7],PD-1 rs41386349位點(diǎn)基因多態(tài)性與腎癌的發(fā)病相關(guān)，該位點(diǎn)的突變?cè)黾恿四I癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但PD-1 rs41386349在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中發(fā)揮的功能并不為人熟知。如果能發(fā)現(xiàn)PD-1基因rs41386349位點(diǎn)與NSCLC微環(huán)境中影響抗腫瘤免疫應(yīng)答諸多因素間的關(guān)系，便可間接監(jiān)測NSCLC患者抗腫瘤免疫應(yīng)答功能的變化，以進(jìn)一步篩查肺癌易感人群，制定合理治療方案和預(yù)后具有重要的意義，目前尚未見PD-1 rs41386349基因多態(tài)性與NSCLC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的研究報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究共納入符合條件的NSCLC患者50例，病例來源于2017年6—12月間我院收治的患者，均經(jīng)電子支氣管鏡、經(jīng)皮肺穿刺、痰脫落細(xì)胞檢查、胸腔積液細(xì)胞學(xué)檢查和(或)手術(shù)病理確診。同時(shí)納入47例健康受試者(健康對(duì)照組)，所有患者及健康受試者均簽署知情同意書。本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) (1)經(jīng)組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診為NSCLL的患者；(2)每例患者均有詳細(xì)的臨床病理特征數(shù)據(jù)。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)病理學(xué)確診為小細(xì)胞肺癌；(2)僅有臨床診斷的肺癌；(3)無詳細(xì)的臨床病理特征數(shù)據(jù)；(4)有輸血史，放療和(或)化療史，合并其他腫瘤者以及有家族遺傳病史。

1.4 對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn) 健康人群，無腫瘤史。

1.5 主要試劑與儀器 PCR DSMIX(廣州東盛生物技術(shù)有限公司)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)、單面工作超凈臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、普通PCR儀器(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)、核酸濃度測定儀(中國，MERINTON)、電泳儀(北京六一)、JS-680B凝膠成像儀(上海培清)。

1.6 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 測PD-1基因SNP。

1.6.1 血標(biāo)本的收集 每個(gè)受試者抽取空腹血清放于真空EDTA抗凝管中，并分裝在1.5 mL冷凍管中，-20℃儲(chǔ)存、備用。

1.6.2 DNA的提取(按照HiPure Blood DNA Mini Kit提取) 用移液器取200 μL血液加到滅菌做好標(biāo)記的EP管中，加入1 mL紅細(xì)胞裂解液充分混勻10 s，室溫靜置10 min，8 000×g離心3 min，棄上清。向EP管中加入Buffer ATL 230 μL，Proteinase K 20 μL，渦旋混勻。55℃水浴3 h。水浴期間偶爾旋渦混勻。加入10 μL RNase Solutin(50 mg/mL)至消化液中混勻。室溫下靜置15～60 min降解RNA。10 000×g離心3 min后，將上清液移至新的1.5 mL離心管中。加入Buffer DL 250 μL至消化液中，以最高速度漩渦混勻30 s后，70℃水浴10 min。加入250 μL無水乙醇至消化液中，以最高速度漩渦混勻30 s。將HiPure gDNA Mini Column裝在2 mL收集管中，10 000×g離心1 min。丟棄流出物并將柱子重新裝回收集管中，加入Buffer GW1(已用乙醇稀釋) 500 μL至柱子中，10 000×g離心1 min。丟棄濾液并將柱子重新安裝回收集管，加入Buffer GW2(已用乙醇稀釋) 650 μL至柱子中，10 000×g離心1 min。丟棄流出物并將柱子重新安裝回收集管中，再加入Buffer GW2(已用乙醇稀釋) 650 μL至柱子中，10 000×g離心1 min。丟棄流出物并將柱子重新安裝回收集管中，10 000×g離心2 min。這一步可去除柱子中殘留的乙醇。將柱子裝在新的1.5 mL離心管中，將50～100 μL預(yù)熱至70 ℃的緩沖液AE或滅菌水加入柱子的膜中心，靜置3 min，10 000×g離心1 min。再加入50～100 μL預(yù)熱至70℃的Buffer AE 或滅菌水至柱子的膜中央。靜置3 min，10 000×g離心1 min。丟棄DNA結(jié)合柱。

1.6.3 PCR產(chǎn)物質(zhì)量鑒定及測序 測DNA濃度用1.0瓊脂糖凝膠電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以顯示透明的PCR產(chǎn)物條帶。見圖1。Marker為DNA DS2000；rs41386349擴(kuò)增目標(biāo)片段大小為422 bp。電泳圖顯示清晰的目標(biāo)帶(Marker上樣量為3 μL，樣品上樣量為3 μL)。然后進(jìn)行PCR產(chǎn)物測序、 PCR模板制備。反應(yīng)結(jié)束后使用酒精沉淀的方法純化DNA片段，最后加入HIDI變性DNA片段上機(jī)測序，待測序反應(yīng)結(jié)束后拷貝測序結(jié)果并分析。測序結(jié)束后使用BioEdit Sequence Alignment Editor進(jìn)行測序結(jié)果判讀分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)對(duì)PD-1等位基因頻率分布進(jìn)行檢驗(yàn)；采用行×列表的2檢驗(yàn)NSCLC患者與健康對(duì)照組基因型頻率分布；采用2分析PD-1 rs41386349基因多態(tài)性與NSCLC發(fā)病的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-1 rs41386349位點(diǎn)遺傳平衡檢驗(yàn) 健康對(duì)照組進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PD-1基因rs41386349位點(diǎn)中C等位基因的頻率為0.808 5，T等位基因頻率為0.191 5，計(jì)算出2=0.464 5，P>0.05。因此，該基因型分布符合遺傳平衡定律，具有群體代表性。見表1、圖1。

注：數(shù)字1～50代表樣本數(shù)

2.2 PD-1 rs41386349位點(diǎn)的等位基因分布頻率 NSCLC組50例受試者PD-1 rs41386349位點(diǎn)等位基因C和T的頻率分別為0.65和0.35。健康對(duì)照組47名健康受試者中等位基因C和T的頻率分別為0.808 5和0.191 5。經(jīng)2檢驗(yàn)，兩組間等位基因頻率分布存在差異(P<0.01)。見表2。

表1 PD-1 rs41386349 位點(diǎn)基因型的實(shí)際頻數(shù)和預(yù)計(jì)頻數(shù)

2.3 PD-1 rs41386349位點(diǎn)的基因型分布規(guī)律 PD-1 rs41386349位點(diǎn)基因型頻率在NSCLC組和健康對(duì)照組中的分布,其中NSCLC組50例受試者測得CC型23例(46%)，CT型19例(38%),TT型8例(16%)；健康對(duì)照組47例受試者測得CC型30例(63.84%),CT型16例(34.04%),TT型1例(2.13%)。兩組基因型構(gòu)成比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=6.539 6，P<0.05)。以CC基因型作為參考，CCvsCT，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=1.002，P>0.05；OR=0.646，95%CI=0.275～1.524)；CCvsTT，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=4.679，P<0.05；OR=0.096，95%CI=0.011～0.822)。見表3、圖2。

圖2 PD-1 rs41386349位點(diǎn)不同基因型

表2 PD-1 rs41386349位點(diǎn)的等位基因型在NSCLC和健康對(duì)照組間的分布及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估頻數(shù)(%)

表3 PD-1rs41386349等位基因型在NSCLC和健康對(duì)照組間的分布 例(%)

2.4 PD-1 rs41386349基因多態(tài)性和NSCLC患者臨床相關(guān)因素研究 PD-1基因rs41386349 C/T SNP與NSCLC患者臨床分期、病理分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與NSCLC患者年齡、性別、腫瘤浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

圖3PD-1rs41386349等位基因型在NSCLC組和健康對(duì)照組間的分布

表4 PD-1 41386349基因型分布與NSCLC患者病理參數(shù)的關(guān)系 例

3 討論

據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究署(IARC)2015年發(fā)布的癌癥報(bào)告[7]顯示：2012年全球約有180萬肺癌新發(fā)病例，居全球惡性腫瘤第一。迄今為止，其機(jī)制還沒有被完全闡明。NSCLC作為肺癌的主要類型，圍手術(shù)期鉑類化療的生存率僅比單純手術(shù)高5.4%，同時(shí)3級(jí)或以上毒不良反應(yīng)率超過60%[8-9]。因此，必須力求尋找傳統(tǒng)方法之外的其他治療手段。近年來，腫瘤的免疫療法備受矚目，PD-1/PD-L1通路為癌癥患者提供了一個(gè)重要的治療靶點(diǎn)，在一些NSCLC患者中，取得了令人矚目的成果[10-14]。阻斷PD-1/PD-L1通路能有效促進(jìn)腫瘤特異度 CD8+T 細(xì)胞對(duì)腫瘤組織的浸潤，分泌腫瘤殺傷因子，同時(shí)還可以增強(qiáng)T細(xì)胞的腫瘤抗原啟動(dòng)作用，從而抑制了免疫應(yīng)答的發(fā)生，增強(qiáng)了腫瘤微環(huán)境對(duì)機(jī)體正常免疫的抵抗作用，抑制腫瘤的生長[15-18]。

國內(nèi)外最近的研究表明 PD-L1 的SNP可能與多種腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[19-24]。SNP可以發(fā)生在啟動(dòng)子、編碼區(qū)、3′-UTR等的任何部位，因而可能會(huì)影響機(jī)體的表型及其對(duì)疾病的易感性。目前，有關(guān)PD-1基因SNP與NSCLC相關(guān)性的研究較少。Sasaki等[25]分別研究了位于啟動(dòng)子區(qū)的PD-1 rs36084323及內(nèi)含子2區(qū)的PD-1rs34819629 SNP 與NSCLC臨床病理參數(shù)和預(yù)后(生存期)的相關(guān)性。研究顯示，rs36084323 GG單倍型在肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌以及其他類型的NSCLC之間沒有差異， GG單倍型與性別、年齡、吸煙情況以和病理分期之間沒有相關(guān)性。然而，rs36084323 GG單倍型患者的生存期低于GA/AA單倍型患者。rs34819629 GG單倍型患者的生存期低于GA/AA單倍型患者，rs34819629 GG單倍型在病理分期及性別的比較上顯著相關(guān)。肺腺癌患者rs34819629 GG單倍型的存活率與GA/AA單倍型患者的存活率無差異;此外，在肺鱗癌患者中，rs34819629 GG單倍型患者的存活期低于GA/AA單倍型患者。該研究表明PD-1 SNP與肺鱗癌的預(yù)后相關(guān)，尤其是早期鱗狀細(xì)胞癌患者。

我們采用PCR法對(duì)PD-1 rs41386349 SNP與NSCLC易感性的關(guān)系進(jìn)行研究。結(jié)果顯示：(1)PD-1 rs41386349位點(diǎn)存在3種基因型別，分別為CC、CT、TT型，經(jīng)2檢驗(yàn)檢測NSCLC組合健康對(duì)照組等位基因頻率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示兩組基因頻率分布存在差異。(2)NSCLC組測得CC型占46%，CT占38%，TT占16%；健康對(duì)照組測得CC型為63.84%，CT型為34.04%，TT型為2.13%，比較兩組基因型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步比較分析，初步發(fā)現(xiàn)CC基因型與NSCLC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)性(OR=0.096，95%CI=0.011～0.822)。此外，我們還研究了PD-1 rs41386349 SNP與NSCLC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系：發(fā)現(xiàn)PD-1 rs41386349基因型與NSCLC患者的臨床分期、病理分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，與NSCLC患者年齡、性別、腫瘤浸潤深度、遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無關(guān)。

因此，通過本次研究，我們發(fā)現(xiàn)PD-1 rs41386349位點(diǎn)CC型與NSCLC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)，且PD-1 rs41386349 SNP與NSCLC患者臨床分期、病理類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。但是本研究還存在一定局限性：由于條件限制，納入例數(shù)偏少，導(dǎo)致本研究結(jié)果意義有限，結(jié)論較初步。該位點(diǎn)的具體功能以及對(duì)NSCLC的影響方式還需今后的細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn) PD-1 rs41386349 SNP與NSCLC易感性和預(yù)后的關(guān)系。為今后針對(duì)NSCLC患者以 PD-L1 為靶點(diǎn)的免疫治療提供新的思路。