郭浩, 辛建海， 楊鑫磊， 徐鴻潔△

北華大學(xué)附屬醫(yī)院 1腫瘤科， 2骨外一科(吉林吉林 132011)

卵巢癌是女性生殖器官腫瘤中病死率最高的惡性腫瘤，每年導(dǎo)致約14萬婦女死亡[1-2]。近些年，隨著診療技術(shù)的發(fā)展，腫瘤的預(yù)后有了很大改觀，然而，由于卵巢癌被診斷時(shí)多數(shù)已經(jīng)是晚期，卵巢癌的無瘤生存率仍然很低[3-4]。microRNA(miRNA)是一類非編碼的短鏈RNA，由21～25個(gè)核苷酸組成，它可以通過直接結(jié)合到目的基因的3′UTR區(qū)域，導(dǎo)致目的基因mRNA的裂解或降解，對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控[5-6]。大量的研究表明，miRNA在各個(gè)生物中結(jié)構(gòu)上具有高度的保守性，且存在于幾乎所有生物體內(nèi)，并且可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、衰老等幾乎所有活動[7]。研究表明卵巢癌的發(fā)生伴隨多種miRNA的異常，而且miRNA可以通過調(diào)控不同靶基因的表達(dá)量發(fā)揮抑癌或促癌的作用[8-9]。同時(shí)，由于miRNA在卵巢癌中的表達(dá)與正常卵巢不同，例如，miR-212、miR-31在卵巢癌中呈現(xiàn)低表達(dá)，miRNA也可以作為卵巢癌的標(biāo)記分子[10-12]。miR-373，第一個(gè)被鑒定為具有人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell，ESC)特異性的miRNA，其作用因腫瘤種類的不同而不同[10-12]。在卵巢癌中，人們關(guān)于miR-373的研究多集中在遷移和侵襲方面。Zhang等[13]的研究發(fā)現(xiàn)miR-373可以通過調(diào)節(jié)癌基因Rab22a抑制卵巢癌的侵襲和遷移。Meng等[14]的研究發(fā)現(xiàn)外泌體miR-373可以用于表皮樣卵巢癌的診斷和預(yù)測。然而，miR-373對卵巢癌增殖和凋亡的影響仍不明確。2018年6月至2019年10月，本研究將探究miR-373在卵巢癌增殖和凋亡方面的影響，為miR-373在卵巢癌中發(fā)揮的作用提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及儀器 胎牛血清(杭州四季青公司)， 細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI 1640 (美國Sigma公司)，RNA提取試劑Trizol、RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Real time PCR試劑盒(大連TaKaRa公司)， miR-373 mimics(中國吉瑪公司)，Lip2000(中國sage creation公司)，CCK8試劑盒(日本Dojindo公司)，其他常用試劑為本實(shí)驗(yàn)室所有。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢表皮細(xì)胞系IOSE80、人卵巢癌細(xì)胞HO8910和SKOV-3購自中國上海細(xì)胞庫，用含有10% 胎牛血清(BSA)100/mL的青霉素和鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞消化用0.25% 胰蛋白酶，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱；細(xì)胞生長狀態(tài)觀察使用倒置顯微鏡。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Real-time PCR 檢測miR-373的mRNA含量 用Trizol 裂解人卵巢表皮細(xì)胞系IOSE80、人卵巢癌細(xì)胞HO8910和SKOV-3細(xì)胞，并按照說明書提取細(xì)胞中的總RNA，取1 μg RNA，配制成10 μL反轉(zhuǎn)錄體系制備cDNA。然后，加反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入90 μL RNA酶-free的ddH2O。而后，取1.5 μL反轉(zhuǎn)產(chǎn)物作為Real-time PCR的模板進(jìn)行檢測。以TaKaRa公司的U6 為內(nèi)參照。miR-373引物序列： 5′-CCTTTCGCGGGGGTAAAACTCA-3′(上游)，下游引物為TakaRa試劑盒的通用引物。反應(yīng)體系：SYBR Green PCR Master Mix 為5 μL,上下游引物(10 μ mol/L)各0.5 μL，cDNA模板為2 μL，加ddH2O 2.5 μL至10 μL反應(yīng)體積。反應(yīng)條件：第一步，95℃ 3 min; 第二步，95℃ 10 s，56℃ 15 s，72℃ 15 s，共35個(gè)循環(huán)；第三步，65℃ 5 s, 95℃ 5 s。

1.2.2 miR-373 mimics的轉(zhuǎn)染 用Lip2000對處于對數(shù)期生長的細(xì)胞進(jìn)行miR-373 mimics的轉(zhuǎn)染。將100 pmol miR-373 mimics 或者陰性對照pre-miRNA溶于500 μL 無血清RPIM 1640培養(yǎng)液中，并用移液器混勻；將15 μL Lip2000溶于500 μL 無血清RPIM 1640培養(yǎng)液中，并用移液器混勻混勻。將兩種液體混勻，室溫放置20 min，中間不定期混勻培養(yǎng)液。將混合液體換至6 孔板中。6 h后將培養(yǎng)液換成含10%血清的RPIM 1640。

1.2.3 CCK8法檢測細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染miR-373 mimics或NC的IOSE80、HO8910和SKOV-3細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，計(jì)數(shù)，并以8 000個(gè)細(xì)胞每孔的密度接種于96孔板中，每組同時(shí)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。每24 h取出一塊96孔板，進(jìn)行CCK8實(shí)驗(yàn)。 每孔中加入10 μL的CCK8溶液，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2 h，終止培養(yǎng)。酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度值。重復(fù)3次，繪制增殖曲線。

1.2.4 PI和Annexin V雙染法檢測細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染miR-373 mimics 48 h后，用胰蛋白酶消化處理對數(shù)期生長的細(xì)胞，使其完全分散變?yōu)閱蝹€(gè)細(xì)胞，離心收集細(xì)胞。并用預(yù)冷的PBS洗滌3次，離心收集細(xì)胞，用PI和Annexin V雙染法檢測細(xì)胞的凋亡率。

1.2.5 Western blot 檢測RAD54B的含量 用預(yù)冷的 PBS將對數(shù)期生長的細(xì)胞洗滌3 次，加入含蛋白酶抑制劑的RAPI 蛋白裂解液，冰上裂解15 min，12 000 r/min 離心 15 min，取上清液即為細(xì)胞總蛋白。用BCA法檢測細(xì)胞蛋白濃度。蛋白變性：65℃，10 min。12% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，恒壓轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜后，以5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h; 加入相應(yīng)的抗體，4 ℃冰箱孵育過夜，TBST 洗滌后加對應(yīng)種屬HRP 標(biāo)記的 Ⅱ 抗室溫孵育 1 h，ECL底物顯色。

2 結(jié)果

2.1 miR-373在卵巢癌中呈現(xiàn)低表達(dá) RT-PCR結(jié)果表明與人卵巢表皮細(xì)胞IOSE80相比，卵巢癌細(xì)胞HO8910和SKOV-3中，miR-373含量明顯降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1、表1。

注：與IOSE80比較*P<0.01

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.*)class="picture_figure_line" src="images/592dcc968b6910ec356f7e0d380e3838.jpg" width="20" height="8" title="width=20,height=8,dpi=110" />

細(xì)胞nmiR-373t值?P值?IOSE8031.00±0.10HO891030.37±0.075.12<0.01SKOV-330.43±0.055.24<0.01

注：*與IOSE80比較

2.2 miR-373過表達(dá)的檢測 RT-PCR結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-373 mimics后，與NC組相比，miR-373 mimics轉(zhuǎn)染組HO8910和SKOV-3細(xì)胞中的miR-373含量明顯增高(P<0.05，P<0.01)。表明miR-373轉(zhuǎn)染成功，可進(jìn)行下一步的功能實(shí)驗(yàn)探究。見圖2、表2。

注：與NC比較*P<0.05，**P<0.01

圖2RT-PCR檢測miR-373在HO8910和SKOV-E細(xì)胞中的表達(dá)量(n=3)

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.*)class="picture_figure_line" src="images/592dcc968b6910ec356f7e0d380e3838.jpg" width="20" height="8" title="width=20,height=8,dpi=110" />

細(xì)胞nmiR-373t值P值HO89107.025<0.05 NC31.00±0.32 miR-373 mimics329.64±3.85SKOV-37.860<0.01 NC31.00±0.43 miR-373 mimics344.46±5.50

2.3 miR-373促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖 CCK8法檢測miR-373過表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響。miR-373過表達(dá)可明顯促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞HO8910和SKOV-3的增殖(P<0.01)。見圖3。

注:*P<0.01

2.4 miR-373抑制卵巢癌細(xì)胞凋亡 miR-373轉(zhuǎn)染后，HO8910的凋亡率由(14.97±0.62)%明顯降至(5.20±0.37)%(P<0.001)；SKOV-3的凋亡率從(12.30±0.46)%降至(8.73±0.89)%(P<0.05)；說明miR-373可明顯抑制HO8910和SKOV-3的凋亡，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4、表3。

2.5 生物信息學(xué)預(yù)測RAD54B是miR-373的靶基因 進(jìn)一步利用生物學(xué)信息軟件TargetMiner, TargetScanVert, TargetMiner對 miR-373的靶基因進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果鎖定RAD54B。miR-373可結(jié)合于RAD54B的3′UTR第628～635位。見圖5。

2.6 miR-373過表達(dá)使RAD54B的表達(dá)量降低 Western blot檢測miR-373 mimics處理細(xì)胞后，RAD54B表達(dá)量的變化，miR-373的過表達(dá)可顯著降低RAD54B的表達(dá)量。但是具體的miR-373是否可以直接調(diào)控RAD54B的表達(dá)，仍需雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。見圖6。

注：與NC比較 *P<0.05, **P<0.001

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細(xì)胞n凋亡率(%)t值?P值?HO8910 NC314.97±0.62 miR-373 mimics35.20±0.3713.49<0.001SKOV-3 NC312.30±0.46 miR-373 mimics38.73±0.893.54<0.05

注：*與NC比較

3 討論

卵巢癌仍是預(yù)后最為不良的婦科腫瘤，主要原因在于不能及時(shí)在卵巢癌早期進(jìn)行發(fā)現(xiàn)和診治，約70%的卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)是卵巢癌晚期[15-16]。已有的大量文獻(xiàn)表明miRNA不僅可以作為卵巢癌的特異標(biāo)記分子，還具有調(diào)控卵巢癌的增殖、凋亡、遷移、耐藥等功能[17-19]。探究具體miRNA在卵巢癌中的功能及機(jī)制對人們對卵巢癌的認(rèn)識至關(guān)重要。

圖5 生物信息學(xué)預(yù)測miR-373與RAD54B的結(jié)合位點(diǎn)

圖6miR-373mimics對HO8910和SKOV-3細(xì)胞中RAD54B表達(dá)量的影響

本研究中，我們首先檢測了miR-373在卵巢癌細(xì)胞HO8910和SKOV-3中的含量，發(fā)現(xiàn)與人卵巢表皮細(xì)胞IOSE80相比，miR-373在HO8910和SKOV-3中的含量明顯降低。提示，miR-373可能在卵巢癌中發(fā)揮作用。

我們過表達(dá)miR-373后，檢測其在卵巢癌中的功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-373可以明顯促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞HO8910和SKOV-3的增殖，進(jìn)一步，凋亡檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-373可以明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的凋亡。miRNA是作用于目的蛋白mRNA的3′UTR結(jié)合，導(dǎo)致目的基因mRNA的裂解或降解，從而對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，抑制其表達(dá)。因此，我們對具體的分子機(jī)制進(jìn)行探究，生物學(xué)軟件預(yù)測RAD54B是miR-373的靶蛋白之一，并且，miR-373過表達(dá)可以明顯降低RAD54B的表達(dá)量，說明其可能是通過調(diào)控同源重組修復(fù)相關(guān)蛋白RAD54B發(fā)揮作用。

RAD54B是RAD54的同源異構(gòu)體，兩者均在DNA雙鏈斷鏈引起的同源重組中發(fā)揮重要作用，但兩者發(fā)揮的作用又各有不同。當(dāng)DNA雙鏈發(fā)生斷裂時(shí)，RAD54將與RAD51結(jié)合，促使其正確結(jié)合于DNA雙鏈斷裂處[20]。此時(shí)，RAD54是與核酸內(nèi)切酶Mus81/Eme1結(jié)合，而RAD54B則與減數(shù)分裂蛋白DMC1結(jié)合[21-22]。最近的研究表明，RAD54B在腫瘤中也存在異常，RAD54B的高表達(dá)可能是結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)的預(yù)測因子[22-24]。并且，RAD54B可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，且抑制細(xì)胞凋亡[25]。

本研究中，我們猜測miR-373在卵巢癌中表達(dá)量減低，對RAD54B表達(dá)的抑制作用減弱，因此導(dǎo)致RAD54B表達(dá)量升高，卵巢癌細(xì)胞對DNA雙鏈斷裂的同源重組修復(fù)能力增強(qiáng)，進(jìn)而避免細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序，促進(jìn)卵巢癌的增殖增強(qiáng)。但是，本研究的猜測只是依賴于生物學(xué)信息中表明RAD54B是miR-373的靶基因，同時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-373可以降低RAD54B的表達(dá)量，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。