謝襯梨， 曾素芬， 郭慶玲， 趙一菊， 陳立沖

東莞市第五人民醫(yī)院 1呼吸科， 2中心實驗室(廣東東莞 523900)

支氣管擴(kuò)張癥(bronchiectasis)的特點(diǎn)是氣道不可逆性、進(jìn)行性破壞、擴(kuò)張，是一種膿性式的呼吸道疾病，是呼吸系統(tǒng)難治性疾病之一[1-2]。支氣管擴(kuò)張癥的病程呈進(jìn)行性發(fā)展，并與氣道定植細(xì)菌引起的肺部慢性炎癥有極大關(guān)聯(lián)[3-5]。在我國，導(dǎo)致支氣管擴(kuò)張最常見的致病菌為革蘭陰性菌,尤以銅綠假單細(xì)胞最為常見，占細(xì)菌種類的66%[6]。研究發(fā)現(xiàn)，支氣管擴(kuò)張患者存在免疫功能紊亂。其中極為重要且具有代表性的指標(biāo)為Th類中的輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17)、輔助性T細(xì)胞1(T helper cell 1，Th1)細(xì)胞因子[7-8]。銅綠假單胞菌感染和定植能促進(jìn)患者的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致支氣管擴(kuò)張發(fā)生,肺功能下降[9]。為了進(jìn)一步了解銅綠假單胞菌是否導(dǎo)致支氣管擴(kuò)張癥免疫功能失調(diào)，本研究在2017年4月至2018年9月開展實驗，通過銅綠假單胞菌制作支氣管擴(kuò)張癥大鼠模型，測定肺功能，觀察病理切片，檢測免疫因子調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T regulatory cell，Treg)、Th17的表達(dá)及炎癥因子白細(xì)胞介素17(interleukin 17，IL-17)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)、白細(xì)胞介素10(interleukin 10，IL-10)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的水平，探討免疫失衡在支氣管擴(kuò)張發(fā)病中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑 Treg及Th17流式試劑盒由美國BD公司提供；IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β ELISA試劑盒由美國Ray Biotech公司提供。

1.2 動物分組與處理 無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級SD大鼠，雌性，150～180 g，30只。檢疫合格后，模型組10只大鼠以2%戊巴比妥鈉 30 mg/kg 腹腔注射麻醉。仰臥位固定，常規(guī)消毒后，選擇頸部距唇下3 cm處，作縱向1 cm切口，縱向分離出氣管，用鑷子固定氣管，然后用注射器插入氣管中，快速注射銅綠假單胞菌液(10～128CFU/mL)0.5 mL和0.5 mL氣體，迅速立起固定板，為了防止大鼠不會由于嗆咳而出現(xiàn)窒息，讓大鼠處于垂直位中，等呼吸平定后把頸部皮膚縫合；假手術(shù)組10只大鼠同樣方法氣管切開，以注射器插入氣管中，快速注射0.5 mL生理鹽水和0.5 mL氣體，假手術(shù)組和模型組大鼠術(shù)后皮下注射青霉素1 U/d，連續(xù)3 d，以防傷口感染。正常對照組10只大鼠無特殊處理。每只大鼠自由進(jìn)食和飲水。連續(xù)14 d。

1.3 觀察指標(biāo) (1)每天觀察并詳細(xì)記錄大鼠的呼吸狀態(tài)、毛色、體重等情況。(2)所有動物連續(xù)觀察14 d，記錄動物的一般臨床反應(yīng)和死亡情況。(3)手術(shù)后第14天分別處死各組大鼠，取肺組織放入4%甲醛固定。眼球取血留取外周血3 mL置肝素鈉管留取全血，3 mL置干燥管留取血清。本實驗通過廣東省實驗動物中心倫理委員會審核。

1.4 相關(guān)指標(biāo)檢測

1.4.1 肺功能測定 模型建立后第2天麻醉大鼠、切開頸部皮膚，鈍性分離皮下組織暴露氣管，在氣管軟環(huán)骨間環(huán)形剪開一小切口，插入氣管插管并扎緊，仰臥頭低位置于小動物肺功能測定儀密閉體積描記箱內(nèi)。氣管插管一端與動物呼吸機(jī)相連。當(dāng)大鼠呼吸時，肺擴(kuò)張和收縮改變了向內(nèi)壓力，通過測量向內(nèi)氣體壓力間接獲取肺容量變化。描記一段平靜呼吸后測定用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)、0.3 s用力呼吸容積(forced expiratory volume in 0.3 second，F(xiàn)EV0.3)、FEV0.3/FVC和用力呼氣峰值流速(forced peak expiratory velocity，PEF)。

1.4.2 組織病理學(xué)檢測 取戊二醛用石蠟包埋、固定肺組織→切片→蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色→觀察組織學(xué)改變→取圖(顯微鏡10×物鏡及40×)，每一片取圖3個視野，每一個視野不可重復(fù)[10]。

1.4.3 外周血淋巴細(xì)胞Th17細(xì)胞檢測 抽取大鼠全血加入肝素鈉抗凝管中，并提取單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，200 μL大鼠自身血清重懸后加入2 μL BD GolgiPlug(刺激劑和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑)，在5%CO237℃孵育5 h。PBS洗滌后加入抗體CD3+、CD4+，避光孵育15 min。隨后加入BD Fix/Perm固定、破膜，重懸后分樣本和對照兩個管，在樣本管中加入抗體IL-17A，對照管中加入抗體IgG2-APC，4℃避光孵育30 min，洗滌重懸后檢測CD3+CD4+IL-17+細(xì)胞。

1.4.4 外周血淋巴細(xì)胞Treg細(xì)胞檢測 在對照管中加入抗體CD3+、CD4+，樣本檢測管中加入抗體CD3+、CD4+、CD25+，兩管中再分別加入100 μL肝素鈉抗凝血，避光孵育15 min；隨后加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，反應(yīng)15 min后離心，洗滌，隨后加入BD TF Buffer固定破核,重懸后在樣本管中加入抗體FoxP3，對照管中加入同型對照抗體IgG2-APC，4℃避光孵育40 min，洗滌重懸后檢測CD4+CD25+FoxP3+的表達(dá)。

1.4.5 采用酶聯(lián)免疫吸附測定 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)技術(shù)檢測血清炎癥介質(zhì)IL-17、IL-6、IL-10和TGF-β1的檢測(按實驗操作步驟)：制備好標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別在孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)曲線和血清樣本各100 μL，搖床孵育2.5 h；洗板，加入抗體，孵育1 h，洗板，拍干，加入100 μL酶，孵育45 min，再洗板拍干，每孔加入底物孵育30 min后加入終止液，立刻在酶標(biāo)儀(Thermo公司)上，以450 nm波長檢測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣本的OD值。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 假手術(shù)組與正常對照組飲食無明顯改變，活動正常；模型組未見無明顯寒戰(zhàn)及體溫升高，飲食活動略有減少，無大鼠死亡。

2.2 肺功能 與正常對照組和假手術(shù)組比較，模型組肺功能參數(shù)FVC、FEV0.3、PEF均顯著降低,FEV0.3/FVC比值升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，考慮支氣管擴(kuò)張引起肺限制性通氣障礙可能。見表1。

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組別nFVC (mL)FEV0.3 (mL)FEV0.3/FVCPEF(mL/s)正常對照組109.9±1.1?8.2±1.9?0.8±0.3?41.6±5.3?假手術(shù)組109.7±1.5?8.3±2.1?0.8±0.2?40.8±4.4?模型組106.6±1.66.5±1.51.0±0.434.7±4.8

注：*與模型組比較P<0.01

2.3 肺組織病理學(xué)改變 在光鏡下正常對照組及假手術(shù)組見氣管內(nèi)的支氣管組織中，層次是清晰的，纖毛、上皮細(xì)胞為整齊排列，且未見有滲出物，管腔內(nèi)外未見炎性細(xì)胞浸潤灶，腔內(nèi)偶見分泌物，肺泡組織清晰，肺泡壁無增厚，未見異常浸潤或增生。模型組：大鼠的支氣管管壁中，可見有不同程度斷裂、破壞，并有局部潰瘍形成，擴(kuò)張明顯的是管腔，同級支氣管中且腔內(nèi)還可見局部的炎性細(xì)胞，且有濾泡增生。部分的支氣管在血管內(nèi)，可明顯見出血、充血現(xiàn)象，且在血管四周，可見很多炎性的浸潤。肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤，病變區(qū)肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡壁變薄、甚至斷裂融合成大皰，部分肺泡腔內(nèi)有不同程度的出血。見圖1。

2.4 血清炎癥因子表達(dá)水平 分別與正常對照組、假手術(shù)組比較，模型組大鼠的血清IL-17明顯升高(P<0.01)、IL-6 明顯升高(P<0.01)、IL-10明顯降低(P<0.01)、TGF-β明顯降低(P<0.01)。見表2。

2.5 免疫因子表達(dá)結(jié)果 模型組與正常對照組、假手術(shù)組比較，Th17表達(dá)明顯升高[(1.5±0.6)%vs(0.3±0.2)%，P<0.01；(1.5±0.6)%vs(0.4±0.3)%，P<0.01]，Treg 表達(dá)明顯降低[(8.5±1.5)%vs(15.6±1.3)%，P<0.01；(8.5±1.5)%vs(15.7±2.1)%，P<0.01]。Th17/Treg比值升高(0.18±0.11vs0.019±0.010，P<0.01;0.18±0.11vs0.020±0.013，P<0.01)。見表3。

3 討論

細(xì)菌感染是支氣管擴(kuò)張癥急性發(fā)作的主要誘因,對于重癥患者而言，細(xì)胞功能易發(fā)生免疫低下，造成了嚴(yán)重的炎性介質(zhì)反應(yīng)，加重病情[11]。支氣管擴(kuò)張患者痰液檢出細(xì)菌中以革蘭陰性菌(78.6%)為主，其中銅綠假單胞菌最多(28.6%)[12]。在抗生素治療、侵入性操作等狀態(tài)下，定植的細(xì)菌種類發(fā)生改變，一些強(qiáng)致病菌發(fā)生定植，觸及了氣道上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，釋放了酶、炎癥介質(zhì)、氣道炎癥轉(zhuǎn)成慢性疾病，持續(xù)一段時間后，導(dǎo)致肺組織、支氣管壁損傷，氣道中的纖毛上皮清潔功能被破壞。由此，肺的防御功能被破壞。感染反復(fù)不康復(fù)，加重細(xì)菌定植、感染，此惡性循環(huán)周而復(fù)始[13-15]。晚期，或反復(fù)運(yùn)用抗生素開展治療之后，最常見的也是銅綠假單胞菌的感染[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，正常對照組及假手術(shù)組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，未出現(xiàn)明顯形態(tài)學(xué)改變。銅綠假單胞菌介導(dǎo)支氣管擴(kuò)張大鼠模型組的支氣管管壁中，可見有不同程度斷裂、破壞，并有局部潰瘍形成，擴(kuò)張明顯的是管腔，同級支氣管中且腔內(nèi)還可見局部的炎性細(xì)胞，且有濾泡增生。部分的支氣管在血管內(nèi)，可明顯見出血、充血現(xiàn)象，且在血管四周，可見很多炎性的浸潤。肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤，病變區(qū)肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡壁變薄、甚至斷裂融合成大皰，部分肺泡腔內(nèi)有不同程度的出血。

早期的研究證實了支氣管擴(kuò)張后T淋巴細(xì)胞功能異常，是一項重要指標(biāo)，且具有代表性的為Th類中的Th17、Th1細(xì)胞因子[17-18]。Jaat等[19]研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌定植可導(dǎo)致支氣管擴(kuò)張T淋巴細(xì)胞功能減低。Th17細(xì)胞主要分泌IL-17A、IL-6等細(xì)胞因子，可趨化中性粒細(xì)胞進(jìn)入肺組織釋放中性粒細(xì)胞彈力蛋白酶破壞肺組織，加劇氣道炎癥[20-23]。Treg分泌細(xì)胞因子直接接觸，如TGF-β等，對炎癥反應(yīng)、抗原特異度抑制，讓免疫保持自穩(wěn)狀態(tài)，Treg細(xì)胞是介導(dǎo)免疫類的，此細(xì)胞和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)Th17細(xì)胞，在分化、功能方面是互相拮抗的，兩者制約、確保機(jī)體免疫平衡。初始的CD4+T細(xì)胞在接受了抗原刺激之后，不同條件會分化不同亞型的T細(xì)胞，所執(zhí)行的功能也不一樣，通常可見Th1、Th2、Th17三種[24]。例如Th17，在IL-6存在時，初始細(xì)胞可分化成Treg，并對TGF-β1有一定依賴性；在誘導(dǎo)中加入IL-6，其抗體促進(jìn)Foxp3+Treg細(xì)胞分化，機(jī)體無損傷、無炎癥時，免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的TGF-β1，對T細(xì)胞增殖明顯抑制，促進(jìn)Treg細(xì)胞表達(dá)，保持著機(jī)體的免疫耐受，但有感染、炎癥時，IL-6會大量產(chǎn)生并抑制著Treg細(xì)胞表達(dá)，和TGF-β1一起誘導(dǎo)著Th17細(xì)胞分化，以此介導(dǎo)著機(jī)體前炎癥反應(yīng)[25]。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，本研究結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌介導(dǎo)支氣管擴(kuò)張大鼠CD4+Th17表達(dá)升高，CD4+CD25+Foxp3+Treg表達(dá)降低，Th17/Treg比值升高，模型組血清IL-17、IL-6水平明顯升高，IL-10、TGF-β1表達(dá)顯著降低(P<0.01)。說明Th17、Treg可能共同參與支氣管擴(kuò)張的發(fā)病過程。此研究顯示，Th17/Treg失衡或許是支氣管擴(kuò)張所發(fā)生的重要機(jī)制，Th17細(xì)胞分泌IL-17參與支氣管擴(kuò)張炎癥反應(yīng)過程，促IL-6因子釋放，前體的細(xì)胞繼續(xù)分化、失衡，造成肺組織又出現(xiàn)了損傷。本研究還發(fā)現(xiàn)，與正常對照組和假手術(shù)組比較，支氣管擴(kuò)張模型組肺功能參數(shù)FVC、FEV0.3、PEF均顯著降低,FEV0.3/FVC比值升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，考慮支氣管擴(kuò)張引起肺限制性通氣障礙可能。

圖1 各組病理結(jié)果(HE)

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組別IL-17(ng/L)IL-6(ng/L)IL-10(ng/L)TGF-β(ng/L)正常對照組0.3±0.2?2.3±2.1?14.3±1.3?90±9.4?假手術(shù)組0.5±0.3?2.7±2.5?14.8±1.6?92±8.6?模型組2.5±0.88.1±0.98.8±1.436±5.6

注：*與模型組比較P<0.01

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組別Th17(%)Treg(%)Th17/Treg正常對照組0.3±0.2?15.6±1.3?0.019±0.010?假手術(shù)組0.4±0.3?15.7±2.1?0.020±0.013?模型組1.5±0.68.5±1.50.180±0.11

注：*與模型組比較P<0.01

綜上所述，自身免疫功能失衡可能導(dǎo)致支氣管擴(kuò)張炎癥的發(fā)生，支氣管擴(kuò)張炎癥存在 Th17/Treg表達(dá)失衡，導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞分化異常，從而打破機(jī)體的自身免疫調(diào)節(jié)，使炎癥因子分泌增多，加劇、啟動支氣管炎癥反應(yīng)，最后造成肺組織損傷、肺功能降低。因此，采取措施平衡Th17/Treg比值，有望成為治療Th17/Treg的新途徑。