吳映彤，王西西，吳 競,2，陳鴻軍，朱鴻飛，郭曉宇

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.比利時(shí)列日大學(xué) 讓布魯農(nóng)學(xué)院，列日 4000；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

非洲豬瘟（africa swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（Africa swine fever virus，ASFV）引起的家豬和野豬的一種急性、熱性和高傳染性疾病，其臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、嘔吐、皮膚發(fā)紺、內(nèi)臟器官明顯出血等[1]。20世紀(jì)初，ASF病例首次發(fā)現(xiàn)于肯尼亞，自此ASV疫情迅速在非洲大部分地區(qū)蔓延[2]。2007年，ASF疫情在高加索地區(qū)的格魯吉亞出現(xiàn)，隨后迅速蔓延至俄羅斯聯(lián)邦以及東歐等周邊國家[3-4]。2018年8月1日，我國遼寧省沈陽市沈北區(qū)發(fā)現(xiàn)ASF疫情，經(jīng)B646L/p72基因進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)該病毒屬于基因Ⅱ型，與目前在俄羅斯和東歐流行的Georgia 2007/1毒株屬于一個(gè)進(jìn)化分支[5]。目前已在遼寧、河南、江蘇、浙江、安徽、黑龍江、內(nèi)蒙、吉林、天津等9個(gè)省直轄市發(fā)現(xiàn)ASF疫情。

ASFV基因組大小約為170～190 kb，含有151～167個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF），其中約30%的ORF存在多個(gè)拷貝，即多基因家族，包括MGF100、MGF110、MGF300、MGF360和MGF505/530，不同分離毒株的ORF拷貝數(shù)也各不相同[6]，MGFs家族基因編碼的多個(gè)拷貝可能為病毒提供了選擇進(jìn)化的優(yōu)勢[7]。由于ASFV中某些基因可干擾宿主免疫應(yīng)答，缺失這些基因?qū)⒂兄谠鰪?qiáng)宿主的免疫應(yīng)答[8]。已有研究發(fā)現(xiàn)，ASFV弱毒株OURT88/3在缺失MGF360-10L、11L、12L、13L、14L后，可分別在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的IFN，并在免疫后提供針對(duì)同源基因Ⅰ型及其他基因型的攻毒保護(hù)[9-10]。MGFs家族基因缺失疫苗被認(rèn)為是非洲豬瘟疫苗研制的主要方向之一，因此建立針對(duì)MGFs家族基因的鑒別診斷方法尤為重要。當(dāng)前常用的分子診斷方法主要有PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)技術(shù)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等，但這些方法大多需要昂貴的儀器設(shè)備、繁瑣的實(shí)驗(yàn)程序、較長的檢測時(shí)間[11-12]或出現(xiàn)檢測結(jié)果不準(zhǔn)確（LAMP）等現(xiàn)象[13]，難以滿足檢測需要。重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）是一種新興的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)對(duì)硬件設(shè)備的要求很低，在重組酶、單鏈結(jié)合蛋白（single strand DNA-binding protein，SSB）、DNA聚合酶等參與下，以恒定溫度即可獲得高靈敏性及特異性的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物[14]，可用于體外診斷，適用于獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。

鑒于此，本實(shí)驗(yàn)比較近年來周邊國家報(bào)道的ASFV毒株序列，主要根據(jù)Georgia 2007/1毒株MGF360-12L基因的參考序列，進(jìn)行RPA引物設(shè)計(jì)，篩選最適引物，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并驗(yàn)證檢測方法的特異性、靈敏性，為后續(xù)ASFV MGF360-12L缺失毒株的鑒別診斷提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 TwistAmpTMDNA amplification kit購自英國TwistDx公司；DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒（OMEGA）購自北京佳誠實(shí)創(chuàng)科技有限公司；質(zhì)粒DNA中提試劑盒（GeneMark）購自北京達(dá)科為生物技術(shù)公司；病毒RNA提取試劑盒、2× Primer STAR Mix、5×Prime Script Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；2×Reatime PCR Mix（SYBR green）購自北京聚合美生物技術(shù)公司；2×TaqPCR Mix購自南京諾唯贊生物技術(shù)公司；引物合成與測序送至金唯智生物技術(shù)（蘇州）公司。

1.2 病毒株和臨床樣品 含有ASFV Georgia 2007/1毒株12L基因的真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-12L由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）基因組RNA和偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus 2，PCV-2）基因組DNA由本實(shí)驗(yàn)室保存；豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）基因組RNA提取自瑞普商品化兔脾淋活疫苗；O型口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）基因組RNA提取自中農(nóng)威特豬口蹄疫滅活疫苗。15份未知病原的臨床樣品由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建及拷貝數(shù)確定 根據(jù)GenBank中ASFV Georgia 2007/1株（GenBank登錄號(hào)：FR682468.1）參考序列，確定MGF360-12L基因序列信息，合成并克隆至pUC57載體。將目的基因連接至真核載體pcDNA3.1，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-12L?？截悢?shù)（copies/μL）=6.02×1023×[質(zhì)粒濃度（ng/μL）×10-9/（質(zhì)粒堿基數(shù)×660）]。

1.4 病毒RNA的提取 根據(jù)病毒RNA提取試劑盒提取病毒核酸。按照反轉(zhuǎn)錄說明書，將PRRSV、CSFV、FMDV和PEDV基因組RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并測定其濃度；所有病毒DNA和cDNA模板保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 RPA引物設(shè)計(jì) 參考GenBank中ASFV Georgia2007/1株MGF360-12L基因序列，設(shè)計(jì)RPA引物，目的片段大小為216 bp。同時(shí)設(shè)計(jì)普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，具體見表1。

表1 本研究引物Table 1 The primers used in this study

1.6 RPA檢測方法的建立與條件優(yōu)化 使用TwistAmpTMDNA amplification kit配制50 μL RPA反應(yīng)體系，其中上、下游引物12L-RPA-F/12L-RPA-R（10 μmol/L）各2.4 μL，rehydration buffer 29.5 μL，DNase/RNase Free H2O 11.2 μL，模板2 μL。將以上試劑預(yù)混后轉(zhuǎn)入含凍干酶制劑的反應(yīng)管中，將2.5 μL 280 mmol/L MgAc加于反應(yīng)管蓋上，蓋緊后瞬時(shí)離心混勻，分別于38℃反應(yīng)5、10、20、30 min，RPA產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，取5 μL進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，確定最適反應(yīng)引物組合。為篩選RPA最佳反應(yīng)溫度和時(shí)間，以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pcDNA3.1-12L為模板，分別在30℃、35℃、37℃、39℃、40℃、42℃條件下擴(kuò)增30 min。再將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒置于最適溫度，反應(yīng)5、10、15、20、25、30、35、40 min，以確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.7 特異性和敏感性試驗(yàn) 分別以PEDV、FMDV、CSFV、PRRSV的cDNA，PRV、PCV-2的DNA，以及pcDNA 3.1-12L為模板，進(jìn)行RPA反應(yīng)，確定該方法特異性。此外，將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋，使其濃度為100～106copies/μL，以此為模板進(jìn)行RPA反應(yīng)，確定方法的最低檢測限。

1.8 普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增 普通PCR擴(kuò)增體系（20 μL）：2×TaqMix 10 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性10 min；98℃變性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增體系（20 μL）：2×Realtime PCR Mix （SYBRgreen）10 μL，上下游引物各0.8 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)齊。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性1 min；95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)。將pcDNA3.1-12L標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒10倍比稀釋（100～106copies/μL）進(jìn)行普通PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR，比較3種檢測方法的敏感性。

1.9 臨床樣品的檢測 對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的15份未知病原的病死豬樣品進(jìn)行處理，提取其RNA、反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RPA和實(shí)時(shí)熒光定量PCR同時(shí)檢測，比較兩種檢測方法的結(jié)果是否一致。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒鑒定及拷貝數(shù)的計(jì)算 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果見圖1，大小與預(yù)期相符（12L為1053 bp，pcDNA3.1為5428 bp）。鑒定正確的陽性質(zhì)粒濃度為682 ng/μL，重組質(zhì)粒堿基數(shù)為6423 bp，經(jīng)計(jì)算得知質(zhì)粒的拷貝數(shù)為9.68×1010copies /μL。

2.2 RPA反應(yīng)引物篩選 以106copies/μL的pcDNA3.1-12L質(zhì)粒為模板，使用4組引物，進(jìn)行RPA引物篩選（圖2）。結(jié)果顯示，陽性對(duì)照擴(kuò)增成功；在實(shí)驗(yàn)組中，雖然引物組合1首先出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，但擴(kuò)增30 min時(shí)出現(xiàn)非特異性條帶，而引物組合4擴(kuò)增目的條帶較為單一、亮度較強(qiáng)，因此選取引物組合4用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 RPA反應(yīng)條件的優(yōu)化 為篩選反應(yīng)最佳溫度，以106copies/μL的pcDNA3.1-12L為模板，使用上述最適引物進(jìn)行RPA擴(kuò)增，在30℃～42℃下最長反應(yīng)30min。經(jīng)半定量分析發(fā)現(xiàn)，12L基因在35℃時(shí)擴(kuò)增條帶較強(qiáng)（圖3）。為篩選反應(yīng)最適時(shí)間，將106copies/μL的模板在35℃下擴(kuò)增5～40 min后發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)30 min的樣品出現(xiàn)較為穩(wěn)定的陽性條帶（圖4），因此選取30 min為最適反應(yīng)時(shí)間。

圖1 真核重組質(zhì)粒酶切結(jié)果Fig.1 Enzyme digestion identification results of recombinant eukaryotic vector

圖2 12L-RPA擴(kuò)增引物篩選Fig.2 The selection of 12L-RPA primers

圖3 12L-RPA反應(yīng)溫度優(yōu)化Fig.3 12L-RPA reaction temperature optimization

圖4 12L-RPA反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化Fig.4 12L-RPA reaction time optimization

2.4 特異性和靈敏性實(shí)驗(yàn) 以pcDNA3.1-12L質(zhì)粒以及PEDV、FMDV、CSFV、PRRSV的cDNA，PRV、PCV-2的DNA為模板，擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)只有12L基因出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，說明該方法具有良好的特異性（圖5）。為確定RPA方法的最小檢出量，以100～106copies/μL的pcDNA3.1-12L為模板，擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)，RPA最低可以檢測到1×103copies質(zhì)粒（圖6A），與普通PCR（圖6B）檢測限相同，與熒光定量PCR檢測限相近（圖6C）。

圖5 12L-RPA特異性檢測Fig.5 12L-RPA specificity test

2.5 RPA檢測方法的應(yīng)用 通過本研究建立的RPA方法，對(duì)15份樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示所有樣品均為ASFV陰性，與實(shí)時(shí)熒光檢測結(jié)果一致。

圖6 敏感性檢測Fig.6 Sensitivity test results

3 討論

由于發(fā)病病程短、致死率高等特點(diǎn)，ASF已成為危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一。該病毒免疫逃逸機(jī)制復(fù)雜、基因型較多（24個(gè)基因型）[15]，目前并未研制出有效的疫苗。研究發(fā)現(xiàn)，刪除毒株Benin 97/1 MGF360-10L、11L、12L、13L、14L和MGF505-1R、2R、3R及部分基因（MGF360-9L和MGF530/505-4R）后，缺失毒株和親本病毒在豬巨噬細(xì)胞體外的生長特性基本相似；此外，動(dòng)物免疫攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，缺失毒株可以保護(hù)實(shí)驗(yàn)豬只免受強(qiáng)毒株Benin97/1的攻擊[16]。隨著缺失疫苗毒株的廣泛研究，對(duì)此建立快速準(zhǔn)確的檢測方法同樣重要。

對(duì)比當(dāng)前常見的檢測方法，RPA主要優(yōu)勢如下：第一，RPA反應(yīng)中關(guān)鍵酶以凍干顆粒形式存在，易于保存；第二，RPA反應(yīng)時(shí)間一般不超過30 min；第三，RPA屬于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，不需要復(fù)雜的變溫過程，對(duì)儀器設(shè)備要求較低[17]。目前RPA方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種病原微生物的檢測，如PCV-2[18]、豬細(xì)小病毒[19]、FMDV[20]、致病性鉤端螺旋體[21]、B組鏈球菌[22]、瘧原蟲[23-24]等病原檢測。此外，在食品安全、生物安全和癌癥等領(lǐng)域RPA技術(shù)都也已有相關(guān)研究。

本研究根據(jù)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了pcDNA3.1-12L真核重組質(zhì)粒，并以此作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行RPA擴(kuò)增。在引物設(shè)計(jì)方面，12L-RPA引物長度約為30～35 bp，因?yàn)檫@將有利于單鏈結(jié)合蛋白與寡核苷酸（引物）的結(jié)合，使其有效的整合到雙鏈DNA[25]。篩選得到最適引物后，對(duì)RPA反應(yīng)組分引物濃度與模板量進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)模板拷貝數(shù)較低時(shí)，加入引物量越小、模板量越大時(shí)，擴(kuò)增效果較為明顯。優(yōu)化溫度區(qū)間為30℃～42℃，由圖3可知，12L基因在35℃、37℃擴(kuò)增效果較好，經(jīng)半定量分析發(fā)現(xiàn)，35℃產(chǎn)物量與37℃時(shí)的產(chǎn)物量雖相差無幾，但35℃下反應(yīng)重復(fù)性、靈敏性較37℃效果更好。建立的RPA檢測方法特異性針對(duì)ASFV Georgia 2007/1毒株12L基因缺失毒株進(jìn)行檢測，檢測限為1×103copies/μL，但反應(yīng)時(shí)間僅為普通PCR的1/4，可初步應(yīng)用于ASFV Georgia 2007/1 MGF360-12L缺失毒株的鑒別診斷。