張?zhí)焯欤跞社?，陳路銘，羅 芹，蒲翠敏，劉麗娟，李 晨，王開功

（貴州大學動物科學學院，貴陽 550025）

豬膿腫是指組織或器官內(nèi)形成的外有包膜內(nèi)有膿汁蓄積的局限性感染病灶，是由于皮膚或黏膜損傷，沒有及時處理，使細菌直接侵入并大量繁殖，引起局限性化膿性炎癥而發(fā)生的膿腫[1]。豬的膿腫病多發(fā)于3～10月，尤其以5～8月最為流行[2]。引起膿腫的病原菌有多種，如葡萄球菌（Staphylococcus）、鏈球菌（Streptococcus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、化膿隱秘桿菌（Pseudomonas pyogenes）等[3-4]。豬患膿腫病后會出現(xiàn)食欲減退、體溫升高、精神不振等臨床癥狀，同時膿腫多長于豬的四肢、臀部及頸部，嚴重妨礙豬的采食、行動及休息，從而影響豬的生長發(fā)育、飼料轉(zhuǎn)化率和豬肉的品質(zhì)。病豬病程過長或膿汁被仔豬誤食，會導致豬的死亡，增大經(jīng)濟損失。為提升規(guī)模化豬場的經(jīng)濟效益，應(yīng)及時對豬場膿腫病進行預防及治療。

本研究通過對貴陽市某規(guī)模化養(yǎng)豬場實地考察，初步了解豬膿腫病的發(fā)病季節(jié)、年齡、種群、感染部位等并記錄；同時，采集發(fā)病部位的膿汁，進行細菌分離鑒定，對分離到的細菌性病原體進行藥敏試驗；根據(jù)研究結(jié)果總結(jié)該豬場豬膿腫引發(fā)原因、發(fā)病情況、主要致病菌及其敏感藥物，為該豬場豬體表膿腫的防治提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣本 2018年7月無菌采集貴陽市高坡鄉(xiāng)某規(guī)?；B(yǎng)豬場患病豬體表未破裂膿包中膿汁6份，分別編號為1～6號樣本，低溫運輸。

1.2 試劑與培養(yǎng)基 革蘭氏染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；疊氮鈉葡萄糖肉湯購自青島海博生物技術(shù)有限公司；普通培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基細菌微量生化反應(yīng)管、藥敏紙片均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 實驗動物 30 g雌性健康小鼠24只，購自貴州醫(yī)科大學試驗動物中心。

1.4 細菌的分離培養(yǎng) 將無菌采集的1～6號膿汁樣本采用劃線法接種于血瓊脂培養(yǎng)基中，每份樣品接種兩組平板；一組有氧培養(yǎng)，一組無氧培養(yǎng)，置37℃恒溫箱培養(yǎng)12～48 h，觀察細菌的生長情況。挑取形態(tài)不同菌落接種于培養(yǎng)基進行純培養(yǎng)。

1.5 革蘭氏染色鏡檢 取50 μL純培養(yǎng)菌液滴加在載玻片上抹勻，烘干（火焰固定）后革蘭氏染色鏡檢。

1.6 細菌的生化特性鑒定 將純化培養(yǎng)的菌液，接種于生化鑒定管中，置恒溫箱37℃培養(yǎng)12～48 h，觀察結(jié)果并按照細菌生化鑒定手冊及參考相關(guān)文獻[7-10]進行初步鑒定。

1.7 藥敏試驗 選用臨床上較為常用的13種抗菌藥物，運用紙片擴散法將藥敏紙片分別置于涂有目的菌的培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～48 h；測量抑菌圈直徑并與杭州微生物試劑公司《藥敏試驗紙片法的抑菌范圍解釋標準》比較，根據(jù)抑菌圈的大小將細菌分為敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）。

1.8 16S rDNA的PCR擴增與測序 細菌16S rDNA引物序列由生工生物工程（上海）有限公司合成，上游：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGAT GA-3'，下游：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT AGC-3'。以分離到的3株細菌DNA為模板，利用細菌的16S rDNA基因的通用引物進行PCR擴增。

反應(yīng)總體系（50 μL）：GreenTaqMix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板4 μL，ddH2O 17 μL。反應(yīng)條件：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸110 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收產(chǎn)物送生工生物工程（上海）有限公司測序。

1.9 16S rDNA同源性分析 將所測分離菌株的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的序列進行比對，運用DNAStar軟件將所測序列和參考序列進行比對和同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.10 小鼠致病性試驗 將小鼠分為3組，每組設(shè)試驗組（4只健康小鼠）和對照組（4只健康小鼠），將鑒定的停乳鏈球菌類馬亞種、金黃色葡萄球菌、化膿隱秘桿菌菌液培養(yǎng)物按0.1 mL/只（細菌濃度分別為1.64×108CFU/mL、2.04×108CFU/mL、1.78×1010CFU/mL）劑量腹腔注射小白鼠，對照組腹腔注射無菌液體培養(yǎng)基。各組接種后隔離飼養(yǎng)，每隔6 h觀察一次小鼠的臨床表現(xiàn)，連續(xù)觀察1周。對各組出現(xiàn)癥狀及死亡的小鼠進行剖檢觀察，分離腹腔與病變臟器內(nèi)細菌，并對分離菌進行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)觀察結(jié)果 接種樣本于血平板上37℃需氧及無氧培養(yǎng)24 h后，2、3、4號樣本培養(yǎng)基均長出菌1、菌2、菌3三種菌落，1、6號樣本培養(yǎng)基長出菌1、菌2兩種菌落，5號樣本培養(yǎng)基長出菌2一種菌落。菌1生長較快，培養(yǎng)12 h后已有明顯菌落，菌落較大，有光澤，呈圓形凸起，顏色白色偏金黃；菌2生長較慢，在培養(yǎng)36 h后才出現(xiàn)較明顯的形態(tài)，呈半透明狀的細小菌落；菌3呈灰白色，表面光滑，有光澤的細小菌落；三種菌均出現(xiàn)溶血現(xiàn)象（圖1）。

2.2 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果 將3株菌純培養(yǎng)后進行革蘭氏染色。鏡檢結(jié)果顯示：3株菌均為革蘭氏陽性菌；菌1呈單個、多個或呈葡萄狀排列的球菌；菌2為兩端鈍圓短棒狀桿菌；菌3呈球形或卵圓形，在固體培養(yǎng)基上生長，以1～6個形成短鏈狀，且以單個或雙個形式居多，液體培養(yǎng)基中多以6個以上形成長鏈狀。根據(jù)分離地點和時間將其分別命名為GZGP2018-1、GZGP2018-2和GZGP2018-3（圖2）。

圖1 3種菌在血瓊脂平板培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of three strains on blood agar plate medium

圖2 革蘭氏染色結(jié)果Fig.2 Gram stain results

2.3 生化鑒定結(jié)果 將分離到的細菌培養(yǎng)物接種至相應(yīng)的生化鑒定管中，37℃培養(yǎng)12～48 h，記錄分離菌株的各項生化試驗結(jié)果，鑒定出GZGP2018-1、GZGP2018-2、GZGP2018-3的生化特性分別與金黃色葡萄球菌、停乳鏈球菌類馬亞種和化膿隱秘桿菌的生化特征一致，結(jié)果見表1、2、3。

表1 菌株GZGP2018-1生化特性Table 1 Biochemical identification of Staphylococcus aureus

2.4 16S rDNA測序分析結(jié)果 以細菌總DNA為模板，利用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增，擴增片段大小約為1500 bp，結(jié)果見圖4。測序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站上已提交的序列進行BLAST比對，結(jié)果見表4。

2.5 細菌藥敏分析結(jié)果 紙片擴散法對3株細菌進行藥物的敏感性實驗，結(jié)果見表5。由表可知，細菌對日常使用的大部分抗生素都有一定的耐藥性，其中分離菌GZGP2018-1株對磺胺間甲氧嘧啶、氟苯尼考、頭孢拉定敏感；GZGP2018-2株對青霉素、慶大霉素、卡那霉素、丁胺卡那、氟苯尼考和頭孢拉定敏感；GZGP2018-3對磺胺間甲氧嘧啶、丁胺卡那、環(huán)丙沙星和頭孢拉定敏感。GZGP2018-1與GZGP2018-3對青霉素類藥物耐藥，3株菌均對紅霉素耐藥。

表2 菌株GZGP2018-2生化特性Table 2 Biochemical identification of Streptococcus mutans

表3 菌株GZGP2018-3生化特性Table 3 Biochemical identification of pyogenic pyogenes

表4 豬體表膿包中細菌鑒定結(jié)果Table 4 Results of bacterial identification in pig pustules

圖3 16S rDNA擴增結(jié)果Fig.3 Electropherogram of 16S rDNA amplification results

表5 分離菌株的藥物敏感性Table 5 Drug sensitivity of isolated strains

2.6 16S rDNA同源性分析結(jié)果

2.6.1 GZGP2018-1 16S rDNA同源性分析 同源性分析結(jié)果顯示，本試驗分離所得GZGP2018-1株的16S rDNA與NCBI上的金黃色葡萄球菌菌株的同源性為99.7%～99.9%；且與金黃色葡萄球菌菌株1549-REV（GenBank登錄號：LT992436.1）、CICC 10384（GenBank登錄號：KJ643929.1）、F17SA003（GenBank登錄號：CP031130.1）、GD1539（GenBank登錄號：CP019594.2）、YR1（GenBank登錄號：MH383083.1）的親緣關(guān)系最近，同源性達99.9%（圖4）。

2.6.2 GZGP2018-2 16S rDNA同源性分析 同源性分析結(jié)果顯示，本試驗分離所得GZGP2018-2株的16S rDNA與NCBI上的化膿隱秘桿菌菌株的同源性為99.5%～99.9%，且與化膿隱秘桿菌菌株M18（GenBank登錄號：JN578121.1）的親緣關(guān)系最近，同源性達99.9%（圖5）。

圖4 GZGP2018-1 16S rDNA系統(tǒng)進化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of GZGP2018-1 16S rDNA

圖5 GZGP2018-2 16S rDNA系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of GZGP2018-2 16S rDNA

2.6.3 GZGP2018-3 16S rDNA同源性分析 同源性分析結(jié)果顯示，本試驗分離所得GZGP2018-3株的16S rDNA與NCBI上的停乳鏈球菌類馬亞種菌株的同源性為99.6%～100%，且與停乳鏈球菌類馬亞種菌株eNo.61（GenBank登錄號：AB537922.1）的親緣關(guān)系最近，同源性達100%（圖6）。

圖6 GZGP2018-2 16S rDNA系統(tǒng)進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of GZGP2018-2 16S rDNA

2.7 動物致病性結(jié)果 小鼠在人工感染分離菌株2 h后，開始出現(xiàn)精神沉郁、被毛凌亂、蜷縮成團等臨床表現(xiàn)，對照組小鼠全部存活、無明顯的臨床癥狀。對死亡小鼠剖檢采集病料，進行細菌分離、生化試驗，結(jié)果顯示細菌特性均與原分離菌相同（表6）。

3 討論

豬膿腫的報道在我國相對較少，雖然近年來隨著規(guī)?；i場的擴大，該病發(fā)病率逐漸升高，但是由于其病死率較低，很容易被技術(shù)人員忽視。豬患豬膿腫后會出現(xiàn)精神不振、食欲降低等臨床癥狀，并且行動不便，導致飼料的轉(zhuǎn)化率降低，嚴重影響豬的生長發(fā)育和豬肉品質(zhì)，對豬場的經(jīng)濟效益回報率影響較大。造成豬膿腫的原因有很多，常見如日常飼養(yǎng)管理混亂、圈舍衛(wèi)生條件不達標、皮膚的機械性損傷等，病原菌侵入皮膚，形成皮下膿腫；養(yǎng)殖場人員在注射疫苗、藥物時操作不當，也會導致豬的注射部位出現(xiàn)膿腫。

經(jīng)調(diào)查，該豬場患豬膿腫的主要豬群為育肥豬和產(chǎn)豬，發(fā)病日齡3個月到3年不等，發(fā)病部位以腿部、頸部和臀部為主，每年患膿腫病的高峰期為6～7月。本研究從患豬膿腫膿汁中分離出了3株細菌，在通過形態(tài)學特征的觀察和鑒定后，結(jié)合分子鑒定手段進行了種屬分類，并通過動物回歸實驗對其致病性進行了研究。在對分離到的3株細菌進行同源性對比分析中發(fā)現(xiàn)，GZGP2018-1株16S rDNA與NCBI上的金黃色葡萄球菌的同源性為99.7%～99.9%，GZGP2018-2株16S rDNA與NCBI上的化膿隱秘桿菌的同源性為99.5%～99.9%，GZGP2018-3株16S rDNA與NCBI上的停乳鏈球菌類馬亞種的同源性為99.6%～100%。結(jié)果表明該養(yǎng)豬場豬膿腫的膿汁中的病原菌主要是停乳鏈球菌類馬亞種、金黃色葡萄球菌、化膿隱秘桿菌。其中金黃色葡萄球菌是一種條件性人畜共患病原菌，也是引起化膿感染的最常見的病原菌，可引起仔豬滲出性皮炎、豬心膜炎、奶牛乳房炎和子宮內(nèi)膜炎等多種動物的疾病，若治療不及時，常引起敗血癥而死亡[5-6]；停乳鏈球菌類馬亞種的報道較少，該菌可引發(fā)豬的關(guān)節(jié)炎、敗血癥，在大熊貓的局部化膿性感染中也有發(fā)現(xiàn)[7-8]；化膿隱秘桿菌在家畜之間的傳播，可導致廣泛多樣性的皮膚、內(nèi)臟器官和關(guān)節(jié)的非特異性化膿感染，如急性化膿性乳房炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎等[9-10]；3種細菌均可導致感染動物發(fā)生不同程度的局部化膿病變，也是導致該豬場豬體表膿腫的主要原因。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，青霉素、鏈霉素是該豬場對于豬疾病的治療常用的藥物，進而導致細菌對青霉素、鏈霉素耐藥，結(jié)合本研究的藥敏試驗結(jié)果3株細菌總體對頭孢拉定、環(huán)丙沙星、磺胺間甲氧嘧啶和氟苯尼考較敏感，該豬場飼養(yǎng)管理人員在臨床上使用頭孢拉定、氟苯尼考分別對豬膿腫進行治療，表現(xiàn)出了較好的治療效果。同時，養(yǎng)殖場還應(yīng)注意強化飼養(yǎng)管理水平，做好對這3種細菌的消毒工作，消除此類細菌引發(fā)豬，特別是抵抗力較低的豬體表膿腫，進一步導致敗血癥、關(guān)節(jié)炎暴發(fā)或死亡的隱患。

本次研究對分離出的3株菌株致病性及藥物敏感性進行了研究，并通過藥敏試驗篩選出部分對膿腫分離菌株有較好抑制作用的藥物，為豬膿腫的防治工作及深入研究提供了數(shù)據(jù)支持。