石保秋，張 迪，管 朔，張曉亮，賈敬亮，袁廣富，王 晶，范京惠，左玉柱

（1.河北農業(yè)大學動物醫(yī)學院，保定 071001；2.定州市動物防疫監(jiān)督總站，定州 073000；3.衡水市畜牧技術推廣站，衡水 053000）

變形桿菌是一種人畜共患的條件致病菌，屬于腸桿菌科變形桿菌屬，是一種無莢膜、無芽孢的具有遷徙生長能力的革蘭氏陰性桿菌，包括普通變形桿菌、奇異變形桿菌、產黏變形桿菌、潘氏變形桿菌和豪氏變形桿菌五種，其中奇異變形桿菌（Proteus mirabilis，PM）致病性最強[1]。近年來，奇異變形桿菌引起的人和動物發(fā)病的報道不斷增多[2-3]，關于變形桿菌的耐藥報道也不斷增多[4-6]。細菌耐藥與質粒、轉座子、整合型噬菌體以及近年來在細菌中發(fā)現(xiàn)的一種天然的克隆表達系統(tǒng)整合子（integron）密切相關[7]。目前已經發(fā)現(xiàn)的整合子，依據(jù)整合酶氨基酸序列的不同可分為6類，與耐藥相關的整合子主要是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類，尤其是Ⅰ類整合子在革蘭氏陰性桿菌中最為常見[8]。本研究對2018年7月分離自河北新樂市行唐縣某豬場病料中的疑似變形桿菌菌株進行培養(yǎng)純化、革蘭氏染色、遷徙生長實驗、16S rDNA 基因序列BLAST分析比對，確定兩株細菌為奇異變形桿菌；本研究并對兩株奇異變形桿菌進行小鼠致病實驗，菌株體外藥敏試驗以及耐藥基因Ⅰ類整合子的檢測，以期豐富豬源奇異變形桿菌的病原資料，為生產實踐中對該病的預防治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品和試驗動物 來自石家莊新樂某豬場和行唐某豬場送檢病死豬的肺臟、肝臟、脾臟、腎臟等組織。SPF級昆明小鼠45只，體重為18～22 g，購自河北醫(yī)科大學動物實驗中心。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、營養(yǎng)瓊脂購自北京奧博星生物技術有限責任公司；鮮血瓊脂平板由本實驗室配制；革蘭氏染色液購自濰坊市康華生物技術有限公司；藥敏片購自溫州康泰生物技術有限公司；2×mix購自康為世紀公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自美國BIOMIGA公司；pMD19-T、DL2000 DNA marker、DL5000 DNA marker購自寶生物工程（大連）有限公司，大腸桿菌 DH5α由河北農業(yè)大學動物醫(yī)學院預防獸醫(yī)實驗室制備保存。

1.3 細菌分離純化染色鏡檢 無菌剪取深層組織涂布在TSA培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱24 h，挑取疑似菌落繼續(xù)純化培養(yǎng)，直至獲得形態(tài)一致的單菌落時，進行涂片革蘭氏染色鏡檢。挑取單菌落分別接種在營養(yǎng)瓊脂平板和鮮血瓊脂平板。新樂市分離株命名為XL株，行唐分離株命名為XT株。

1.4 遷徙生長試驗 分別挑取兩株純化后菌落接種于TSA培養(yǎng)基平板的中心，過夜培養(yǎng)12 h，觀察是否有遷徙生長現(xiàn)象。

1.5 16S rDNA序列測定及分析 將已純化的細菌接種到TSB液體培養(yǎng)基，37℃、200 r/min 搖菌過夜12 h，取菌液1 mL，于13 201×g、4℃離心2 min，收集菌體，加150 μL ddH2O渦旋，煮沸10 min后，13201×g、4℃離心1 min，上清液作為模板，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩＜毦?6S rDNA的通用引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'[9]，預計擴增片段長度為1500 bp。PCR體系（20 μL）：2×TaqPCR mix 10 μL，ddH2O 6 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL。PCR程序為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min 40 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min，將PCR回收產物連接到pMD19-T載體，轉入大腸桿菌DH5α送北京中科西林公司測序。利用DNAStar軟件對不同來源的奇異變形桿菌進行同源性分析，構建進化樹。

1.6 小鼠致病試驗 將小鼠隨機分成9組，每組5只，其中1～4組分別腹腔注射倍比（10-3～100）稀釋的XL株菌液0.2 mL，5～8組分別腹腔注射倍比（10-3～100）稀釋的XT株菌液0.2 mL，9組為對照組，腹腔注射TSB液體培養(yǎng)基0.2 mL。接種后每天觀察小白鼠發(fā)病、死亡情況并做好記錄，及時解剖死亡小鼠，進行細菌分離，連續(xù)觀察7 d。用平板計數(shù)法測得XL株菌液初濃度為2.3×108CFU/mL，XT株菌液初濃度為2.1×108CFU/mL。

1.7 藥敏試驗 采用藥敏片瓊脂擴散法（K-B法）對分離的菌株進行試驗。將已純化的XL株、XT株菌液用TSB液體培養(yǎng)基稀釋至1.5×108CFU/mL，用無菌棉簽沾取菌液均勻地涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，用無菌鑷子夾取20種藥敏紙片貼至平板表面，37℃倒置培養(yǎng)18 h后測量抑菌圈直徑，參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會（clinical and laboratory standards institute，CLSI）手冊2013版進行結果判定。

1.8 Ⅰ類整合子的檢測 整合子的基本結構由5'保守末端（5'-conserved segment，5'-CS）、3'保守末端（3'-conserved segment，3'-CS）及中間的可變區(qū)組成（variable region，VR）[10]。依據(jù)兩端保守區(qū)設計合成引物，int-F：5'-GGCATCCAAGCAGCAAG-3'和int-R：5'-AAGCAGACTTGACCTGA-3'[11]，可變區(qū)為640～3500 bp[12]。擴增體系（20 μL）：2×TaqPCR mix 10 μL，ddH2O 6 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL。擴增程序為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸4 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因并連接至pMD19-T載體，轉入大腸桿菌DH5α進行克隆后，送北京中科西林公司測序，測序結果與NCBI公布相關序列比對。

2 結果

2.1 病原菌分離培養(yǎng)特征及遷徙生長現(xiàn)象 分離細菌XL株、XT株經多次純化后獲得色澤、形態(tài)單一的，呈圓形、扁平、半透明菌落，成擴散性生長，血瓊脂平板出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。革蘭氏染色，油鏡下鏡檢，發(fā)現(xiàn)分離菌株為兩端鈍圓的革蘭氏陰性短桿菌（圖1A）。遷徙生長試驗結果出現(xiàn)了明顯的同心圓環(huán)，每波圓環(huán)的外側逐漸由半透明變?yōu)槿榘咨▓D1B），出現(xiàn)典型的遷徙生長，符合變形桿菌的周期性群集運動特征[13]。XL株和XT株的形態(tài)和遷徙生長現(xiàn)象無明顯區(qū)別，圖片為XL株。

2.2 16S rDNA擴增 通用引物擴增16S rDNA結果（圖2）所示，其擴增條帶在1500 bp 左右，符合預期的片段長度。

2.3 16S rDNA序列同源性比較與系統(tǒng)進化樹的構建 將測序結果在NCBI進行BLAST分析對比，利用DNAStar 軟件進行核苷酸同源性分析，并構建系統(tǒng)進化發(fā)育樹 ，從圖3可以看出分離菌XL、XT株同源性為99.9%，親緣關系非常近，兩株細菌與豬源奇異變形桿菌(GenBank登錄號：HQ259935.1，CP034091.1)的同源性最高，為99.9%～100%，在分子水平證實兩株細菌為奇異變形桿菌。與潘氏變形桿菌（GenBank登錄號：KM259958.1、AB682277.1）、豪氏變形桿菌（GenBank登錄號：JX101457.1、KF733657.1）、產粘液變形桿菌（GenBank登錄號：AB682280.1、AB273746.1）的同源性為98.0%～99.4%，與肺炎克雷伯菌（GenBank登錄號：KT316422.1）、普羅維登斯菌（GenBank登錄號：KC456564.1）的同源性較低，為93.1%～94.6%。進化樹顯示分離菌與豬源奇異變形桿菌在同一分支，見圖4。

圖1 奇異變形桿菌XL株的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of Proteus mirabilis XL strain

圖2 16S rDNA 擴增結果Fig.2 16S rDNA amplification results

圖3 16S rDNA基因序列同源性比對Fig.3 16S rDNA gene sequence homology alignment

圖4 分離菌XT、XL株16S rDNA 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of the strain XT and XL 16S rDNA genes

2.4 小鼠致病試驗 將XL株菌液以2.3×108CFU/mL濃度腹腔注射的小鼠，8 h后出現(xiàn)精神萎靡、蜷縮、全身震顫、眼睛有分泌物且出血，16 h出現(xiàn)死亡；以2.3×106CFU/mL注射的小鼠，24 h后出現(xiàn)精神萎靡、糞便變稀粘連，48 h恢復正常。將XT株菌液以2.1×108CFU/mL濃度腹腔注射的小鼠，8 h后出現(xiàn)死亡，24 h小鼠全部死亡；以2.1×106CFU/mL注射的小鼠也有死亡，對照組全部正常存活，詳細下表1。采用改良寇氏計算LD50方法，XL株的LD50為2.9×107CFU/mL，XT株的LD50為4.19×106CFU/mL。

2.5 藥敏實驗結果 藥敏結果均見表2。兩株細菌耐藥性均很強，XL株對頭孢曲松、丁胺卡那、大觀霉素敏感，對米諾環(huán)素、慶大霉素中度敏感，對其他15種藥物耐藥。XT株僅對丁胺卡那敏感，對米諾環(huán)素、慶大霉素、氟苯尼考中度敏感，對其他16種藥物耐藥，說明兩株細菌的耐藥性有一定的差異。

2.6 Ⅰ類整合子的擴增結果 XL株和XT株均擴增出了整合子可變區(qū)條帶，結果見圖5，XL株擴增出3000 bp左右的條帶，XT株在2000 bp上下各擴增出的一條帶。經測序比對，XL株整合子攜帶的基因盒為“dfrA32+ereA+aadA2”，產生對甲氧芐氨嘧啶、紅霉素類與氨基糖苷類的耐藥性；XT株擴增出兩整合子攜帶“aadA2+linF”和“dfrA17+aadA5”等基因盒，分別產生對甲氧芐氨嘧啶與林可霉素類的耐藥性和對甲氧芐氨嘧啶與氨基糖苷類的耐藥性。

表1 同樣方式注射小鼠，小鼠實驗的實驗結果Table 1 Experimental results of mouse experiments

表2 藥敏實驗結果Table 2 Detailed results of drug susceptibility

3 討論

圖5 I類整合子的檢測結果Fig.5 Test results of class I integrons

變形桿菌作為一種人獸共患的條件致病菌，在多種動物[3]、市場肉品[14]以及人的相關報道中不斷增多，該菌的發(fā)病率和死亡率都較高，給人類和畜牧業(yè)發(fā)展帶來較大的經濟損失。有研究表明無論是發(fā)酵床養(yǎng)豬還是常規(guī)方式飼養(yǎng)，環(huán)境中均能分離到奇異變形桿菌，且發(fā)酵床中分離菌毒力更強[15]。本研究通過對不同來源的病死豬中分離到的細菌，進行純化培養(yǎng)、染色鏡檢及16S rDNA的擴增測序比對，最終鑒定分離菌為奇異變形桿菌，分別命名為XL株、XT株。應用高度保守的細菌16S rDNA序列分析對細菌進行鑒定已經是國際上通的鑒定技術[16]。由于變形桿菌的生化實驗與沙門氏菌相似，很容易誤判[17]，所以本實驗沒有進行生化實驗，而是直接進行16S rDNA的擴增，從分子水平進行細菌種屬的鑒定。從16S rDNA的序列比對中可以看出兩株細菌同源關系很近，處在同一分支，與NCBI上登錄的奇異變形桿菌的16S rDNA基因同源性高達99.9%～100%，與同屬革蘭氏陰性菌的肺炎克雷伯菌、普羅維登斯菌親緣關系較遠。小鼠致病試驗結果顯示，兩株細菌致病性均很強，但毒力存在差異，XL株的LD50為2.9×107CFU/mL，XT株的LD50為4.19×106CFU/mL。這可能與兩株細菌攜帶的毒力基因不同有一定的關系[18]。

兩株細菌都多重耐藥，國內外大量文獻報道整合子與細菌的耐藥性密切相關[19]。整合子在耐藥基因的水平轉移中起到了至關重要的作用，是細菌中的一種可移動性基因元件，5'-CS端有編碼整合酶的基因int，它可使耐藥基因盒從一個細菌傳播到另一個細菌，或者從一個DNA分子傳播到另一個DNA分子，從而引起耐藥性的相互傳播。本研究兩株奇異變形桿菌均擴增出整合子，整合子所攜帶的基因盒存在一定的差異。兩株細菌都擴增出了介導對甲氧芐氨嘧啶和氨基糖苷類等藥物的耐藥相關基因，但是XL株還攜帶介導對紅霉素類耐藥的基因，XT株攜帶介導對林可霉素類耐藥的基因，XL株只有1個整合子而XT株有2個整合子。與宿主菌的耐藥表型并不嚴格對應，如XL株沒有擴增出介導耐林可霉素類藥物的基因，而XT株擴增出了相關基因，但是藥敏結果顯示兩株細菌都對林可霉素耐藥，有研究表明變形桿菌還存在其他的耐藥基因[20]，對兩株細菌的耐藥性有待進一步深入研究。為了防止耐藥基因的擴散，一方面要進一步研究整合子的整合機制，另一方面養(yǎng)殖場也要合理的使用抗生素，不濫用抗生素。本研究分離鑒定了兩株豬源奇異變形桿菌，比對了他們16S rDNA同源性并構建了系統(tǒng)進化樹，并對兩株細菌的毒力、耐藥性以及耐藥相關基因做了初步探討，為下一步生產實踐中對該病的預防治療提供了依據(jù)。