柴迎錦 ，孔靜雅 ，鄔 琴 ，李 劼 ，周 霞 ，馬 勛 ，韓猛立

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院 省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832000）

單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是人畜共患病的重要病原之一。人感染后有較高的死亡率，在獸醫(yī)臨床中牛羊感染后表現(xiàn)為 “轉(zhuǎn)圈病”及孕畜發(fā)生流產(chǎn)等癥狀，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)較大的影響。在致病過(guò)程中細(xì)菌攜帶的鞭毛、菌毛、表面蛋白等[1]毒力因子對(duì)細(xì)胞的黏附和侵襲以及生物被膜（bacterial biofilm，BF）的形成發(fā)揮著重要作用。細(xì)菌的鞭毛在介導(dǎo)黏附時(shí)既能通過(guò)自身的運(yùn)動(dòng)性非特異性增加細(xì)菌與受體細(xì)胞接觸機(jī)率，促進(jìn)黏附并侵入宿主引發(fā)感染，也能通過(guò)鞭毛蛋白特異性與被感染細(xì)胞的鞭毛受體結(jié)合來(lái)完成細(xì)菌的黏附和侵襲[2-3]。腦炎大腸桿菌鞭毛基因缺失后對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力顯著降低[4]，大腸桿菌F18+的鞭毛缺失后對(duì)IPEC-1和IPEC-J2細(xì)胞的黏附能力也降低[5]。研究表明LM的鞭毛基因（flaA）過(guò)表達(dá)時(shí)能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞反應(yīng)[6]。鞭毛介導(dǎo)細(xì)菌在液體中的泳動(dòng)能在BF的形成中起到一定的作用，缺失了flaA基因后單核細(xì)胞增生李斯特菌GMYL1447的鞭毛形成缺陷、運(yùn)動(dòng)性能喪失，形成BF的能力明顯降低，但缺失株在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充裕的環(huán)境中卻能過(guò)度生成BF[7-8]。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室從發(fā)生“轉(zhuǎn)圈病”的羔羊大腦中分離鑒定了一株LM，命名為L(zhǎng)M90SB2。研究表明該分離株攜帶有多種毒力因子，能成功穿越血腦屏障，形成完整的BF，flaA基因缺失能影響細(xì)菌的半數(shù)致死量（lethal dose 50，LD50）[9-10]，但對(duì)宿主細(xì)胞的黏附和侵襲作用以及BF形成規(guī)律的影響并不明確。本研究通過(guò)在前期研究基礎(chǔ)上觀(guān)察缺失flaA基因的LM LM90SB2-ΔflaA對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7）和小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（mouse brain microvascular endothelial cells，MBMEC）的黏附和侵襲、不同時(shí)間段BF形成能力，分析flaA基因?qū)M毒力影響，為L(zhǎng)M致病機(jī)制的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 LM LM90SB2株由石河子大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存，其flaA基因缺失株（LM90SB2-ΔflaA）由作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；RAW264.7與MBMEC由新疆農(nóng)墾科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存；碘化丙啶（propidium iodide，PI）和異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的刀豆蛋白A（FITC-ConA）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自Hyclone公司。

1.2 對(duì)MBMEC的黏附、侵襲 將MBMEC置于9孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和雙抗（100 U/mL 青霉素和10 μg/mL 硫酸鏈霉素）的DMEM（dulbecco's modified eagle's medium）中培養(yǎng)，置于含5%CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)至細(xì)胞單層鋪于培養(yǎng)皿時(shí)，將LM90SB2與LM90SB2-ΔflaA菌懸液分別加入細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)1 h后洗滌并加入裂解液TritonX-100，倍比稀釋后計(jì)算黏附MBMEC的細(xì)菌數(shù)。

侵襲1 h后用含慶大霉素（100 μg/mL）的細(xì)胞完全培養(yǎng)液殺滅胞外細(xì)菌，經(jīng)過(guò)2 h的作用后PBS洗滌細(xì)胞板，按照上述方法統(tǒng)計(jì)侵襲入MBMEC的細(xì)菌數(shù)。

1.3 對(duì)RAW264.7細(xì)胞的黏附、侵襲 操作方法同1.2。

1.4 BF定量測(cè)定 將LM90SB2與LM90SB2-ΔflaA接種于96孔板，分別培養(yǎng)2、6、10、12、24、36、48 h后，加入10%結(jié)晶紫染色，再用乙醇-丙酮溶液溶解，測(cè)定D595值，采用SPSS Statistics軟件進(jìn)行單因素方差分析。

1.5 激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察BF的形成 將LM90SB2與LM90SB2-ΔflaA接種于放置有蓋玻片的6孔細(xì)胞板中，培養(yǎng)6、24 h后取出蓋玻片，用FITC-ConA和PI染液避光孵育后，在激光共聚焦顯微鏡（200×）觀(guān)察BF的形態(tài)。

1.6 小鼠肝臟、脾臟、腎臟載菌量的測(cè)定 將LM90SB2與LM90SB2-ΔflaA分別以L(fǎng)M90SB2的LD50的三分之二菌量感染小鼠，于感染后第24、48、72 h采集小鼠的肝臟、脾臟和腎臟進(jìn)行載菌量計(jì)數(shù)分析。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)MBMEC黏附和侵襲結(jié)果 黏附MBMEC 1 h后，LM90SB2-ΔflaA的黏附率（1.6%）顯著低于LM90SB2黏附率（2.8%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1；2 h后，侵襲MBMEC細(xì)胞的LM90SB2-ΔflaA的侵襲率約為0.058%，LM90SB2侵襲率約為0.065%，兩者差異不顯著，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2。

2.2 RAW264.7細(xì)胞的黏附和侵襲結(jié)果 黏附RAW264.7細(xì)胞1 h后，LM90SB2-ΔflaA的率（5.0%）顯著低于LM90SB2黏附率（8.9%）（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1；2 h后，LM90SB2-ΔflaA的侵襲率（2.3%）顯著低于LM90SB2侵襲率（3.3%）具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 BF形成量的測(cè)定結(jié)果 LM90SB2-ΔflaA與LM90SB2的BF形成規(guī)律基本相同，均從2 h形成BF，2～10 h BF逐漸增多，10 h時(shí)BF形成量進(jìn)入平穩(wěn)階段，但BF總量?jī)烧叽嬖陲@著差異（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；10 h后BF處于成熟階段，總量略有下降但總體較平穩(wěn)，解聚與形成過(guò)程處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，10 h后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)LM90SB2-ΔflaA的BF形成量均比LM90SB2形成的低（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3。

圖1 LM90SB2與LM90SB2-Δf l aA黏附率Fig.1 The adhension of LM90SB2 and LM90SB2-Δf l aA

圖2 LM90SB2與LM90SB2-Δf l aA侵襲率Fig.2 The invasion of LM90SB2 and LM90SB2-Δf l aA

圖3 LM90SB2與LM90SB2-Δf l aA形成BF的D595值Fig.3 D595 of BF produced by LM90SB2 and LM90SB2-Δf l aA

2.4 激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察BF的形態(tài)結(jié)構(gòu)結(jié)果LM90SB2-ΔflaA細(xì)菌核酸（紅色熒光）在6 h和24 h時(shí)明顯少于LM90SB2，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，即24 h檢測(cè)時(shí)紅色熒光均明顯增多，見(jiàn)圖4。其多糖物質(zhì)也隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增多（綠色熒光），6 h時(shí)可觀(guān)察到LM90SB2-ΔflaA帶有綠色熒光多糖，而24 h則出現(xiàn)大量的多糖物質(zhì)，見(jiàn)圖5。與LM90SB2-ΔflaA相比較，LM90SB2也呈現(xiàn)相似規(guī)律，但在每個(gè)階段死亡細(xì)菌的數(shù)量和多糖產(chǎn)生量明顯多于LM90SB2-ΔflaA，見(jiàn)圖4、5。

圖4 LM90SB2與LM90SB2-Δf l aA不同時(shí)間的核酸量Fig.4 Polysaccharides produced by LM90SB2 and LM90SB2-Δf l aA at different time points

圖5 LM90SB2與LM90SB2-Δf l aA不同時(shí)間的多糖形成量Fig.5 Polysaccharides produced by LM90SB2 and LM90SB2-Δf l aA at different time points

2.5 肝臟、脾臟、腎臟載菌量的測(cè)定結(jié)果 接種后兩組小鼠均出現(xiàn)了精神不振、行動(dòng)緩慢、被毛雜亂、眼睛分泌物增多等癥狀。分別在接種后第24、48、72 h對(duì)小鼠進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)兩組小鼠肝臟、脾臟、腎臟都出現(xiàn)了明顯的腫大，脾臟病變明顯，從接種48 h后兩組小鼠均出現(xiàn)了脾臟大理石樣變。

肝臟載菌量LM90SB2-ΔflaA組顯著低于LM90SB2組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖6A；脾臟載菌量LM90SB2-ΔflaA組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均低于LM90SB2組的載菌量，但差異不顯著，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖6B；腎臟載菌量LM90SB2-ΔflaA組與LM90SB2組比較，差異不顯著，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖6C。

圖6 LM90SB2和LM90SB2-Δ fl aA在小鼠體內(nèi)的載菌量測(cè)定結(jié)果Fig.6 The microbial numbers of LM90SB2 and LM90SB2-Δ fl aA in mice

3 討論

LM通過(guò)動(dòng)物的血腦屏障引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患。小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（MBMEC）、小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7）能夠作為模式細(xì)胞進(jìn)行LM相關(guān)研究[11-12]。鞭毛在細(xì)菌感染過(guò)程可通過(guò)自身特點(diǎn)參與宿主細(xì)胞的黏附和侵襲[13]。同時(shí)在BF形成中使浮游細(xì)菌趨化、克服載體表面張力、非活性載體表面的黏附、穩(wěn)定BF結(jié)構(gòu)等作用[14]。如大腸桿菌F18ab的fliC基因缺失后對(duì)細(xì)胞的黏附和侵襲能以及形成BF的能力降低[4]。編碼LM細(xì)胞質(zhì)合成酶的fliI基因缺失后鞭毛形成缺陷，黏附和侵襲上皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞能力降低[15]。本文通過(guò)構(gòu)建LM90SB2flaA基因缺失株發(fā)現(xiàn)缺失株對(duì)MBMEC細(xì)胞的黏附數(shù)顯著降低，而侵襲數(shù)差異不顯著；對(duì)RAW264.7細(xì)胞的黏附數(shù)和侵襲數(shù)均顯著降低。推測(cè)flaA在LM穿越血腦屏障時(shí)發(fā)揮重要作用，但并不參全過(guò)程，而flaA缺失能降低細(xì)菌對(duì)巨噬細(xì)胞的黏附和穿入作用。

很多能形成BF的菌株中flaA基因的檢出率極高[16]，比如，空腸彎曲桿菌、霍亂弧菌等缺失flaA基因后BF形成能力降低[17-20]。LM中flaA的表達(dá)受flgL基因的調(diào)控，缺失了flaA基因后的GMYL1447與缺失了flgL基因的GMYL1432的BF形成能力明顯降低；但在氧氣、特殊pH、營(yíng)養(yǎng)充足的工業(yè)模型環(huán)境中的缺失flaA與flgL基因的LM能引發(fā)BF過(guò)度形成[8]。本研究通過(guò)檢測(cè)flaA缺失株時(shí)發(fā)現(xiàn)BF形成量下降、BF中的多糖與核酸的含量也明顯減少，表明flaA在一定程度上影響LM90SB2的BF形成。

相同菌量的LM90SB2和LM90SB2-ΔflaA通過(guò)腹腔注射感染小鼠后，分別在接種第24、48、72 h對(duì)小鼠的肝臟、脾臟、腎臟的載菌量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，小鼠臟器含有的LM90SB2-ΔflaA量始終低于LM90SB2量。說(shuō)明flaA基因的缺失會(huì)影響LM90SB2在各臟器中的增殖。

本研究發(fā)現(xiàn)flaA基因的缺失雖然沒(méi)有完全喪失LM90SB2的致病性和毒力，但是flaA基因的缺失確實(shí)減弱了LM90SB2的致病性和毒力，同時(shí)影響了LM90SB2的BF形成和對(duì)細(xì)胞的侵害。由此，可初步推測(cè)flaA基因的缺失能影響單核細(xì)胞李斯特菌致病性等特性，但其中具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。