王雅楠,張一冉,楊 楊,韓育梅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

李子是具有重要經(jīng)濟價值的核果類果實,采后呼吸強度高,后熟速度快,常溫貯藏條件下極易發(fā)生腐爛變質(zhì),難于長期貯藏[1]。低溫貯藏可降低果實的呼吸作用而減少貯藏期間的物質(zhì)消耗,推遲果實呼吸躍變,能有效延長果實的貯藏期[2]。但李子又屬于冷敏型果實,低溫適應(yīng)性差,貯藏溫度低于7 ℃時便會發(fā)生冷害,表現(xiàn)出果肉褐變、風味劣變、腐爛程度加劇等癥狀致使果實品質(zhì)降低甚至喪失商品價值[3-4]。冷害現(xiàn)象嚴重制約了低溫貯藏在李果實采后保鮮中的應(yīng)用,冷害防治在李果實保鮮貯藏實踐中至關(guān)重要。

水楊酸(salicylic acid,SA)是高等植物體內(nèi)普遍存在的一種結(jié)構(gòu)簡單的酚類物質(zhì),具有信號分子的作用,其激活植物系統(tǒng)獲得性抗性的功能已被熟知,近年來又發(fā)現(xiàn)SA可以增強植物對低溫的耐受性,如果實的抗冷能力[5-6]。LUO等[7]研究發(fā)現(xiàn)SA能夠抑制低溫貯藏期間李果實的冷害發(fā)生,延緩內(nèi)部果肉褐變、表皮壞死凹陷、風味劣變等冷害癥狀。但其引發(fā)抗冷效應(yīng)的關(guān)鍵機制及其與其他抗冷信號分子之間的關(guān)系尚不清晰,探明這些問題對于闡釋SA增加采后果實低溫耐受性的機制十分必要。乙烯是調(diào)控呼吸躍變型果實采后成熟衰老的重要植物激素,在果實采后抗逆信號網(wǎng)絡(luò)中占有重要的地位,陳鑫瑤等[8]研究發(fā)現(xiàn)乙烯受體抑制劑1-甲基環(huán)丙烯(1-methylcyclopropene,1-MCP)處理加劇了(2±1) ℃下采后番茄果實的冷害癥狀。此外一些研究也發(fā)現(xiàn)乙烯可能參與了SA所調(diào)節(jié)的信號過程,李翠丹等[9]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙烯參與了SA誘導采后番茄果實的抗病過程,LIU等[10]報道了擬南芥的抗冷誘導過程中SA和乙烯存在互作關(guān)系,但在采后果實的冷防御信號誘導過程中SA和乙烯信號之間的關(guān)系還有待加以明確。

因此,本試驗以中熟期“布朗”李果實為材料,分別對其采用1.0 mmol/L SA、1.0 μL/L 1-MCP和1.0 mmol/L SA結(jié)合1.0 μL/L 1-MCP處理,以蒸餾水處理作為對照,通過研究其對冷害和活性氧代謝的影響,探討SA誘導采后李果實抗冷能力產(chǎn)生的機制以及該過程與乙烯信號的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試李子 采自于呼和浩特市土左旗果園,品種為“布朗”,成熟度中等,果實顏色紫紅色著色面積占2/3,香氣明顯,手感較軟。采后立即運回實驗室,選擇形狀、大小一致,成熟度、色澤基本相同,無病蟲害和機械損傷的果實進行試驗;SA 天津市風船化學試劑科技有限公司;1-MCP 陜西秦豐農(nóng)化有限公司;硫代巴比妥酸、愈創(chuàng)木酚 國藥集團化學試劑有限公司;過氧化氫 天津市永晟精化工有限公司;其他均為國產(chǎn)試劑分析純。

TGL-16M高速冷凍離心機 上海盧湘離心機儀器有限公司;T6新世紀型紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;DDSJ-318電導率儀 上海儀電科學儀器股份有限公司;電熱恒溫水浴鍋 北京長安科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料處理 將果實隨機等分為四組,SA處理組:用1.0 mmol/L SA浸泡果實30 min;1-MCP處理組:用蒸餾水浸泡30 min后,晾干將果實進行1.0 μL/L 1-MCP熏蒸處理30 min;SA+1-MCP處理組:用1.0 mmol/L SA浸泡果實30 min,再用1.0 μL/L 1-MCP熏蒸處理30 min;CK組:用蒸餾水浸泡30 min為空白對照。將處理后的李果實自然晾干貯藏于4 ℃,85%～90%相對濕度冷庫。每組處理 180個果,每6 d記錄冷害發(fā)生情況并取樣測定各種生理指標,每組每次取樣30 個果實。將果肉切成約 0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 的小塊,立即用液氮速凍,放入-80 ℃超低溫冰箱儲存并用于相關(guān)指標的測定。

1.2.2 指標測定

1.2.2.1 冷害發(fā)生率和冷害指數(shù)測定 參考陳鑫瑤[8]的方法,以單個果實冷害程度達1級及以上計為冷害果,統(tǒng)計冷害果占總果數(shù)的百分率。按照下列公式計算果實的冷害發(fā)生率:

參考LUO[7]、陳鑫瑤[8]的方法,通過沿著赤道軸將每個果實切成兩半并通過褐變程度評估果實冷害的癥狀。根據(jù)果面的褐變發(fā)生面積分為5級:0級—無冷害;1級—果肉褐變占果面面積的0～25%;2級—果肉褐變占果面面積的26%～50%;3級—果肉褐變占果面面積的51%～75%;4級—果肉褐變占果面面積的76%～100%。按照下列公式計算果實的冷害指數(shù):

1.2.2.2 過氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性的測定 POD活性測定:參考曹建康等[11]方法并稍作修改,提取體系為0.1 mol/L、pH6.6的檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液(內(nèi)含 4%(w/v)PVPP,1%(v/v)Triton X-100)。反應(yīng)體系是25 mmol/L愈創(chuàng)木酚溶液。在反應(yīng)體系中加入0.5 mL酶提取液,均勻混合后,再加入200 μL 0.5 mol/L H2O2溶液迅速混合啟動反應(yīng),測定5 min內(nèi)470 nm波長下吸光度值的變化。以每克鮮重樣品每分鐘吸光度變化值增加1為1個過氧化物酶活單位,結(jié)果以U/g FW表示。

PPO活性測定:參考曹建康等[11]的方法,提取體系為0.1 mol/L、pH=5.5 的乙酸—乙酸鈉提取緩沖液(內(nèi)含 1 mmol/L 聚乙二醇6000,4%(w/v)PVPP,1%(v/v)Triton X-100)。反應(yīng)體系是50 mmol/L、pH=5.5的乙酸—乙酸鈉緩沖液和50 mmol/L 的鄰苯二酚溶液,最后加入 100 μL 酶提取液混合啟動反應(yīng),測定5 min內(nèi)420 nm波長下吸光度值的變化。以每克鮮重樣品每分鐘吸光度變化值增加1為1個多酚氧化酶活單位,結(jié)果以U/g FW表示。

1.2.2.3 細胞膜滲透率和丙二醛(MDA)含量測定 細胞膜滲透率:參考曹建康等[11]的方法。

丙二醛含量:采用硫代巴比妥酸方法,略有改進。提取體系為100 g/L TCA溶液[7,12]。反應(yīng)體系為酶提取液、0.6%(w/v)TBA(由100 g/L TCA配成),混合后在95 ℃水浴20 min,迅速冷卻并以10000×g離心10 min。再分別測定上清液在450、532和600 nm波長處的吸光度值,并計算MDA的含量。結(jié)果以nmol/g FW表示。

1.2.2.4 超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性的測定 SOD活性測定:參考丁波等[13]的方法。提取體系為0.1 mol/L、pH=7.8 的磷酸提取緩沖液(內(nèi)含 5 mmol/L 二硫蘇糖醇和 5%(w/v)PVP)。反應(yīng)體系是50 mmol/L、pH=7.8 磷酸緩沖液(內(nèi)含13 mmol/L甲硫氨酸、75 μmol/L氮藍四唑、10 μmol/L EDTA-Na2和2 μmol/L核黃素),在反應(yīng)體系中加入0.1 mL酶提取液,光照25 min后,在560 nm波長比色,以每分鐘每克鮮重樣品的反應(yīng)體系對氮藍四唑光化還原的抑制為50%為一個SOD 活性單位(U)。結(jié)果以U/g FW表示。

CAT活性測定:參考曹建康等[11]方法并加以修改。提取體系為0.2 mol/L、pH7.9的磷酸鈉緩沖液(內(nèi)含1%(v/v)Triton X-100)。反應(yīng)體系是酶提取液、0.2 mol/L、pH7.9的磷酸鈉緩沖液、蒸餾水,均勻混合后,將混合液置于30 ℃下恒溫反應(yīng)30 min,再加入300 μL 0.1 mol/L H2O2溶液迅速混合啟動反應(yīng),測定樣品在波長240 nm處每隔30 s吸光度值的變化。以每克鮮重樣品每分鐘吸光度變化值減少0.01為1個過氧化氫酶活單位,結(jié)果以U/g FW表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上試驗測定重復三次,各項指標測定值均取三個平行值進行數(shù)據(jù)分析。采用Excel 2007的STDEV與SPSS 20.0的ANOVA進行統(tǒng)計處理。所有圖表采用Orgin9.4繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對李果實低溫貯藏期間冷害發(fā)生率和冷害指數(shù)的影響

由圖1A可知,李果實低溫貯藏第6 d各處理組均不同程度出現(xiàn)冷害癥狀,對照組、SA處理組、1-MCP處理組和SA結(jié)合1-MCP處理組果實冷害發(fā)生率依次為10.00%、3.33%、13.33%和6.67%,冷害指數(shù)依次為:0.025、0.008、0.042和0.017,1-MCP處理組冷害發(fā)生率和冷害指數(shù)均顯著高于對照組(P<0.05),SA處理和SA結(jié)合1-MCP處理組冷害發(fā)生率和冷害指數(shù)均顯著低于對照組(P<0.05);隨著貯藏時間的延長各處理組果實冷害發(fā)生率冷害指數(shù)均逐漸增加,到第24 d時1-MCP處理的冷害發(fā)生率為83.33%,冷害指數(shù)為0.733;SA處理組冷害發(fā)生率為50%,冷害指數(shù)為0.400;SA結(jié)合1-MCP處理組冷害發(fā)生率為63.33%,冷害指數(shù)為0.500。與對照組相比,SA處理和SA結(jié)合1-MCP處理均顯著降低了貯藏第24 d時果實冷害的發(fā)生(P<0.05),其中SA處理組的冷害發(fā)生速度低于SA結(jié)合1-MCP處理組。貯藏第30 d時,各處理組果實均發(fā)生冷害現(xiàn)象,各處理組果實的冷害指數(shù)在貯藏結(jié)束后均達到最大,SA處理組和SA結(jié)合1-MCP處理組的冷害指數(shù)顯著低于對照組(P<0.05),分別為0.917和0.967,1-MCP處理和對照組的冷害指數(shù)最高為1。這表明1-MCP處理加重了4 ℃條件下果實冷害的發(fā)生,SA和SA結(jié)合1-MCP處理均顯著抑制了果實冷害的發(fā)生,但SA結(jié)合1-MCP的抑制能力低于SA單獨處理。(圖1A、1B)。

圖1 不同處理對李果實4 ℃貯藏期間冷害發(fā)生率和冷害指數(shù)的影響Fig.1 Effects of different treatments on the chilling injury rate and chilling injury index of plum fruit during storage at 4 ℃

2.2 不同處理對李果實低溫貯藏期間POD和PPO活性的影響

褐變是李果實冷害的典型現(xiàn)象,與POD和PPO所引發(fā)的酚類物質(zhì)的氧化有關(guān)。由圖2A可以看出,SA處理組果實POD活性高峰出現(xiàn)于處理后第24 d,對照李果實POD活性高峰出現(xiàn)于第12 d,SA處理推遲了果實POD活性上升,抑制李果實POD活性,減輕果肉褐變程度;1-MCP處理組果實POD活性于處理后第6 d達到活性最大值并顯著(P<0.05)高于對照和其他處理組,隨后POD活性迅速下降后上升,果肉褐變癥狀最先出現(xiàn),在整個貯藏期間1-MCP處理組果實果肉褐變程度最為嚴重;SA結(jié)合1-MCP處理果實POD活性于處理后第6 d達到活性最大值,但POD活性又迅速下降,在貯藏12～18 d期間低于對照組,抑制李果實果肉褐變冷害癥狀。PPO活性在SA、1-MCP處理和對照果實中表現(xiàn)出類似的模式(圖2B),綜上所述,SA處理推遲了果實POD、PPO活性上升,減輕果肉褐變程度;1-MCP處理組果實POD、PPO活性于貯藏前期達到活性最大值,果肉褐變癥狀最先出現(xiàn),隨著貯藏時間的延長果肉褐變嚴重,從而導致貯藏后期李果實細胞壞死嚴重;而SA結(jié)合1-MCP處理果實在貯藏(第12～18 d)中期抑制POD、PPO等促褐變酶的活性,延緩果肉褐變等冷害現(xiàn)象。

圖2 不同處理對李果實4 ℃貯藏期間POD和PPO活性的影響Fig.2 Effects of different treatments on POD and PPO activities of plum fruit during storage at 4 ℃

2.3 不同處理對李果實低溫貯藏期間相對電導率和MDA含量的影響

圖3 不同處理對李果實4 ℃貯藏期間細胞膜滲透率和MDA含量的影響Fig.3 Effects of different treatments on cell membrane permeability and MDA content of plum fruit during storage at 4 ℃

細胞滲透率是衡量細胞膜完整性的重要指標之一,反映細胞膜損傷的程度和組織器官衰老程度。由圖3A可知,對照組果實在貯藏0～24 d期間細胞膜滲透率平均上升速率為0.97%/d,而SA處理組果實相對電導率平均上升速率為0.91%/d,SA顯著抑制(P<0.05)果實貯藏期間細胞膜滲透率的增加。1-MCP處理在貯藏前期第6 d達到細胞膜滲透率最大值71.49%,顯著高于其他三組果實(P<0.05),并一直保持較高的水平,SA結(jié)合1-MCP處理的相對電導率變化趨勢與SA處理組果實變化一致,該處理顯著抑制了貯藏(第18～24 d)相對電導率的升高(P<0.05)。MDA是膜脂過氧化代謝產(chǎn)物,其含量大小反映細胞膜破壞的程度。圖3B結(jié)果顯示,SA處理組果實MDA含量在整個貯藏期間顯著低于對照組(P<0.05);1-MCP處理果實MDA在貯藏前期升高較快,第6 d和第24 d時顯著(P<0.05)高于對照組;SA結(jié)合1-MCP處理組在貯藏12～18 d期間MDA含量顯著(P<0.05)低于對照組。SA處理對整個貯藏期李果實MDA含量的增加有抑制作用,而SA結(jié)合1-MCP處理在貯藏(第12～18 d)中期對MDA含量增加有抑制作用。

2.4 不同處理對李果實低溫貯藏期間SOD和CAT活性的影響

圖4 不同處理對李果實4 ℃貯藏期間SOD和CAT活性的影響Fig.4 Effects of different treatments on SOD and CAT activities of plum fruit during storage at 4 ℃

SOD和CAT是生物細胞代謝酶系的重要成員,與活性氧清除密切相關(guān)。由圖4A可知,隨著貯藏時間的延長SOD活性總體呈先上升后下降的變化趨勢。三組處理SOD活性在低溫貯藏6～18 d期間均顯著(P<0.05)高于對照組,其中SA處理組果實在此期間一直保持最高的SOD活性,并在第6 d達到了整個貯藏期SOD活性的最大值1.15 U/g FW,是對照組第6 dSOD活性的1.21倍。由圖4B可知,在整個貯藏期間,各處理和對照組果實CAT活性總體呈上升的趨勢,其中SA處理組活性上升的速度最快,并于處理后第24 d達到CAT活性最大值(30.33 U/g FW),顯著(P<0.05)高于對照組和其他兩組處理;1-MCP處理果實在貯藏18～24 d期間CAT活性顯著(P<0.05)低于對照組。SA結(jié)合1-MCP處理組果實在貯藏12～30 d 期間一直保持較高的CAT活性,且始終顯著高于對照(P<0.05)。上述結(jié)果表明,SA處理和SA結(jié)合1-MCP處理可提高SOD、CAT活性,1-MCP處理抑制了貯藏第18～24 d的CAT的活性。SA結(jié)合1-MCP處理組果實在低溫貯藏期間也保持了較高的SOD、CAT活性但整體水平低于SA處理組。

3 結(jié)論與討論

果實對低溫等逆境環(huán)境的耐受性提高并非關(guān)于單一信號分子作用的結(jié)果,而是依靠一套信號調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)的。在SA提高植物對生物和非生物脅迫適應(yīng)能力的研究中,乙烯信號作用一直備受關(guān)注。李翠丹[9]、S. Sugano[37]、LIU等[10]在抗病、低溫脅迫領(lǐng)域的研究表明SA和乙烯存在互作關(guān)系。本試驗研究結(jié)果顯示:與空白對照相比,乙烯受體競爭性抑制劑1-MCP 處理李果實隨著低溫貯藏時間的延長冷害癥狀加劇,果實POD、PPO活性于貯藏前期達到活性最大值,果肉褐變癥狀最先出現(xiàn),從而導致貯藏后期李果實細胞壞死嚴重,對減輕李果實冷害沒有任何明顯作用,反而加劇果實冷害癥狀,這有可能是因為1-MCP抑制乙烯信號分子的傳導與表達,進而加重李果實的冷害現(xiàn)象,這與陳鑫瑤[8]在番茄果實上的研究結(jié)果相似。而1-MCP處理只在貯藏前、中期提高SOD活性,對CAT活性提高起到抑制的作用,推測1-MCP處理李果實無法利用CAT將有毒性的H2O2分解為無毒的H2O和O2,進而導致李果實體內(nèi)積累大量的H2O2,可能直接或間接地導致細胞膜脂質(zhì)過氧化損害,細胞膜結(jié)構(gòu)和功能受損嚴重,使貯藏前期細胞滲透率和MDA含量處在較高水平,導致果肉褐變嚴重,最后加劇李果實冷害的現(xiàn)象。因此,本試驗說明阻斷乙烯信號降低了李果實的抗冷能力。

SA結(jié)合1-MCP處理李果實在4 ℃低溫貯藏期間冷害發(fā)生率和冷害指數(shù)均顯著(P<0.05)低于對照組和1-MCP處理組,但顯著(P<0.05)高于SA處理組,其處理對李果實抑制冷害現(xiàn)象具有一定的效果。SA結(jié)合1-MCP處理組在貯藏中期抑制POD、PPO等促褐變酶的活性,延緩果肉褐變等冷害現(xiàn)象,同時,在低溫貯藏期間保持較高的SOD、CAT等活性氧清除酶活性,在貯藏前、中期對細胞滲透率和MDA含量增加有顯著抑制作用(P<0.05),其抑制冷害癥狀的效果僅次于SA處理組,有效減少活性氧的積累,降低細胞膜質(zhì)的氧化傷害,延緩李果實冷害的發(fā)生。上述試驗結(jié)果說明,阻斷乙烯信號一定程度上削弱了SA對李果實抗冷性的誘導效應(yīng),但同時SA對果實抗冷信號的調(diào)節(jié)機制中可能也存在不依賴于乙烯信號的通路。李翠丹[9]在研究SA誘導番茄果實抗病機制的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)番茄果實乙烯信號阻斷時削弱了SA誘抗效果,但SA對NO的誘導作用未受到明顯影響,因此,推測不依賴于乙烯信號途徑可能與NO有關(guān)。在SA誘導李果實產(chǎn)生抗冷能力的過程中是否存在相似的機制還有待于進一步研究。

綜上所述,適宜濃度SA處理提高了采后中熟期“布朗”李果實的抗冷能力,該作用與處理維持高水平ROS代謝能力和抑制促褐變活性有關(guān)。乙烯信號參與了這一過程,但同時SA對李果實抗冷能力誘導不完全依賴于乙烯信號的傳遞。