賈金霞,任曉婕,李寶花,王昱灃

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

銅綠菇又名銅綠紅菇、青臉菌、紫菌,是紅菇科、紅菇屬的一種[1],在我國多地均有分布,其子實體一般呈暗銅綠色,形態(tài)表現(xiàn)為中部稍下凹的扁半球形。因其色味鮮美,粗纖維、多糖、蛋白質(zhì)和氨基酸等含量豐富被人們所喜愛[2-4]。

多糖是組成食用菌的一種大分子碳水化合物,在生命過程起著能量和結(jié)構(gòu)物質(zhì)的作用,同時具有多種生物活性,如抗氧化、抗腫瘤、促進(jìn)傷口的愈合作用和免疫刺激活性[5-9]。食用菌多糖具有生物相容性、可生物降解性、無毒和無免疫原性等特點,被廣泛應(yīng)用于在食品、醫(yī)療保健和化妝品行業(yè)[10]。銅綠菇作為一種在我國廣泛分布的藥食同源大型食用菌,具有安全低毒性的特點,研究其富含的菌多糖有利于其藥用價值的推廣[11]。國內(nèi)外研究者對銅綠菇的研究僅集中于探究純培養(yǎng)條件、野生菌種分離以及子實體核糖核酸酶的提取及活性研究[12-14],而在子實體多糖的提取、分離純化、結(jié)構(gòu)性質(zhì)和體外抗氧化活性等方面研究尚未見任何報道。

本研究首次建立新型銅綠菇多糖的制備工藝,初步探索其兩種純化多糖的結(jié)構(gòu)性質(zhì)和抗氧化活性,為銅綠菇及其多糖的進(jìn)一步在食品、藥品及功能性食品中的研究和利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銅綠菇 云南楚雄哀山;DEAE-纖維素-52、Sephadex G-150 索萊寶公司;單糖標(biāo)準(zhǔn)品、菲咯嗪、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) Sigma公司;1-苯基-3甲基-5-吡唑啉酮(PMP) 阿拉丁公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;S-4800酶標(biāo)儀 Thermo公司;HL-2S恒流泵 上海滬西分析儀器有限公司;LC-20AD島津高效色譜儀 島津公司;Nicolet IR200紅外光譜儀 Nicolet公司;SU8010掃描電鏡 日立公司;Dimension Icon原子力顯微鏡 布魯克公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程及銅綠菇多糖得率的測定 根據(jù)文獻(xiàn)[15]并進(jìn)行了適當(dāng)修改,采用水提醇沉法提取粗多糖。將銅綠菇子實體烘干制粉過50目篩后備用。首先取5.0 g菇粉,按料液比1∶20 (g/mL)與蒸餾水混合,在80 ℃的水浴鍋中浸提2 h,浸提結(jié)束后將浸提液以5000 r/min離心10 min,將離心后的上清液濃縮至20.0 mL。加入80.0 mL的95%(v/v)乙醇醇沉10 h,真空抽濾醇液,后依次用無水乙醇、丙酮和無水乙醚洗滌各3次,得到銅綠菇粗多糖(Crude RLP)。銅綠菇多糖的含量測定參考文獻(xiàn)[16],繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=17.96786x-0.01432(R2=0.99396),線性范圍為0～60 μg/mL,并計算銅綠菇多糖得率:

多糖得率(%)=提取的多糖質(zhì)量/銅綠菇菇粉質(zhì)量×100

1.2.2 多糖提取條件的優(yōu)化

1.2.2.1 單因素實驗 按照1.2.1提取多糖,分別研究提取溫度、提取時間和料液比對多糖得率的影響。首先在提取時間和料液比分別為2.0 h和1∶20 g/mL時,研究提取溫度50、60、70、80和90 ℃對多糖得率的影響;然后在料液比和提取溫度分別為1∶20 g/mL和80 ℃時,研究提取時間1.0、2.0、3.0和4.0 h對多糖得率的影響;最后在提取溫度和提取時間分別為80 ℃和2.0 h時,研究料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50 g/mL對多糖的得率的影響。

1.2.2.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計 根據(jù)1.2.2.1的單因素的結(jié)果,應(yīng)用Box-Behnken中心組合設(shè)計,以銅綠菇多糖得率為響應(yīng)值,以提取溫度、提取時間和料液比為自變量,設(shè)計如表1的三因素三水平表并進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels table for Box-Behnken design(BBD)

1.2.3 多糖的分離純化 參考文獻(xiàn)[17]并進(jìn)行適當(dāng)修改,取100 mg的粗多糖(Crude RLP)溶于10.0 mL的去離子水中,糖液離心后取上清液,上樣于裝柱體積為1 BV的DEAE-纖維素-52層析柱(26.0 mm×300.0 mm),依次用去離子水和0.10 mol/L的NaCl洗脫,以1.15 BV/h流速,10 min/管收集。取奇數(shù)管用苯酚硫酸法檢測每管的吸光值A(chǔ)490,繪制A490隨管數(shù)變化洗脫曲線。將不同洗脫液下的收集物分別濃縮、透析除雜和凍干,得到RLP-1和RLP-2兩種初級純化多糖。

參考文獻(xiàn)[18]并作適當(dāng)修改,稱取RLP-1和RLP-2各30.0 mg溶于3.0 mL去離子水中,離心后取上清液,上樣于裝柱體積1 BV的Sephadex G-150層析柱(16.0 mm×300.0 mm);以0.35 BV/h的流速,10 min/管收集。同理繪制洗脫曲線和收集純化組分,得到兩種最終純化產(chǎn)物即RLP-1-1和RLP-2-1。(1 BV=52.0 mL)

1.2.4 相對分子質(zhì)量測定 采用高效凝膠過濾色譜法[19],將葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品和銅綠菇純化多糖樣品分別配制成5.0 mg/mL,過0.45 μm的濾膜,上樣于配備ELSD檢測器和TSK G4000PWXL(7.8 mm×300 mm)柱的LC-20AD 高效液相色譜儀,在柱溫為35 ℃條件下,進(jìn)樣20 μL,用流速0.5 mL/min的去離子水洗脫,以保留時間為橫坐標(biāo),葡聚糖相對分子質(zhì)量的對數(shù)值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,將樣品保留時間帶入計算其相對分子質(zhì)量。

1.2.5 單糖組成測定 HPLC檢測條件:使用的LC-20AD高效液相色譜儀,檢測器為SPD-20A,檢測柱為RP-C18(4.6 mm×250 mm),柱溫條件30 ℃,進(jìn)樣量20 μL,流速1.0 mL/min,流動相為用PBS(0.1 mol/L,pH6.7)和乙腈按83∶17的比例混合的混合液。

參考文獻(xiàn)[18]進(jìn)行PMP衍生,取10種單糖標(biāo)準(zhǔn)品各5.0 mg,將其混合并溶解到1.0 mL去離子水中。取0、12.5、25、50、100 μL的單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合液并補水至100 μL,分別加入100 μL NaOH溶液(0.6 mol/L)均勻混合,取100 μL混合液與100 μL PMP-甲醇溶液(0.5 mol/L)混合,接著在70 ℃的水浴鍋中反應(yīng)100 min。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至常溫,加入100 μL HCl(0.3 mol/L)將其中和,并在50 ℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸干,蒸干后依次加入1.0 mL的去離子水和氯仿,充分混勻以除去PMP,保留水相。水相經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后,上樣于HPLC進(jìn)樣檢測。

參考文獻(xiàn)[18]進(jìn)行多糖的酸水解,將純化多糖配制成5.0 mg/mL,取100 μL糖液加入100 μL TFA(4.0 mol/L),在120 ℃反應(yīng)2 h,冷卻后用甲醇蒸干,并用100 μL去離水復(fù)溶并按上述步驟進(jìn)行PMP衍生和上樣。

1.2.6 紅外光譜 參考文獻(xiàn)[20],將1.0 mg的多糖和100.0 mg溴化鉀研磨充分并壓成薄片,用紅外光譜儀進(jìn)行檢測。

1.2.7 剛果紅實驗 參考文獻(xiàn)[18],將銅綠菇多糖配制成2.0 mg/mL,加入2.0 mL剛果紅試劑(80 μmol/L),將糖液中氫氧化鈉濃度從低到高等梯度增加(0.05～0.50 mol/L),并記錄200～800 nm內(nèi)的最大吸收波長。以剛果紅做空白對照。

1.2.8 掃描電鏡(SEM)和原子力顯微鏡(AFM)形貌觀察實驗 參考文獻(xiàn)[21],銅綠菇多糖配制成4.0 μg/mL,滴在云母片上并晾干,用于SEM(測前需噴金)和AFM觀察。

1.2.9 抗氧化活性實驗

1.2.9.1 DPPH自由基清除活性的測定 參考文獻(xiàn)[22],取0～4.0 mg/mL 間相同濃度梯度的Crude RLP、RLP-1-1、RLP-2-1和VC(陽性對照)各50 μL于96孔板,依次加入25 μL DPPH乙醇溶液(0.4 mmol/L)和100 μL超純水,混勻,室溫避光反應(yīng)20 min,在517 nm測OD值為A1,以超純水代替樣品為空白組,其OD值記為A0;無水乙醇代替DPPH為干擾組,其OD值記為A2;清除率計算公式:

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]

1.2.9.2 金屬離子螯合能力的測定 參考文獻(xiàn)[23],取0～4.0 mg/mL 間相同濃度梯度的Crude RLP、RLP-1-1、RLP-2-1和EDTA-2Na(陽性對照)各50 μL于96孔板,依次加入2.5 μL FeCl2(2.0 mmol/L)、10 μL菲咯嗪溶液(5.0 mmol/L)和137 μL蒸餾水,混勻,室溫反應(yīng)10 min于562 nm測OD值為A1;以蒸餾水代替樣品為對照組,其OD值記為A0;以蒸餾水代替FeCl2溶液為干擾組,其OD值為A2;螯合率計算公式:

金屬離子螯合率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

提取溫度對多糖得率的影響如圖1a,多糖得率隨提取溫度的升高而升高后趨于平緩。提取溫度為80和90 ℃的得率無顯著性差異(P>0.05),但50、60和70 ℃的存在顯著性差異(P<0.05),從能耗考慮[24],選取80 ℃為較適提取溫度。

提取時間對多糖得率的影響如圖1b,隨著提取時間的增加,銅綠菇多糖得率呈現(xiàn)先增加后減小,提取時間對得率影響顯著(P<0.05)。其中提取時間為2 h時,多糖的得率高達(dá)3.85%,而2.0 h后得率反而下降。隨著提取時間的延長,多糖擴(kuò)散到溶劑中并溶解的量雖有所增加,然而多糖降解導(dǎo)致的損失更明顯,表現(xiàn)為得率的下降[25]。因此選取2.0 h為較適提取時間。

料液比對多糖得率的影響,由圖1c可知,隨著料液比的增加,多糖得率呈現(xiàn)先增加后減小,而后趨于穩(wěn)定的趨勢。水料比為1∶10和1∶20 g/mL時,兩者的得率存在顯著性差異(P<0.05),而1∶20～1∶50 g/mL時得率無顯著性差異(P>0.05)。原料與水的比例增加,可使細(xì)胞中的多糖釋放增加,但也會造成多糖因吸熱的不均勻致使其溶解性下降[26],因此選取1∶20 g/mL為較適提取料液比。

圖1 不同提取因素對銅綠菇多糖得率的影響Fig.1 Effects of different extraction factors on the yield of polysaccharides from Russula aeruginea Lindb.:Fr

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析

響應(yīng)面實驗的結(jié)果如表2所示,所得銅綠菇多糖得率的回歸方程:

Y=3.98+0.21A+0.20B+0.016C+0.047AB-0.090AC+0.017BC-0.18A2-0.28B2-0.19C2

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 The experiment design and results of Box-Behnken

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

銅綠菇多糖最佳提取工藝條件是83.78 ℃,2.62 h,1∶22.67 g/mL,得率為4.04%。為提高實驗的操作性,選取溫度、時間和液料比分別為84 ℃、2.6 h和1∶23 g/mL進(jìn)行驗證實驗,得率為4.30%與理論值僅相差0.26%,進(jìn)一步驗證了該模型的可預(yù)測性。

2.3 銅綠菇多糖的分離純化

由圖2可知,銅綠菇粗多糖經(jīng)DEAE-纖維素-52純化獲得兩個獨立的洗脫峰,收集組分分別命名為RLP-1和RLP-2,進(jìn)一步經(jīng)Sephadex G-150層析柱純化后(圖3所示),分別收集得到峰形更加對稱的RLP-1-1、RLP-2-1組分,表明兩組分的純度較高。

圖2 銅綠菇多糖DEAE-纖維素-52梯度洗脫曲線Fig.2 DEAE-cellulose-52 gradient elution curve of polysaccharides from Russula aeruginea Lindb.:Fr

圖3 銅綠菇多糖的Sephadex G-150的洗脫曲線Fig.3 Sephadex G-150 elution curve of polysaccharides from Russula aeruginea Lindb.:Fr注:a:RLP-1-1的洗脫曲線,b:RLP-2-1的洗脫曲線。

2.4 銅綠菇多糖的結(jié)構(gòu)性質(zhì)

上述兩種銅綠菇多糖的相對分子量測定結(jié)果(如圖4所示),RLP-1-1和RLP-2-1均呈現(xiàn)單一對稱峰,進(jìn)而驗證其純度較高。RLP-1-1和RLP-2-1保留時間分別為17.85和9.95 min,計算可得兩種純化多糖的分子量分別18.05、2398.83 kDa。

圖4 高效液相色譜圖Fig.4 High performance liquid chromatography注:a:RLP-1-1的高效液相色譜圖, b:RLP-2-1的高效液相色譜圖。

上述兩種銅綠菇多糖的單糖組成測定結(jié)果(如圖5所示),圖a、b和c分別表示單糖標(biāo)準(zhǔn)品、純化多糖RLP-1-1和RLP-2-1的HPLC圖。a圖中峰1～10依次為甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖。圖b為純化多糖RLP-1-1的HPLC圖,由圖可知該多糖由三種多糖組成,即葡萄糖、半乳糖和巖藻糖組成,各單糖物質(zhì)的量百分比分別為:為5.35%,67.02%和27.63%。圖c為純化多糖RLP-2-1的HPLC圖,由圖可知RLP-2-1只由葡萄糖組成。

圖5 高效液相色譜圖Fig.5 High performance liquid chromatography注:a:單糖標(biāo)準(zhǔn)品,b:RLP-1-1,c:RLP-2-1。

銅綠菇多糖的紅外光譜圖如圖6所示,RLP-1-1和RLP-2-1具有3400和2926 cm-1多糖特征吸收峰[27];此外二者在1643 cm-1處具有C=O非對稱性伸縮振動所引起的特征峰,表明它們均含有酰胺鍵[28];1355和1250 cm-1處的吸收峰代表兩者含有硫酸基基團(tuán)[29];1150和1080 cm-1的特征峰表明它們具有C-OH和C-O-C的結(jié)構(gòu);RLP-1-1在932 cm-1有吸收峰表明其具有3,6-內(nèi)醚半乳糖,而RLP-2-1不具有[30]。

圖6 RLP-1-1和RLP-2-1紅外譜圖Fig.6 FT-IR spectra of RLP-1-1 and RLP-2-1

剛果紅實驗結(jié)果如圖7所示,剛果紅可與具有三股螺旋的多糖絡(luò)合,表現(xiàn)為其最大吸收波長(λmax)的增大,λmax與多糖-剛果紅溶液的NaOH濃度呈負(fù)相關(guān),原理是高濃度NaOH可解開剛果紅與三股螺旋多糖的絡(luò)合并降低λmax。RLP-2-1的λmax先增加后減小,說明其可能含有三股螺旋。RLP-1-1的λmax一直呈減小趨勢,說明其不含三股螺旋結(jié)構(gòu)[31]。研究表明三股螺旋結(jié)構(gòu)與其生物活性有關(guān),如三股螺旋結(jié)構(gòu)的香菇多糖同時具有較高的抗腫瘤活性,而破壞其三股螺旋結(jié)構(gòu)后,抗腫瘤活性明顯降低[32]。茯苓多糖通常不具有抗腫瘤活性,采用化學(xué)手段使其形成三股螺旋后可獲得抗腫瘤活性[33]。由此可推測具有三股螺旋的RLP-2-1可能具有較高的抗腫瘤活性,今后應(yīng)對其進(jìn)行抗腫瘤活性的研究,為銅綠菇多糖的在抗腫瘤藥物的開發(fā)提供科學(xué)支持。

圖7 NaOH濃度對多糖波長的影響Fig.7 Effect of NaOH concentration on polysaccharide wavelength

RLP-1-1的SEM如圖8(a和b),10 μm的結(jié)果(圖8a)表明多糖呈緊密的微觀顆粒狀,表面光滑且相對平整,邊緣凹凸不平,顆粒的大小厚度各異,雜亂的附著堆積。20 μm的結(jié)果(圖8b)多糖分子呈分散的小顆粒,這說明多糖分子主要呈現(xiàn)的是相互斥力,而吸引力較小[29]。RLP-2-1的SEM如圖8(c和d),10 μm的結(jié)果(圖8c)和50 μm的結(jié)果(圖8d)的結(jié)果類似,多糖均呈厚度不一薄片堆積的形貌,表面伴有許多裂紋,糖分子形成的羽狀結(jié)構(gòu)表明排斥力較弱,存在較強(qiáng)相互作用力,多糖分子可能存在螺旋結(jié)構(gòu)[34]。

圖8 銅綠菇多糖的電鏡掃描圖Fig.8 The SEM picture of Russula aeruginea Lindb.:Fr注:a,b:RLP-1-1的SEM,c,d:RLP-2-1的SEM。

RLP-1-1的AFM的平面圖如圖9a所示,400 nm呈大小均勻的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),表明多糖的純度很高,鏈長約為1.1～1.2 nm。RLP-2-1的AFM的平面圖如圖9b所示,多糖呈現(xiàn)較為明顯的纖維狀結(jié)構(gòu),鏈長約為1.9～2.1 nm。而通常多糖分子鏈一般為0.1～1 nm,RLP-1-1和RLP-2-1鏈長均大于1 nm,這表明多糖都呈現(xiàn)多個糖分子的聚合狀態(tài)[35]。結(jié)合剛果紅和掃描電鏡的結(jié)果分析,RLP-2-1存在三股螺旋結(jié)構(gòu)。

圖9 銅綠菇多糖的原子力顯微鏡Fig.9 The AFM picture of Russula aeruginea Lindb.:Fr注:a:RLP-1-1的AFM,b:RLP-2-1的AFM。

2.5 銅綠菇多糖的抗氧化活性

銅綠菇多糖的DPPH自由基清除率和金屬離子螯合率的結(jié)果如圖10所示。

圖10 銅綠菇多糖抗氧化活性Fig.10 Antioxidant activity of polysaccharides from Russula aeruginea Lindb.:Fr注:a:DPPH自由基清除率,b:金屬離子螯合率。

DPPH自由基清除率的實驗的結(jié)果如圖10a,由圖可知RLP-1-1和RLP-2-1對DPPH自由基的清除能力相差不大,且兩者清除該自由基的清除率要弱于粗提物。在0～4.0 mg/mL多糖范圍內(nèi),隨著各組分多糖濃度的增加,而各組分清除能力有所增加。在濃度為4.0 mg/mL時,Crude RLP、RLP-1-1和RLP-2-1的DPPH自由基清除率分別為41.19%、38.97%和39.27%。由于RLP-2-1分子量過大且空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜,在體外DPPH抗氧化模型中表現(xiàn)不佳,在未來的研究中可采用化學(xué)方法對其進(jìn)行修飾得到活性更高的多糖衍生物。阿魏菇兩種水溶性多糖的清除率分別為62.0%和49.8%[36],而羊肚菌多糖的清除率32.42%[37],銅綠菇多糖的清除能力介于阿魏菇多糖和羊肚菌多糖之間,銅綠菇多糖可作為抗氧化劑良好來源。

金屬離子螯合率實驗的結(jié)果如圖10b,由圖可知,RLP-2-1的金屬離子螯合率高于RLP-1-1和粗提物。在0～4.0 mg/mL多糖范圍內(nèi),隨著各組分多糖濃度的增加,而各組分的金屬離子螯合率有所增加。在濃度為4.0 mg/mL時,Crude RLP、RLP-1-1和RLP-2-1的金屬離子螯合率分別為29.83%、27.81%和51.96%。羊肚菌多糖金屬離子螯合率為27.83%[37],紫丁香蘑多糖的金屬離子螯合率為70.09%[38],可見銅綠菇多糖的金屬離子螯合能力介于羊肚菌多糖和紫丁香蘑多糖之間,銅綠菇多糖可作為抗氧化劑良好來源用于食品藥品中。

3 結(jié)果與討論

本研究采用單因素實驗結(jié)合響應(yīng)面實驗建立了銅綠菇多糖的水提醇沉工藝,當(dāng)提取溫度為84 ℃,提取時間為2.6 h,料液比為1∶23 g/mL時,多糖的提取率為4.30%。并利用DEAE-纖維素-52和Sephadex G-150分離純化得到兩種分子量分別為18.05 kDa和2398.83 kDa水溶性多糖。RLP-1-1的葡萄糖、半乳糖和巖藻糖等三種單糖的摩爾百分含量分別為5.35%、67.02%和27.63%,而RLP-2-1僅由葡萄糖組成,它們均具有多糖的典型官能團(tuán),其中一種多糖具有三股螺旋,兩種水溶性多糖均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。在未來研究中,我們擬進(jìn)一步研究其體外細(xì)胞抗氧化活性、體外細(xì)胞和動物體內(nèi)的免疫活性和抗腫瘤活性等,從而為推廣銅綠菇食用菌資源的利用和其多糖的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

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