(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所,天津 300191)

聚蘋果酸(Polymalic acid,PMLA)是聚酯類聚合物,是一種新的天然的生物多聚物,不同于其他天然多聚物,聚蘋果酸分子中有許多自由羧基,這些自由羧基使它具有了許多特別的性質(zhì),如水溶性[1]、易修飾性[2]、易代謝性[3]和可降解性[4]等。由于它具有這些特性,人們正在嘗試用聚蘋果酸制造藥物載體(Drug delibery system)或作為原生藥物(Pro-drug),將來還可發(fā)展用在生物醫(yī)學(xué)材料[5]、包裝材料、微膠囊材料、吸水物質(zhì)、化妝品以及作為某些微生物DNA聚合酶的抑制劑等,應(yīng)用范圍很廣,并具有很大的市場潛力[6-9]。聚蘋果酸有三種結(jié)構(gòu)分別為α、β、γ型[10],如圖1所示。目前在自然界生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的天然的聚蘋果酸主要是β-聚蘋果酸,它具有良好的生物相容性,也是當(dāng)今的熱點研究問題[11-13]。目前,國內(nèi)外主要是以化學(xué)合成法制備聚蘋果酸為主,因其分子量小在應(yīng)用方面受到限制,生物合成制備β-聚蘋果酸成為現(xiàn)今研究的熱點[14]。由于聚蘋果酸帶有一個羧基側(cè)鏈,可以通過化學(xué)改性和其他手段得到帶有特殊作用的衍生物,因此被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥等領(lǐng)域[15-16]。

圖1 聚蘋果酸的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of PLMA

聚蘋果酸最初是1969年由Shimada等人從環(huán)狀青霉(Penicilliumcyclopium)中分離得到[17]。之后,先后從PHysarumpolycepHalum、Aureobasidumsp.中發(fā)現(xiàn)并提取出聚蘋果酸。有相關(guān)文章闡明了聚蘋果酸在出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)[18]和多頭絨泡菌(PHysarumpolycepHalum)[19]中的合成途徑和調(diào)節(jié)機制。Holler等[20]通過追蹤13C的方法闡明了聚蘋果酸在多頭絨泡菌細胞內(nèi)的合成途徑。劉雙江等[16]提出,出芽短梗霉合成聚蘋果酸的途徑與多頭絨泡菌相似。在兩種真菌中,三氟乙酸會抑制聚蘋果酸的合成,而琥珀酸和蘋果酸,可以解除三氟乙酸的抑制作用;此外,丙二酸(琥珀酸脫氫酶的抑制劑)可以誘導(dǎo)開啟乙醛酸支路,以作為聚蘋果酸合成的替代途徑[21]。

在發(fā)酵過程優(yōu)化方面,中國科學(xué)院過程工程研究所的萬印華等公開了利用A.pullulansipe-1發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的新工藝[22],使用有機氮和無機氮復(fù)合培養(yǎng)基,并在發(fā)酵過程中控制溶氧和pH,于7 L發(fā)酵罐中發(fā)酵4 d,得到β-聚蘋果酸濃度為35.2 g/L的發(fā)酵液。該研究組還研究了A.pullulansipe-1合成聚蘋果酸和菌體生長的關(guān)系。他們認為對數(shù)生長期晚期菌體的生長和聚蘋果酸的合成無關(guān),高濃度的聚蘋果酸和培養(yǎng)基中較低的還原力抑制了菌體的生長。重復(fù)分批發(fā)酵(Repeated-batch fermetation)和細胞再循環(huán)發(fā)酵(Cell-recycle fermetation)或在兩種發(fā)酵過程中維持培養(yǎng)基氧化還原電位(ORP)低于70 mV,均能提高聚蘋果酸的產(chǎn)率?？刂芆RP的重復(fù)分批發(fā)酵中,聚蘋果酸的產(chǎn)量和細胞的生長分別提高了21.2%和11.7%;控制ORP的細胞在循環(huán)發(fā)酵中,每單位葡萄糖合成聚蘋果酸的產(chǎn)量提高了33.2%。

從二十世紀六十年代開始,就有人開始聚蘋果酸的研究了,國外已經(jīng)實現(xiàn)了聚蘋果酸的產(chǎn)業(yè)化,而國內(nèi)還沒有可以規(guī)模生產(chǎn)的廠家,特別是微生物發(fā)酵聚蘋果酸的產(chǎn)量不高[23]。本文旨在研究出芽短梗霉生物合成聚蘋果酸的工藝條件,擬對影響聚蘋果酸產(chǎn)量的因素,如培養(yǎng)基成分、發(fā)酵工藝條件、后提取方法等進行研究,獲得優(yōu)化的聚蘋果酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝條件,為放大發(fā)酵試驗提供依據(jù)。在提純方面也做了一定工作,提高了菌株產(chǎn)量,降低生產(chǎn)成本,簡化生產(chǎn)工序,為大規(guī)模生產(chǎn)聚蘋果酸奠定基礎(chǔ),使聚蘋果酸在不久的將來能廣泛應(yīng)用于我國各行業(yè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本試驗采用的是實驗室誘變菌株出芽短梗霉CV26作為出發(fā)菌株；無水葡萄糖、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、玉米漿粉、丁二酸銨、丁二酸、硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)、碳酸鈣(CaCO3)、氫氧化鈉(NaOH)、氯化鈉(NaCl)、曲拉通、無水甲醇、無水乙醇、瓊脂等，均為分析純,天津市化學(xué)試劑三廠;丙酮 分析純,天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠。

SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;ZWY-1102恒溫搖床 上海智誠儀器制品有限公司;SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;DF-100A分析天平 唐山光電儀器有限公司;JA12002型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;LD5-2A離心機 北京醫(yī)用離心機廠;pHSJ-4A型試驗pH計 上?？茖W(xué)儀器有限公司;CX21FS1生物顯微鏡 日本OLYMPUS會社;LS-B50L壓力蒸汽滅菌鍋 上海醫(yī)用核子儀器廠;SBA-40C生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所;BIOF-2000 5L自控發(fā)酵罐 上海高機實業(yè)有限公司;Dionex UltiMate 3000安捷倫高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子培養(yǎng)液的制備 斜面培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基,200 g/L土豆,20 g/L葡萄糖,20 g/L瓊脂,pH5.6。

液體種子培養(yǎng)基:80 g/L葡萄糖,4 g/L KH2PO4,3 g/L丁二酸銨,1 g/L丁二酸,1 g/L MgSO4·7H2O,0.07 g/L ZnSO4·7H2O,3 g/L玉米漿粉,30 g/L CaCO3(單獨滅菌),調(diào)節(jié)pH至5.0,1×105Pa滅菌15 min。250 mL三角瓶裝培養(yǎng)基50 mL。

于斜面上取一環(huán)菌種到搖瓶種子培養(yǎng)基中,25 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h,得到種子培養(yǎng)液。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)條件 發(fā)酵培養(yǎng)基:120 g/L葡萄糖,3 g/L丁二酸銨,2 g/L丁二酸,1 g/L MgSO4·7H2O,0.05 g/L ZnSO4·7H2O,4 g/L玉米漿粉;30 g/L CaCO3(單獨滅菌),調(diào)節(jié)pH至6.0,1×105Pa滅菌15 min。250 mL三角瓶裝培養(yǎng)液50 mL,或5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)液3 L。

將種子培養(yǎng)液按8%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,25 ℃培養(yǎng)48～72 h結(jié)束。

1.2.3 種子培養(yǎng)基正交試驗 根據(jù)種子培養(yǎng)基的各成分及添加量的單因素預(yù)試驗,設(shè)計9因素4水平的正交試驗,按照1.2.1和1.2.2的條件,將不同種子培養(yǎng)基培養(yǎng)的種子培養(yǎng)液,以相同的接種量接入相同的發(fā)酵培養(yǎng)基中,進行聚蘋果酸搖瓶發(fā)酵試驗,以聚蘋果酸的產(chǎn)量為評價指標(biāo),考察最佳的種子培養(yǎng)條件,如表1所示。

表1 L32(49)正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of L32(49)orthogonal experiment

1.2.4 發(fā)酵生長曲線 將1.2.1中的種子培養(yǎng)液按照8%的比例接入13瓶裝有50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,并標(biāo)號0#～12#,每隔2 h取出一瓶培養(yǎng)液,比濁法測其細胞濃度[24]。取出1 mL菌液,5000 r/min離心5 min,棄去上清液,加入4 mL或5 mL蒸餾水使細胞重新懸浮,以蒸餾水為空白,測其在620 nm的OD值。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),繪制生長曲線[25]。

1.2.5 曲拉通添加濃度對聚蘋果酸發(fā)酵的影響 按照方法1.2.1和1.2.2,進行聚蘋果酸搖瓶發(fā)酵試驗。發(fā)酵24 h后分別添加不同體積的0.05 mol/L曲拉通母液,使各發(fā)酵培養(yǎng)基中曲拉通濃度為0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L,在整個發(fā)酵過程進行到72 h后,測其聚蘋果酸產(chǎn)量和葡萄糖含量。

1.2.6 曲拉通添加時間對聚蘋果酸發(fā)酵的影響 按照方法1.2.1和1.2.2,進行聚蘋果酸搖瓶發(fā)酵試驗。分別在發(fā)酵進行到0、6、12、18、24、30、36 h時,添加0.4 mmol/L的曲拉通,72 h發(fā)酵結(jié)束后,測其聚蘋果酸產(chǎn)量和葡萄糖含量。

1.2.7 5 L發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速對聚蘋果酸發(fā)酵的影響 5 L發(fā)酵罐的裝液量為3 L,通氣量為5 L/min,pH4.5,溫度25 ℃,轉(zhuǎn)速分別為400、450、500、550、600 r/min,在發(fā)酵進行到24 h時加入24 mL 0.05 mol/L的曲拉通母液,以葡萄糖含量不再下降為發(fā)酵終點,測其聚蘋果酸產(chǎn)量和葡萄糖含量,并記錄發(fā)酵結(jié)束時間。

1.2.8 5 L發(fā)酵罐的通氣量對聚蘋果酸發(fā)酵的影響 在確定轉(zhuǎn)速為500 r/min的前提下,通氣量分別設(shè)定在3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 L/min,pH4.5,溫度25 ℃,在發(fā)酵進行到24 h時加入24 mL 0.05 mol/L的曲拉通母液,同樣以葡萄糖含量不再下降為發(fā)酵終點,測其聚蘋果酸產(chǎn)量和葡萄糖含量,并記錄發(fā)酵結(jié)束時間。

1.2.9 5 L發(fā)酵罐的pH對聚蘋果酸發(fā)酵的影響 按照氣量為5 L/min、轉(zhuǎn)速為500 r/min的條件,將溫度控制在25 ℃進行發(fā)酵試驗,在發(fā)酵24 h后,加入24 mL 0.05 mol/L的曲拉通母液,同時連動5%的NaOH補料瓶和5%的硫酸補料瓶,自動控制pH在3.5、4、4.5、5,并從24 h開始每隔10 h取樣測聚蘋果酸產(chǎn)量,發(fā)酵共進行84 h。

1.2.10 割罐法發(fā)酵的試驗方法 按照通氣量為5 L/min、轉(zhuǎn)速為500 r/min、pH4.5的條件,將溫度控制在25 ℃進行發(fā)酵試驗,在發(fā)酵進行到24 h時加入24 mL 0.05 mol/L的曲拉通母液。當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖含量低于10 g/L的時候,將發(fā)酵液排出2 L,再將2 L滅過菌的發(fā)酵培養(yǎng)基補入發(fā)酵罐中繼續(xù)發(fā)酵70 h,補料后每間隔10 h測量一次聚蘋果酸產(chǎn)量和葡萄糖含量。其中補入的發(fā)酵培養(yǎng)基中,碳氮源的濃度分別取初始發(fā)酵培養(yǎng)基的40%、60%、80%和100%。

1.2.11 不同有機溶劑對聚蘋果酸提取效果的影響 發(fā)酵液絮凝方法:將100 mL濃度為5%的聚氯化鋁溶液加入1000 mL發(fā)酵液中,攪拌均勻,用10% NaOH將pH調(diào)至7.0,6000 r/min離心5 min取上清液待測。

10 mL同一批次絮凝后離心的發(fā)酵液于100 mL燒杯中,分別加入40 mL甲醇、乙醇、丙酮攪拌后放入4 ℃冰箱靜置2 h,倒掉上清液將沉淀溶于10 mL水中測其聚蘋果酸含量。

1.2.12 去除副產(chǎn)物普魯蘭的試驗方法 取100 mL同一批次絮凝離心后的發(fā)酵液6份,測出其中普魯蘭多糖的含量,分別添加2、6、10、14、18、22 mL的甲醇,測其析出的沉淀中普魯蘭和聚蘋果酸的含量。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 葡萄糖產(chǎn)量測定 將絮凝離心后的發(fā)酵液,稀釋100倍,用生物傳感分析儀直接測定。此方法簡單快捷,偏于抓住最佳補料時機。

1.3.2 普魯蘭含量的測定 1 mL待測液體3000 r/min離心2 min,取上清液0.15 mL并加入一定體積的甲醇,混勻、離心(1300 r/min,5 min),70 ℃蒸發(fā)掉殘余甲醇,加入0.15 mL水溶解沉淀物,轉(zhuǎn)移到裝有2 mL、0.11 mol/L乙酸鈉緩沖液(pH4.5)的試管中,加入1 mL淀粉葡萄糖苷酶和普魯蘭酶混合液(活力分別為2515和415 U/mL),37 ℃水解過夜。用高效液相色譜測定葡萄糖含量。選用氨基酸柱(4.6 mm×250 mm),示差折光檢測器,流動相為乙腈和水(體積比75∶25),流速為1.0 mL/min,柱溫40 ℃[26]。用同樣方法處理普魯蘭標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma,USA)做參照物。此方法比生物傳感分析儀測量的更精確。

1.3.3 聚蘋果酸含量的檢測 將絮凝離心后的發(fā)酵液,用高效液相色譜法,選用C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,4 μm),流動相為乙腈和0.025 mol/L的KH2PO4混合溶液(用磷酸調(diào)pH至2.5)(體積比=5∶9),流速為1.0 mL/min,檢測波長為210 nm,柱溫為25 ℃[27-28]。用同樣方法處理聚蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma,USA)做參照物。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用正交設(shè)計助手II V3.1專業(yè)版對正交試驗結(jié)果進行極差分析和方差分析,用SPSS 21.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析,采用單因素方差分析中的Duncan’s檢驗,差異顯著性水平設(shè)為P=0.05。每個試驗三次平行,結(jié)果圖表用Microsoft Excel繪制,數(shù)據(jù)顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 種子培養(yǎng)的正交試驗結(jié)果

按照1.2.3中表1設(shè)計的正交試驗進行搖瓶驗證試驗,得到的最后結(jié)果,見表2、表3。

由表2可知,通過極差分析得到,種子培養(yǎng)條件的主次因素順序依次為:玉米漿粉>磷酸二氫鉀>丁二酸銨>碳酸鈣>轉(zhuǎn)速>葡萄糖>丁二酸>硫酸鋅>硫酸鎂,由表3可知,玉米漿粉、磷酸氫二鉀、丁二酸銨的添加量對試驗結(jié)果有顯著性影響。因此得到的最佳組合為A4B1C3D3E1F3G4H3I1,正交試驗表中得到聚蘋果酸產(chǎn)量最高的25號試驗組合為A3B1C3D3E1F2G4H4I2,分別按照這兩組條件做對照試驗,得到的結(jié)果為25號正交試驗的聚蘋果酸產(chǎn)量為52.7 g/L,極差分析得到的最佳組合聚蘋果酸產(chǎn)量為49.29 g/L,因此選擇25號試驗的組合為最終的種子培養(yǎng)條件。

表3 正交結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

由表3可知,玉米漿粉、磷酸氫二鉀、丁二酸銨的添加量對聚蘋果酸產(chǎn)量有顯著性影響,主次順序為玉米漿粉>磷酸氫二鉀>丁二酸銨,其余因素對聚蘋果酸產(chǎn)量的影響均未到達顯著程度。

2.2 發(fā)酵生長曲線

按照方法1.2.4繪制發(fā)酵生長曲線,結(jié)果見圖2。

圖2 發(fā)酵生長曲線Fig.2 Fermentation growth curve

由圖2可知,發(fā)酵2 h,菌株進入對數(shù)生長期;發(fā)酵24～34 h,菌體生長速度減慢進入內(nèi)源呼吸階段。

2.3 加入不同濃度曲拉通后聚蘋果酸的產(chǎn)量

曲拉通是一種表面活性劑,它可以有效的提高發(fā)酵液里的溶氧,增加細胞的通透性,使胞內(nèi)產(chǎn)生的聚蘋果酸可以迅速的輸送到細胞外,從而提高菌株的生產(chǎn)效率,縮短發(fā)酵時間。但是曲拉通有一定的毒性,添加少了達不到效果,添加多了會使菌株中毒,影響發(fā)酵產(chǎn)量[29]。根據(jù)2.3的試驗結(jié)果,為了減小曲拉通對菌體生物量的影響,先選擇在發(fā)酵24 h后加入適量濃度的曲拉通,以研究發(fā)酵過程中添加不同濃度的曲拉通對聚蘋果酸生成量的影響。確定最適添加量后,再以固定的添加量進行添加曲拉通的最佳時機的試驗。按照方法1.2.5,進行聚蘋果酸搖瓶發(fā)酵試驗,其結(jié)果如圖3所示。

圖3 曲拉通添加量對聚蘋果酸產(chǎn)量和葡萄糖含量的影響Fig.3 Effect of Triton addition on PLMA production and glucose content注:小寫字母a、b、c代表聚蘋果酸含量的差異顯著(P<0.05),大寫字母A、B、C代表葡萄糖含量的差異顯著(P<0.05)。

由圖3可知,少量添加曲拉通,可以增強細胞的通透性,利于微生物將胞內(nèi)產(chǎn)生的聚蘋果酸分泌至胞外,從而提高產(chǎn)量。但是由于曲拉通會對微生物的生物活性帶來一定的傷害,因此當(dāng)曲拉通的添加量達到一定程度的時候,就會導(dǎo)致微生物活性下降,部分微生物死亡,從而降低聚蘋果酸的產(chǎn)量。由圖中可以看到,葡萄糖的含量與聚蘋果酸的關(guān)系,聚蘋果酸產(chǎn)量越高,則葡萄糖含量越低,這是由于微生物在良好的生長環(huán)境下,將更多的葡萄糖轉(zhuǎn)化成了聚蘋果酸。由本試驗得知曲拉通的最適添加量為0.4 mmol/L,在此條件下的聚蘋果酸產(chǎn)量顯著(P<0.05)優(yōu)于其他水平,并且此時的葡萄糖含量顯著(P<0.05)低于其他水平。

2.4 曲拉通添加時機對聚蘋果酸產(chǎn)量的影響

由2.3的試驗結(jié)果得到曲拉通的最適添加量為0.4 mmol/L,按照方法1.2.6,進行聚蘋果酸搖瓶發(fā)酵試驗,結(jié)果如圖4所示。

圖4 曲拉通添加時間對聚蘋果酸產(chǎn)量和剩余葡萄糖含量的影響Fig.4 Effect of Triton adding time on PLMA production and glucose content注:小寫字母a、b、c代表聚蘋果酸含量的差異顯著(P<0.05),大寫字母A、B、C代表葡萄糖含量的差異顯著(P<0.05)。

曲拉通對于微生物具有一定的毒性,由圖4可知,若添加過早會影響微生物的正常生長,葡萄糖消耗不下去,產(chǎn)量也不高。若添加時間過晚,則起不到提高產(chǎn)量的作用。而在發(fā)酵進行到24 h時添加曲拉通,參考之前2.2的生長曲線,此時微生物生長進入內(nèi)源呼吸階段,菌體生長穩(wěn)定,加入的曲拉通起到表面活性劑的作用,降低了發(fā)酵液的粘度,提高了發(fā)酵液中的溶氧,并改善了細胞的通透性,使得聚蘋果酸的產(chǎn)量最高,葡萄糖含量也最低,與其他時間添加的結(jié)果存在顯著(P<0.05)差異。

2.5 5 L發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速試驗

按照方法1.2.7,進行聚蘋果酸5 L發(fā)酵罐發(fā)酵試驗,結(jié)果見表4。

表4 轉(zhuǎn)速對發(fā)酵的影響Table 4 Effect of rotation speed on fermentation

注:上標(biāo)小寫字母a、b、c代表每列數(shù)據(jù)之間的差異顯著(P<0.05)。 由表4可以看出,當(dāng)轉(zhuǎn)速為600和550 r/min,葡萄糖幾乎全部耗盡,但是聚蘋果酸的產(chǎn)量卻不是最高的,且由于剪切力過高導(dǎo)致聚蘋果酸分子量變小,發(fā)酵液粘度明顯下降,菌體生長過快提前進入衰退期。而400和450 r/min由于溶氧低,不利于葡萄糖的利用。當(dāng)轉(zhuǎn)速為500 r/min時,聚蘋果酸的產(chǎn)量最高,雖然相較于450和550 r/min條件下的產(chǎn)量,差異不顯著(P>0.05),但此時發(fā)酵周期顯著(P<0.05)低于450 r/min;與550 r/min條件下的發(fā)酵結(jié)果相比雖然差異不顯著(P>0.05),但能耗低。因此綜合能耗和產(chǎn)出考慮,選擇500 r/min 為5 L小罐的最適轉(zhuǎn)速。

2.6 5 L發(fā)酵罐的通氣量試驗

發(fā)酵中除轉(zhuǎn)速影響溶氧外,通氣量也是重要因素之一。按照方法1.2.8進行聚蘋果酸通氣量的發(fā)酵試驗,結(jié)果見表5。

表5 通氣量對發(fā)酵結(jié)果的影響Table 5 Effect of Ventilation volume on fermentation

注:上標(biāo)小寫字母a、b、c代表每列數(shù)據(jù)之間的差異顯著(P<0.05)。

由表5可知,通氣量低的微生物代謝速度慢,耗糖慢,時間長,聚蘋果酸產(chǎn)量也低。通氣量為5.0、6.0和5.5 L/min時,聚蘋果酸產(chǎn)量和葡萄糖含量沒有顯著性差異(P>0.05),但是從發(fā)酵總時長來看,通氣量為5.5和6.0 L/min時,發(fā)酵時間與其他水平存在顯著(P<0.05)差異。因此就能耗上考慮,選擇5.5 L/min的通氣量最適合。

2.7 5 L小罐pH的控制

按照方法1.2.9進行發(fā)酵試驗,結(jié)果如圖5。

圖5 發(fā)酵中控制pH對聚蘋果酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of pH controlling on PLMA production

由圖5可知,若控制發(fā)酵中的pH在4.5,聚蘋果酸產(chǎn)量最高,發(fā)酵結(jié)束的時間最短,故選擇4.5作為發(fā)酵中期最適的pH。

2.8 割罐法發(fā)酵試驗

采用上述試驗得到的最佳方案,按照方法1.2.10,在5 L發(fā)酵罐上進行聚蘋果酸發(fā)酵試驗,結(jié)果如圖6所示。

圖6 補料后的聚蘋果酸產(chǎn)量和葡萄糖含量Fig.6 PLMA production and glucose content after supplementation of medium注:a:100%的碳源和氮源條件下的葡萄糖;b:80%的碳源和氮源條件下的葡萄糖;c:60%的碳源和氮源條件下的葡萄糖;d:40%的碳源和氮源條件下的葡萄糖;e:100%的碳源和氮源條件下的聚蘋果酸產(chǎn)量;f:80%的碳源和氮源條件下的聚蘋果酸產(chǎn)量;g:60%的碳源和氮源條件下的聚蘋果酸產(chǎn)量;h:40%的碳源和氮源條件下的聚蘋果酸產(chǎn)量。

由圖6可知,培養(yǎng)基中葡萄糖含量過高,對微生物生長反而有抑制作用,導(dǎo)致產(chǎn)量不高,且剩余葡萄糖含量過高又利用不掉,造成成本的浪費;而葡萄糖量太低又不能為微生物生長產(chǎn)聚蘋果酸提供足夠的養(yǎng)分,從而產(chǎn)量不高,且當(dāng)葡萄糖耗盡后,微生物會分解聚蘋果酸來滿足生長需求;因此綜合發(fā)酵周期、聚蘋果酸的產(chǎn)量和成本考慮,加入培養(yǎng)基的碳氮源為初始培養(yǎng)基的60%最為合適,整個發(fā)酵周期124 h,得到聚蘋果酸總量318 g。

2.9 聚蘋果酸的后提取

2.9.1 不同有機溶劑對聚蘋果酸沉淀的影響 不同的有機溶劑對于聚蘋果酸的沉淀效果不同,試驗中對甲醇、乙醇、丙酮對聚蘋果酸的沉淀效果進行了比較。按照方法1.2.11進行試驗,結(jié)果如圖7所示。

圖7 不同有機溶劑的沉淀效果Fig.7 Sedimentation effect of different organic solvents注:小寫字母a、b、c代表沉淀中聚蘋果酸含量的差異顯著(P<0.05)。

由圖7可知,甲醇的醇沉效果是最好的,與其他兩種溶劑存在顯著性差異(P<0.05)。而且甲醇沸點低,易于回收,故選擇甲醇為沉淀聚蘋果酸的有機溶劑。

2.9.2 除去發(fā)酵中的副產(chǎn)物普魯蘭多糖 同時加入不同濃度的有機溶劑,找到最佳的比例,可以去除發(fā)酵液中的雜質(zhì)普魯蘭,純度較高的聚蘋果酸。按照方法1.2.12進行試驗,結(jié)果如圖8所示。

圖8 甲醇添加量對普魯蘭去除效果的影響Fig.8 Effect of methanol addition on the removal of pullulan注:小寫字母a、b、c代表沉淀中聚蘋果酸含量的差異顯著(P<0.05),大寫字母A、B、C代表沉淀中普魯蘭含量的差異顯著(P<0.05)。

由圖8可知,當(dāng)甲醇的添加量為2 mL和6 mL時,雖然沒有聚蘋果酸析出,但是沉淀中普魯蘭的含量與其他水平相比較,存在顯著性差異(P<0.05),料液中仍殘留大量普魯蘭。當(dāng)甲醇用量為10 mL,即與發(fā)酵液的體積比為1∶10的時候,雖然有6.76%的聚蘋果酸析出,但是大部分仍存在于上清液里,而析出的普魯蘭可用玻璃棒挑出。然后再添加4倍體積的甲醇,就可以得到相對比較純的聚蘋果酸沉淀了。

3 結(jié)論

文章中首先通過正交試驗,得到最佳種子培養(yǎng)基配方為80 g/L葡萄糖,4 g/L KH2PO4,3 g/L丁二酸銨,1 g/L丁二酸,1 g/L MgSO4·7H2O,0.07 g/L ZnSO4·7H2O,3 g/L玉米漿粉,30 g/L CaCO3(單獨滅菌),轉(zhuǎn)速為180 r/min。根據(jù)CV26b的發(fā)酵生長曲線,在發(fā)酵24 h的時候添加0.4 mmol/L的曲拉通,提高細胞通透性又不影響菌體生長,可提高聚蘋果酸的產(chǎn)量。5 L發(fā)酵罐的最佳轉(zhuǎn)速為500 r/min,最適通氣量為5.5 L/min,24 h后加入0.4 mmol/L的曲拉通并把pH控制在4.5,當(dāng)剩余葡萄糖含量低于10 g/L時,將發(fā)酵液排出2 L,再將2 L滅過菌的發(fā)酵培養(yǎng)基補入發(fā)酵罐中繼續(xù)發(fā)酵60 h。5 L發(fā)酵罐整個發(fā)酵周期124 h,可收集到聚蘋果酸的總量達到318 g。相較優(yōu)化前,每升發(fā)酵液的聚蘋果酸產(chǎn)量提高了46.8%,單一批次的發(fā)酵時間增加了40 h,產(chǎn)聚蘋果酸總量是原來的2.25倍。這種割罐法延長了發(fā)酵周期,減少了重復(fù)上罐下罐培養(yǎng)種子等一系列繁瑣工作,這在生產(chǎn)上就可以大大的降低成本。

文中還比較了甲醇、乙醇、丙酮的沉淀效果,確定4倍體積的甲醇對聚蘋果酸的沉淀效果最好并且方便回收利用。同時用1/10體積的甲醇還可以去除產(chǎn)物中的雜質(zhì)普魯蘭,得到純度較高的聚蘋果酸沉淀。

上述一系列試驗的意義在于,化繁為簡,提高了生物法大規(guī)模生產(chǎn)聚蘋果酸的可能性,為將來聚蘋果酸的產(chǎn)業(yè)化奠定了一定的基礎(chǔ)。