李鈺娜,宋英達,任晨霞

(長治醫(yī)學(xué)院,山西長治 046000)

蛋白酶是一類水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶類。蛋白酶是第一種被應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的酶類,也是最主要的工業(yè)酶制劑[1-3],占所有工業(yè)酶制劑銷售總額的60%,在食品、飼料、醫(yī)藥、化妝品制造和皮革加工等行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用[4-11]。蛋白酶在動物、植物、微生物中均有分布,但來源于動物、植物的蛋白酶往往生產(chǎn)周期長,且受到地理、氣候、季節(jié)等因素的影響,導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高,較難進行規(guī)模化生產(chǎn)。目前,商業(yè)化的蛋白酶制劑主要來源于細菌,而細菌分泌的胞外蛋白酶具有易提取、易純化、下游處理工藝相對簡單等優(yōu)勢,成為商業(yè)化酶制劑的主要來源。

隨著我國眾多工業(yè)領(lǐng)域地發(fā)展,蛋白酶需求逐年增加,尋求在較寬的溫度范圍內(nèi)及pH范圍內(nèi)具有較好穩(wěn)定性的蛋白酶,對于進一步拓展蛋白酶在各行業(yè)的應(yīng)用具有重要意義[12-14]。芽孢桿菌屬(Bacillussp.)是重要的蛋白酶生產(chǎn)菌株,產(chǎn)生蛋白酶的芽孢桿菌主要包括B.subtilis、B.cereus、B.pumilus、B.licheniformis等[15-17]。本研究中菌株Bacillussp.L1分泌的胞外蛋白酶EL1與Bacillusstratosphericus分泌的絲氨酸蛋白酶同源性最高,具有較好的熱穩(wěn)定性和堿穩(wěn)定性,具有一定的工業(yè)應(yīng)用價值,本研究為胞外蛋白酶EL1的進一步開發(fā)和利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PMDTM18-T載體克隆試劑盒 日本Takara公司;Bacillussp. L1、E.coliDH5α為實驗室保存菌株;低分子量蛋白Marker(14.4～116 kDa)、苯甲基磺酰氟(PMSF) 北京索萊寶公司;Biospin細菌基因組提取試劑盒 杭州博日科技公司;PCR產(chǎn)物純化試劑盒 美國Omega公司;Solution I載體連接試劑盒 日本Takara公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

ELX800酶標儀 美國BioTek公司;DYCZ-24DN雙垂直電泳槽 北京六一公司;TGL-16M臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀公司;DEAE sepharose fast flow層析柱 美國GE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備 LB液體培養(yǎng)基:酵母粉 0.5 g,蛋白胨 1 g,NaCl 1 g,H2O 100 mL,pH7.5;發(fā)酵培養(yǎng)基:麩皮 1 g,玉米粉 2 g,豆粕 2 g,KH2PO40.03 g,Na2HPO40.1 g,Na2CO30.1 g,CaCl20.1 g,H2O 100 mL,pH7.5。

1.2.2 16S rRNA序列測定 利用試劑盒提取細菌基因組DNA作為模板,27 F(5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′)及1492 R(5′-ACGGCTACCTTGTTACG ACTT-3′)為通用引物擴增16S rRNA基因序列。對擴增產(chǎn)物進行切膠回收并與PMDTM18-T載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH 5α,挑取陽性克隆進行測序。

1.2.3 酶活測定 Folin-酚法測定蛋白酶活力[18-19]。將60 ℃,每分鐘催化酪蛋白水解生成1 μg酪氨酸所需的酶量定義為1個活力單位。

1.2.4 蛋白酶的分離純化 首先斜面挑取菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h進行菌株的活化,然后將活化后的菌株按1%的接種量接種于發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)3 d;將發(fā)酵液在4 ℃、8000×g離心30 min,收集上清。將(NH4)2SO4粉末緩慢加至上清液中[20],使其飽和度達到65%,4 ℃靜置過夜。之后將液體8000×g離心30 min,棄上清,沉淀用20 mmol/L的Tris-HCl(pH8.8)重溶,并用該緩沖液透析10 h。用20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH8.8)平衡層析柱,上樣,利用0～100%的1 mol/L NaCl 溶液以1.0 mL/min 的流速進行線性梯度洗脫,按照1 mL/管進行分部收集,測定每管收集液的酶活,將蛋白酶活性較高管進行合并,進行SDS-PAGE純度鑒定。

1.2.5 質(zhì)譜鑒定、基因克隆 SDS-PAGE電泳獲得的目的條帶經(jīng)胰蛋白酶酶解后進行二級質(zhì)譜檢測,檢測結(jié)果搜索數(shù)據(jù)庫Mascot,獲得最相似的蛋白序列,根據(jù)該序列設(shè)計嵌套引物,利用TAIL-PCR技術(shù)[21]克隆5′端未知序列和3′端未知序列,最后拼接獲得全序列。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)測定

1.2.6.1 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性 將純化的酶液適當稀釋,分別在37、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃下孵育,Folin-酚法檢測蛋白酶活力。酶活最高時對應(yīng)的溫度為酶的最適溫度。將純化的酶液在60 ℃水浴中保溫1、1.5、2、2.5、3、4、5 h,在最適反應(yīng)溫度下檢測殘余酶活力,以未處理酶液為對照,將其活力定義為100%,分析溫度對酶活力的影響。

1.2.6.2 最適pH及pH穩(wěn)定性 用Mcllvaine buffer(pH4.0、5.0、6.0、7.0)、Tris-HCl buffer(pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)和Glycine-NaOH buffer(pH9.0、9.5、10.0、10.5)三種緩沖液對酶液進行適當稀釋。Folin-酚法檢測蛋白酶活力,確定酶的最適pH。將純化的酶液于0 ℃、pH8.0緩沖液中處理不同時間,最適溫度下檢測殘余酶活力,將未處理酶液活力定義為100%,分析pH穩(wěn)定性。

1.2.6.3 金屬離子及抑制劑對酶活性的影響 用20 mmol/L pH8.0 的Tris-HCl緩沖液配制10 mmol/L的不同金屬離子溶液,將金屬離子(Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+)溶液與酶液按照1∶4的比例混合,使金屬離子終濃度為2 mmol/L。配制10 mmol/L的PMSF,與酶液與按照1∶4的比例混合,使其終濃度為2 mmol/L。冰浴30 min,以pH8.0、20 mmol/L Tris-HCl對酶液稀釋相同倍數(shù)作為對照,于最適反應(yīng)條件下測定酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA序列分析

將16S rRNA序列測定結(jié)果進行搜庫比對分析,發(fā)現(xiàn)菌株與GenBank中的Bacillusstratosphericus屬菌具有高度同源性,相似度達99%,因此將菌株L1與Bacillusstratosphericus歸為同一屬(圖1)。

2.2 蛋白酶的分離純化

用65%的(NH4)2SO4對菌株Bacillussp. L1發(fā)酵后的粗酶液進行沉淀。陰離子交換層析對透析脫鹽后的樣品進行純化(圖2),收集具有蛋白酶活性的峰尖部分,超濾濃縮后SDS-PAGE電泳檢測為單一條帶(圖3),由SDS-PAGE圖譜可知EL1的分子量介于45～66 kDa之間。

2.3 質(zhì)譜鑒定及基因克隆

二級質(zhì)譜獲得2段多肽序列,序列與Bacillusstratosphericus分泌的絲氨酸蛋白酶序列高度一致,序列一致性為100%(表1)?？寺〉牡鞍酌窫L1的全基因序列與Bacillusstratosphericu絲氨酸蛋白酶(WP_007499449)全序列的相似度為98%,共1326 bp(圖4)。由此可知,EL1是由441個氨基酸組成的絲氨酸蛋白酶。

2.4 酶學(xué)性質(zhì)分析

表1 蛋白酶MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜檢測結(jié)果Table 1 Amino acid sequence of the EL1 by using MALDI-TOF/TOF system

圖1 菌株L1的16 S rRNA系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of the strain L1 on the 16S rRNA gene sequence

2.4.1 最適溫度及熱穩(wěn)定性 檢測結(jié)果表明,EL1最適溫度為60 ℃;熱穩(wěn)定性試驗表明,60 ℃處理5 h,仍保留約60%的酶活力,EL1具有很好的熱穩(wěn)定性(圖5)。

圖2 DEAE陰離子交換色譜圖Fig.2. Elution profile of proteases secreted by Bacillus sp. L1 on DEAE

圖3 蛋白酶SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE of the purified protease

2.4.2 EL1的最適pH及pH穩(wěn)定性 檢測結(jié)果表明,EL1最適pH為8.0;EL1在pH8.0的緩沖液中處理12 h時仍可保留約80%以上的酶活力,在堿性條件下穩(wěn)定性較好(圖6)。

圖5 EL1的最適溫度(A)和熱穩(wěn)定性(B)Fig.5 Optimum temperature(A)and the temperature(B)stability of EL1

圖4 EL1的核苷酸序列和氨基酸序列(實線框中的序列為Peptidases_S8_1)Fig.4 The nucleotide sequence and amino acid sequence of EL1(The sequence in the box are the Peptidases_S8_1)

圖6 EL1的最適pH(A)及pH穩(wěn)定性(B)Fig.6 Optimum pH(A)and the pH stability(B)of EL1

2.4.3 金屬離子及抑制劑對 EL1的影響 檢測結(jié)果表明,Mn2+對EL1活力具有一定的促進作用,Cu2+具有一定的抑制作用,PMSF作用下EL1幾乎完全失活(圖7),進一步驗證了EL1屬于絲氨酸蛋白酶。

圖7 各種金屬離子及抑制劑對EL1的影響Fig.7 Effect of different regents on the activity of EL1

3 結(jié)論

本研究從菌株Bacillussp. L1分泌的胞外蛋白酶中純化出了EL1。EL1氨基酸序列與菌株Bacillusstratosphericus分泌的絲氨酸蛋白酶具有較高的同源性,且酶活性受到PMSF的抑制,故推斷其為絲氨酸蛋白酶。EL1最適溫度為60 ℃,具有較好的熱穩(wěn)定性,60 ℃處理5 h,仍保留約60%的酶活力;最適pH為8.0,且在pH8.0的緩沖液中處理12 h時仍可保留約80%以上的酶活力。與已報道的Bacillussp.來源的蛋白酶相比較,在較寬的溫度范圍及pH范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性,如李金鞠等[22]報道的芽孢桿菌蛋白酶BLYS-1在pH5～8時活性較高,最佳反應(yīng)溫度為50 ℃。該特性使其在一些特殊的工業(yè)生產(chǎn)中(如:高溫、堿性環(huán)境)具有潛在的應(yīng)用價值。鑒于該絲氨酸蛋白酶的純化得率不高,下一步預(yù)計通過響應(yīng)面法對發(fā)酵條件進行優(yōu)化,另一方面可以通過構(gòu)建重組表達載體,對該蛋白酶進行異源表達,進而提高EL1的產(chǎn)量,為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。