(1.河南仰韶生化工程有限公司,河南澠池 472400;2.江南大學(xué),工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122;3.無(wú)錫先秦生物科技有限公司,江蘇無(wú)錫 214073)

粉絲是我國(guó)傳統(tǒng)美食,已有1400多年的歷史[1],至今依然是深受人們喜愛(ài)的大眾食品。由于生產(chǎn)原料的不同,粉絲有很多種類,其中以綠豆粉絲、紅薯粉絲和馬鈴薯粉絲最為常見(jiàn)。

以傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)薯類粉絲時(shí)一般需要加入明礬以提高成品的韌性和耐煮性,同時(shí)可以減少生產(chǎn)過(guò)程中粉絲之間的并條現(xiàn)象[2],提高生產(chǎn)效率。由于明礬的過(guò)量攝入會(huì)導(dǎo)致老年性癡呆、骨質(zhì)疏松等健康問(wèn)題[3],因此我國(guó)科技工作者對(duì)粉絲中明礬替代物及其使用方法進(jìn)行了大量的研究,獲得了復(fù)合磷酸鹽、黃原膠、羧甲基纖維素(CMC)等多種明礬替代物[4-6],這些研究成果在一定程度上解決了明礬帶來(lái)的食品安全問(wèn)題。2015年以來(lái),沈微等研究者們建立了一種以淀粉支鏈水解酶處理芡糊的酶法粉絲制作方法,以這種方法所制作的粉絲質(zhì)量與添加明礬的粉絲基本一致[7-9]。酶是一種高效率的蛋白質(zhì)催化劑,用量很小,而且加熱變性后成為成品粉絲中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),因此從食品安全的角度考慮,這是一種理想的無(wú)明礬粉絲制作方法。采用重組微生物生產(chǎn)的酶制劑在食品工業(yè)中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。我國(guó)2014年公布的可用于食品工業(yè)的酶制劑共計(jì)54種,分別可以用146種植物、動(dòng)物或微生物進(jìn)行生產(chǎn),其中有42種為重組微生物[10]。本課題組在前期進(jìn)行酶法粉絲制作方法的試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn),這種方法在技術(shù)上存在一個(gè)缺陷,即普魯蘭酶需要在芡糊制作完成后添加,由于芡糊的粘度很大,酶與芡糊的混合有一定的困難。在實(shí)際生產(chǎn)中芡糊量較大時(shí),兩者的混合需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。酶法粉絲制作工藝中采用這種先制糊后加酶的方法主要是由于目前已有的普魯蘭酶都不能耐受制芡糊時(shí)的高溫條件。粉絲制作中常用的紅薯淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉和馬鈴薯淀粉的糊化溫度分別為:76、69、72和66 ℃[11]。在實(shí)際生產(chǎn)中為確保淀粉迅速糊化,一般制芡糊的溫度要達(dá)到80 ℃以上。

針對(duì)這一問(wèn)題本課題組在無(wú)錫先秦生物科技有限公司的菌種庫(kù)中篩選耐熱水平較高的中性普魯蘭酶,進(jìn)行先加酶后糊化工藝的試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)其中來(lái)源于ThermusthermophilusXQ5331的普魯蘭酶具有較好的使用效果。本文研究了ThermusthermophilusXQ5331普魯蘭酶基因的克隆表達(dá)以及重組酶在馬鈴薯淀粉粉絲制作中的應(yīng)用情況,以期為普魯蘭酶的應(yīng)用和粉絲的加工提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌表達(dá)載體pLac03[8]、出發(fā)菌ThermusthermophilusXQ5331 無(wú)錫先秦生物科技有限公司,其中T.thermophilusXQ5331已經(jīng)在江南大學(xué)中國(guó)高校工業(yè)微生物資源數(shù)據(jù)平臺(tái)(CICIM)正式保藏,保藏編號(hào)為:CICIM B6915;限制性內(nèi)切酶EcoRI、HindIII、聚合酶ExTaq以及連接酶、標(biāo)準(zhǔn)分子量等 大連寶生物工程有限公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒、膠回收試劑盒 上海華舜生物技術(shù)有限公司;普魯蘭糖 Sigma公司產(chǎn)品;TB培養(yǎng)基 北京吉美生物科技有限公司;馬鈴薯淀粉 東金泰淀粉有限公司;其它試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,均為分析純。

TC型基因擴(kuò)增儀 杭州博日科技有限公司;BCM生物潔凈型超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;UV-2000 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;DYCP-31DN型核酸電泳儀 南京諾泰施格科學(xué)儀器有限公司;MP3型垂直電泳儀、Universal Hood II全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)BIO-RAD公司;Scientiz-II D型超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;HN-2006型粉絲機(jī) 永康市博寧工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 普魯蘭酶表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)T.thermophilusJL-18基因組序列(NCBI登錄號(hào):NC_017587.1),設(shè)計(jì)擴(kuò)增普魯蘭酶基因的引物如下:

Pttp1:5′-AATTACCGGAATTCATGGCATGGTAC GAAGGC-3′

Pttp2:5′-AATTACCGAAGCTTTTAGGCCTCCCG CCAC-3′

引物中帶下劃線部分為內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn),雙下劃線部分為核糖體結(jié)合位點(diǎn)。

以T.thermophilusXQ5331染色體DNA為模板,以Pttp1、Pttp2為引物PCR擴(kuò)增得到普魯蘭酶基因片段,擴(kuò)增片段純化后用EcoRⅠ和HindIII酶切,與經(jīng)同樣酶切的表達(dá)載體pLac03連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒后酶切驗(yàn)證并測(cè)序。

1.2.2 重組普魯蘭酶的表達(dá)、純化與測(cè)定 取含重組質(zhì)粒的菌株及含空質(zhì)粒的對(duì)照菌株單菌落接種于20 mL含有100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)12 h后,接種于50 mL的TB培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min搖瓶發(fā)酵,接種量為2%。每隔6 h取一次樣,檢測(cè)OD600后離心取上清液檢測(cè)發(fā)酵液酶活,沉淀細(xì)胞用pH7.0的磷酸緩沖液懸浮,細(xì)胞懸液在冰水浴中按200 W,1 s間隔1 s進(jìn)行超聲破碎,總時(shí)長(zhǎng)為30 min。取重組菌細(xì)胞破碎液,用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾后上樣于DEAE陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行離子交換層析。SDS-PAGE電泳檢測(cè)所收集的層析液的純度,進(jìn)一步用Amico Ultra-0.5 Centrafugal Filter超濾離心柱離心濃縮收集液,用SDS-PAGE電泳對(duì)濃縮液純度進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。SDS-PAGE凝膠電泳按常規(guī)方法進(jìn)行[12]。用Bradford法檢測(cè)酶液蛋白總量[13],以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。以純化后的酶液實(shí)際酶活除以酶液蛋白量獲得比酶活。重組普魯蘭酶GsP的制備方法同文獻(xiàn)[9]。

1.2.3 普魯蘭酶酶活的測(cè)定 普魯蘭酶酶活的測(cè)定采用二硝基水楊酸(DNS)法[14]。首先按文獻(xiàn)方法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。取適當(dāng)稀釋的粗酶液75 μL,加入緩沖液175 μL,加入10 g/L普魯蘭糖溶液250 μL,70 ℃下金屬浴20 min。加入DNS試劑750 μL搖勻,沸水浴15 min,流水冷卻后在550 nm波長(zhǎng)下,以0.5 cm比色杯,用對(duì)照管調(diào)零,測(cè)定反應(yīng)液的吸光值。煮沸滅活后的粗酶液加入普魯蘭糖溶液為對(duì)照。將所測(cè)得OD與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比獲得反應(yīng)液中還原糖含量。酶活單位定義:在相應(yīng)條件下,每分鐘分解普魯蘭糖所釋放的還原糖,其還原力相當(dāng)于1 μmol葡萄糖所需的酶量,以1 U表示。

1.2.4 重組普魯蘭酶的酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

1.2.4.1 重組酶的最適pH 在pH5.0～8.0范圍內(nèi),間隔0.5配制磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液,在70 ℃條件下,以上述不同pH緩沖液,按1.2.3酶活測(cè)定方法檢測(cè)重組酶酶活。以最高酶活為100%,計(jì)算不同pH下的相對(duì)酶活,確定最適pH條件。

1.2.4.2 重組酶的最適溫度與熱穩(wěn)定性 在最適pH條件下,在55～85 ℃范圍內(nèi),每隔5 ℃設(shè)置一個(gè)梯度,按1.2.3酶活測(cè)定方法檢測(cè)重組酶酶活,以最高酶活為100%,計(jì)算不同溫度下的相對(duì)酶活。在最適pH條件下,將重組酶在75、80、85、90 ℃條件下,按10、20、30、40、50、60 min進(jìn)行保溫,保溫后將酶液迅速放入冰水中冷卻5 min。在最適條件下檢測(cè)殘余酶活以確定重組酶熱穩(wěn)定性。

1.2.5 添加明礬的粉絲制作工藝 參考文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行粉絲制備。稱取50 g馬鈴薯淀粉,加入50 mL、55 ℃的純水將其制成懸液,加入相當(dāng)于粉絲淀粉總量0.1%的明礬,適當(dāng)攪拌使明礬充分溶解;上述淀粉懸液中沖入350 mL沸水制成芡糊;加入2 g食鹽和450 g生淀粉和面;用保鮮膜包裹上述粉團(tuán)放置10 min,在粉絲機(jī)中壓成絲,粉絲機(jī)壓出的生粉絲直接進(jìn)入煮絲鍋的沸水中煮絲約5 min,撈出用冷水冷卻;涼水中撈出的粉絲掛在陰涼通風(fēng)處,手工理絲,將并條的粉絲分開(kāi),風(fēng)干后即為成品粉絲。

1.2.6 酶法粉絲制作工藝 后加酶工藝:在上述添加明礬的粉絲制作工藝的基礎(chǔ)上,省略添加明礬的步驟,在制芡糊步驟完成后在芡糊中加入一定量酶液,混合后在酶的最適溫度下保溫30 min,再進(jìn)入后續(xù)和面等步驟,同1.2.5;

先加酶工藝:在淀粉懸液制成后加入普魯蘭酶并省略添加明礬的步驟,制芡糊完成后在酶的最適溫度下保溫30 min,然后進(jìn)入和面等步驟,同1.2.5。

1.2.7 粉絲質(zhì)量指標(biāo)的測(cè)定

1.2.7.1 斷條率的測(cè)定 截取100根長(zhǎng)約20 cm,表面無(wú)損傷的成品粉絲,放在3 L去離子水中煮沸20 min。計(jì)算粉絲斷條率:

斷條率(%)=((煮前粉絲條數(shù)-煮后粉絲條數(shù))/煮前粉絲條數(shù))×100

式(1)

式中,煮后粉絲條數(shù)是指煮后依然保持全長(zhǎng)的粉絲的條數(shù)。

1.2.7.2 膨潤(rùn)度和煮沸損失率的測(cè)定 截取長(zhǎng)度約5 cm的成品粉絲若干,在60 ℃烘箱中烘干至恒重。稱取約5 g(m1,g)上述粉絲放入盛有200 mL已沸騰去離子水的燒杯中,連續(xù)微煮沸20 min,過(guò)程中不斷加水保持水量不變。煮好后將燒杯在冰水中冷卻,取出粉絲,用濾紙吸取表面水分,稱取含水粉絲的質(zhì)量(m2,g),再將含水粉絲置于60 ℃烘箱中烘干至恒重(m3,g)。上述試驗(yàn)均做兩個(gè)平行樣,取平均值。

膨潤(rùn)度(%)=(m2/m3)×100

式(2)

蒸煮損失率(%)=((m1-m3)/m1)×100

式(3)

1.2.8 煮絲過(guò)程中并條情況的描述 粉絲制作過(guò)程中的煮絲階段的情況,其中嚴(yán)重并條是指粉絲條在沸水中互相粘連并條,并條的粉絲在隨后的理絲階段無(wú)法手工分開(kāi),或者雖然可以分開(kāi)但分開(kāi)后粉絲表面有損傷,最終無(wú)法得到質(zhì)量合格的粉絲進(jìn)行斷條率等指標(biāo)的測(cè)定;部分并條是指并條的粉絲在10%以內(nèi),并可以在理絲階段手工分開(kāi);少量并條是指煮絲時(shí)并條粉絲一般在2%以內(nèi)。爛糊是指煮絲時(shí)大量粉絲條散架,基本得不到粉絲。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)的Blast軟件進(jìn)行核苷酸序列的在線比對(duì)。酶學(xué)性質(zhì)研究采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖,用五次試驗(yàn)的平均值作圖,正負(fù)誤差線代表五次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中與平均值的最大偏差。蛋白電泳圖中重組蛋白分子量采用圖像分析軟件Image lab 4.0推算。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌的構(gòu)建

以T.thermophilusXQ5331的染色體DNA為模板,以Pttp1、Pttp2為引物經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得1.4 kbp的擴(kuò)增產(chǎn)物,產(chǎn)物大小與推測(cè)的普魯蘭酶基因編碼區(qū)一致,為便于敘述該片段命名為TtP5331。用膠回收試劑盒回收上述TtP5331基因片段與表達(dá)載體pLac03連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,在轉(zhuǎn)化子平板上任取4個(gè)轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切鑒定。圖1是重組質(zhì)粒pLac03-TtP5331的結(jié)構(gòu)圖和上述4個(gè)轉(zhuǎn)化子的酶切電泳圖譜。由圖1(A)泳道1～4可見(jiàn),上述4個(gè)質(zhì)粒用EcoRⅠ、HindⅢ酶切后均獲得1400、2500 bp的兩個(gè)片段,分別與TtP5331片段和載體pLac03一致,符合重組質(zhì)粒pLac03-TtP5331應(yīng)有特點(diǎn)(圖1B)。

圖1 重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證電泳圖譜(A)和質(zhì)粒pLac03-TtP5331物理圖譜(B)Fig.1 Electrophoretic map of recombinant plasmid by restriction enzyme digestion(A)and physical map(B)of plasmid plac03-ttp5331 注:M:標(biāo)準(zhǔn)分子量DL5000;1～4:pLac03-TtP5331/EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ。

將上述4個(gè)重組質(zhì)粒送上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序,結(jié)果顯示,4個(gè)質(zhì)粒中所含插入片段的序列完全一致。將上述插入片段的序列提交美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI),用Blast軟件進(jìn)行序列搜索比對(duì)。結(jié)果顯示,該序列與NCBI核苷酸序列庫(kù)中收錄的ThermusthermophilusJL-18的基因組序列(NCBI登錄號(hào):NC_017587.1)中一段標(biāo)注為普魯蘭酶的基因的核苷酸序列最為接近,同源性達(dá)99%。進(jìn)一步對(duì)序列比對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),在有重組酶酶學(xué)性質(zhì)報(bào)道的序列中,與上述TtP5331最接近的是來(lái)源于ThermusthermophilusHB27[15-16]和來(lái)源于BacillusflavocaldariusKP1228[17-18]的普魯蘭酶基因。TtP5331基因編碼的多肽鏈的氨基酸序列與上述兩種普魯蘭酶的序列同源性均為94%。根據(jù)Wu等[15]的報(bào)道,T.thermophilusHB27普魯蘭酶基因的表達(dá)產(chǎn)物是一種高耐熱II型普魯蘭酶,主要水解淀粉分子中的α-1,6-糖苷鍵,也水解α-1,4-糖苷鍵。取上述4個(gè)重組菌中的1#菌,命名為大腸桿菌JM109/pLac03-TtP5331 XW01,簡(jiǎn)稱XW01,用于基因表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)的研究。

2.2 TtP5331基因的表達(dá)與重組酶的純化

重組菌XW01和含空質(zhì)粒的對(duì)照菌大腸桿菌JM109/pLac03分別按方法1.2.2進(jìn)行發(fā)酵。進(jìn)一步檢測(cè)胞內(nèi)和胞外成分的普魯蘭酶酶活,結(jié)果顯示含空質(zhì)粒的對(duì)照菌各成分中均未檢測(cè)到普魯蘭酶酶活。含重組質(zhì)粒的XW01菌株的細(xì)胞破碎液中有明顯的酶活,胞外發(fā)酵液中未檢測(cè)到酶活。對(duì)重組菌XW01的發(fā)酵性能進(jìn)行初步分析顯示,重組菌發(fā)酵至36 h時(shí)達(dá)到最高酶活,約為12 U/mL。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,重組菌XW01表達(dá)的是一種普魯蘭酶,為便于敘述將該重組酶命名為TtP。

取最高酶活的發(fā)酵液離心收集細(xì)胞,超聲波破碎后進(jìn)行重組蛋白的純化,結(jié)果如圖2所示。對(duì)比圖2的1、2泳道可見(jiàn),與對(duì)照菌相比,重組菌XW01的細(xì)胞破碎液在55 kDa附近有一明顯的高表達(dá)條帶,這一條帶的分子量與根據(jù)TtP5331基因序列推斷的TtP的理論分子量基本一致。由于TtP的氨基酸序列與Wu等[15]報(bào)道的來(lái)源于T.thermophilusHB27的普魯蘭酶的同源性只有94%,可能存在酶學(xué)性質(zhì)的差異,因此用離子交換色譜柱對(duì)重組酶進(jìn)行了純化并對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步分析。由圖2泳道4可見(jiàn),經(jīng)過(guò)離子交換純化后獲得的酶液已基本沒(méi)有雜帶,但對(duì)純化獲得的酶液進(jìn)一步濃縮后再電泳則顯示仍有少量的雜帶(圖2泳道3),因此經(jīng)離子交換后得到的是一種初步純化的酶液。

圖2 重組普魯蘭酶TtP的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant pullulanase of TtP注:1:JM09/pLac03全細(xì)胞蛋白;2:JM09/pLac03-TtP5331 XW01全細(xì)胞蛋白;3:純化后再濃縮的酶液;4:離子交換純化得到的酶液;5:JM09/pLac03-TtP5331胞外蛋白;M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量。

2.3 重組酶TtP的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 重組酶TtP的最適pH 在不同pH的磷酸緩沖液中檢測(cè)TtP的酶活,以最高酶活為100%比較不同pH對(duì)酶活的影響,結(jié)果如圖3所示。TtP對(duì)pH變化比較敏感,其最適pH為6.5,當(dāng)pH高于7.0或低于6.0時(shí)其酶活均在最高酶活的80%以下。

圖3 pH對(duì)TtP活性的影響Fig.3 Effects of pH on TtP activity

2.3.2 TtP的最適反應(yīng)溫度 在不同溫度下檢測(cè)TtP酶活,以最高酶活為100%比較不同溫度對(duì)酶活的影響,結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,當(dāng)檢測(cè)溫度低于75 ℃時(shí),TtP的酶活隨溫度升高而升高。當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時(shí)酶活略有下降,當(dāng)溫度達(dá)到85 ℃時(shí)酶活明顯下降?？梢?jiàn)TtP的最適反應(yīng)溫度在75 ℃左右,在80 ℃時(shí)仍有較高酶活。不同種類淀粉的糊化溫度有一定的差異,但大多在80 ℃以下,因此從耐高溫角度考慮,TtP可以耐受粉絲制作工藝中制芡糊階段的高溫環(huán)境。

圖4 溫度對(duì)重組酶TtP活性的影響Fig.4 Effects of temperature on TtP activity

綜合上述研究結(jié)果,TtP的最適反應(yīng)條件是pH6.5、75 ℃。結(jié)合酶液蛋白量的測(cè)定結(jié)果可以計(jì)算得到TtP的比酶活為17 U/mg,考慮到本文得到的是部分純化的酶蛋白,酶液中可能還有少量雜蛋白,因此,實(shí)際的比酶活應(yīng)該略大于17 U/mg。進(jìn)一步將TtP與可溶性直鏈淀粉溶液混合反應(yīng),結(jié)果顯示,1 U的TtP與含0.1 g直鏈淀粉的溶液混合反應(yīng)1 h后淀粉溶液與碘反應(yīng)的藍(lán)值完全消失,顯示淀粉已經(jīng)被完全降解,可見(jiàn)TtP具有水解直鏈淀粉中α-1,4-糖苷鍵的能力。在同樣條件下,將本課題組前期獲得的另外兩種I型普魯蘭酶,GsP[8]和BdP[19]分別與可溶性淀粉混合后反應(yīng),結(jié)果顯示,即使反應(yīng)24 h,淀粉溶液與碘的藍(lán)色反應(yīng)依然不會(huì)有明顯變化,可見(jiàn)I型普魯蘭酶不水解直鏈淀粉。Wu等[15]對(duì)來(lái)源于T.thermophilusHB27的普魯蘭酶的研究也顯示其能水解直鏈淀粉,是一種II型普魯蘭酶。綜上所示,TtP對(duì)淀粉分子中α-1,4糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵都具有水解能力,是一種II型普魯蘭酶。TtP的這一性質(zhì)可能導(dǎo)致其對(duì)淀粉過(guò)度降解,對(duì)TtP在粉絲制作中的應(yīng)用可能有不利影響。

表1 后加酶工藝中TtP添加量對(duì)粉絲質(zhì)量的影響Table 1 Effects of TtP addition on the vermicelli quality in process of adding enzyme after gelatinization

2.3.3 重組酶TtP的熱穩(wěn)定性 重組酶TtP在不同溫度下保溫后檢測(cè)酶活,結(jié)果顯示,TtP在75 ℃條件下基本穩(wěn)定,保溫1 h后仍保留約70%的酶活。TtP在85 ℃和90 ℃條件下失活較快,保溫1 h后酶活殘留均不到10%,在90 ℃下保溫10 min的情況下保留酶活約為60%。根據(jù)本文作者的試驗(yàn),淀粉芡糊制作時(shí),剛沖入沸水時(shí),芡糊溫度接近90 ℃,以后溫度迅速下降,一般在5 min以內(nèi)下降至85 ℃以下。從熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果看,如果在制芡糊之前加入TtP,在經(jīng)過(guò)制芡糊的短時(shí)高溫環(huán)境之后TtP的酶活仍可以大部分保留。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),TtP在沸水浴中大約5 min后酶活完全喪失,這能保證這種酶在煮絲階段可以被完全滅活,一方面可以避免酶對(duì)粉絲中淀粉的過(guò)度降解,同時(shí)也避免未失活的酶帶來(lái)新的食品安全問(wèn)題。

圖5 TtP的熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermostability of TtP

2.4 重組TtP在粉絲制作中的應(yīng)用

不同工藝粉絲的指標(biāo)測(cè)定結(jié)果如表1所示。分析表1數(shù)據(jù)可以得出以下結(jié)論:a.以馬鈴薯淀粉為原料按傳統(tǒng)工藝制作粉絲時(shí),如果明礬和酶均不添加,在煮絲階段粉絲條之間發(fā)生嚴(yán)重并條。這一方面會(huì)極大增加理絲階段的工作量,另一方面手工分開(kāi)的粉絲表面大多有損傷,很難制作出質(zhì)量合格的粉絲;b.在芡糊制作完成后按每克芡糊淀粉1 U的量添加TtP處理芡糊,則并條問(wèn)題基本消失,所制得的粉絲各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)均符合要求;c.粉絲制作中TtP的用量需要嚴(yán)格控制,添加0.5或1.5 U均無(wú)法得到合格的粉絲。TtP過(guò)量添加導(dǎo)致粉絲質(zhì)量下降可能源于TtP本身的特點(diǎn)。TtP是一種II型普魯蘭酶,主要水解淀粉中的α-1,6-糖苷鍵,但也能水解α-1,4-糖苷鍵,因此TtP的過(guò)量使用可能導(dǎo)致淀粉的過(guò)度水解,導(dǎo)致粉絲質(zhì)量下降或無(wú)法制成粉絲,因此在粉絲制作中,TtP的用量需要嚴(yán)格控制。圖6是幾種不同條件下制得粉絲的圖片。由圖6可見(jiàn),按每克芡糊淀粉1 U的量添加TtP得到的粉絲其形態(tài)與添加明礬得到的粉絲基本相同。明礬和普魯蘭酶均未添加的粉絲有相當(dāng)嚴(yán)重的并條現(xiàn)象,而按照3 U的量添加TtP制得的粉絲并條現(xiàn)象更為嚴(yán)重。

圖6 不同條件下制作粉絲的形態(tài)Fig.6 The shape of vermicelli made under different conditions

表2是本課題組前期工作中得到的另一種耐熱型普魯蘭酶GsP[8]用于粉絲制作的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。比較表1和表2可見(jiàn),采用先制糊后加酶工藝時(shí),GsP和TtP的使用效果接近,添加1 U酶后均能獲得質(zhì)量合格的粉絲。兩者主要的差異是TtP的用量必須要嚴(yán)格控制在1 U左右,而GsP的添加量則只需要控制在1 U以上,增加酶的用量雖然不能進(jìn)一步提高粉絲質(zhì)量,但也沒(méi)有明顯的不良后果。產(chǎn)生這一差異的原因可能是因?yàn)镚sP是一種I型普魯蘭酶,只水解淀粉中的α-1,6-糖苷鍵,過(guò)量添加并不會(huì)導(dǎo)致淀粉的過(guò)度水解。從上述分析看,在采用先制糊后加酶工藝時(shí),GsP的性能更可靠。

表2 后加酶工藝中GsP不同添加量對(duì)粉絲質(zhì)量的影響Table 2 Effects of GsP addition on the vermicelli quality in process of adding enzyme after gelatinization

表3 先加酶工藝中TtP不同添加量對(duì)粉絲質(zhì)量的影響Table 3 Effects of TtP addition on the vermicelli quality in process of adding enzyme before gelatinization

表4 后加酶工藝中GsP不同添加量對(duì)粉絲質(zhì)量的影響Table 4 Effects of GsP addition on the vermicelli quality in process of adding enzyme before gelatinization

表3、表4是采用先加酶后制糊工藝制作粉絲的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。比較表1和表3數(shù)據(jù)可見(jiàn),采用先加酶后制糊工藝時(shí),TtP的最適添加量仍然是1 U,這與其在后加酶工藝中的使用量是相同的,產(chǎn)生的效果也基本一致,這表明TtP在經(jīng)過(guò)制糊的高溫條件后依然能保持大部分酶活。GsP的使用效果則明顯不同,比較表2和表4可見(jiàn),在先加酶工藝中,需要添加6 U的GsP才能得到合格的粉絲,其用量是后加酶工藝中的6倍。這一差異最大的可能是源于GsP在制糊過(guò)程中的失活。GsP的最適溫度是60 ℃[8],比TtP低15 ℃。芡糊制作時(shí),沸水沖入淀粉懸液時(shí)溫度可瞬間達(dá)到90 ℃左右,GsP在此條件下可能大部分失活,所以采用先加酶工藝時(shí)GsP的用量需要達(dá)到約6 U。由上述分析可見(jiàn),在先加酶后制糊工藝中,TtP的用量較小,有一定的優(yōu)勢(shì)。

3 討論與結(jié)論

在現(xiàn)有的酶法粉絲制作工藝中,普魯蘭酶都是在芡糊制作完成后加入[7-9]。由于芡糊粘度很高,因此酶與芡糊的混合有一定的困難。如果能獲得一種能耐受芡糊制作高溫環(huán)境的普魯蘭酶則可以在芡糊制作前把普魯蘭酶添加到淀粉懸液中,有效避免兩者混合困難的問(wèn)題。本文從嗜熱菌T.thermophilusXQ5331中克隆了普魯蘭酶基因TtP5331,表達(dá)的重組酶TtP最適溫度達(dá)75 ℃,可以短時(shí)耐受90 ℃高溫,理論上可以耐受芡糊制作的短時(shí)高溫條件。應(yīng)用研究顯示,采用先加酶后制糊工藝時(shí),TtP的最適用量大約為每克芡糊淀粉加酶1 U,與采用先制糊后加酶工藝時(shí)的用量相當(dāng)。而在先加酶后制糊工藝中采用另一種中性普魯蘭酶GsP時(shí),需要用6 U的酶。TtP的比酶活大約為17 U/mg,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道GsP的比酶活為36 U/mg[8]。TtP的比酶活雖然低于GsP,但是在先加酶后制糊工藝中其用量仍然遠(yuǎn)低于GsP。TtP在應(yīng)用上的一個(gè)不足之處是其具有水解α-1,4-糖苷鍵的活性,可能造成淀粉的過(guò)度水解,因此需要嚴(yán)格控制用量,在工藝條件嚴(yán)格的大規(guī)模生產(chǎn)中,這并不難做到。

在先加酶后制糊的粉絲制作工藝中,TtP用于粉絲制作時(shí),其最適用量大約為每克芡糊淀粉中加入1 U。芡糊淀粉大約占粉絲淀粉總量的10%,即粉絲的每克總淀粉中使用的TtP只有0.1 U,相當(dāng)于酶蛋白量約0.006 mg,即用量是粉絲淀粉總量的百萬(wàn)分之六。這個(gè)添加量遠(yuǎn)低于明礬或其它明礬替代物的添加量。在酶法粉絲生產(chǎn)工藝中,TtP是一種用量小、使用簡(jiǎn)便的明礬替代物。