范麗麗,竇博鑫,張曉琳,徐晨冉,蘆志鳳,劉 穎

(哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院,黑龍江省食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

大豆貯藏蛋白占大豆籽粒的40%～45%,含有人體不能合成的8種氨基酸,其營養(yǎng)價值較高,被稱為“植物肉”[1-4]。大豆7S球蛋白(β-伴球蛋白)是大豆蛋白的主要貯藏蛋白,分子量為180～200 kDa的糖蛋白[5],由α、α′和β亞基通過疏水鍵和氫鍵結(jié)合形成三聚體[6]。

近年來許多研究已經(jīng)表明,通過酶的改性可以改善大豆蛋白的功能特性,如乳化性、起泡性等[7],Ikura等報道了豚鼠來源的TGase催化11S大豆球蛋白和7S球蛋白聚合,結(jié)果顯示TGase催化7S聚合的速率要明顯優(yōu)于11S,同時指出TGase催化酸性亞基和堿性亞基的速度不同,只有酸性亞基能被TGase聚合[8];Tang等利用MTGase交聯(lián)改性富含7S球蛋白的大豆分離蛋白(SPI),結(jié)果顯示7S球蛋白含量高的SPI凝膠結(jié)構(gòu)主要通過依靠疏水鍵和氫鍵維持,改性后凝膠透明度有所提高[9],但是通過酶改性對蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性相關(guān)性的研究很少有報道。探討MTGase交聯(lián)改性大豆7S球蛋白的乳化性、溶液性質(zhì)和結(jié)構(gòu)對大豆7S球蛋白表面疏水性的關(guān)系影響很大。

本研究以大豆7S球蛋白為研究對象,以微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(MTG)酶添加量、pH、溫度為單因素交聯(lián)處理大豆7S球蛋白,分別測定其表面疏水性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、流體動力學粒徑、Z-電位,并對蛋白質(zhì)表面疏水性與乳化性、乳化穩(wěn)定性、流體動力學粒徑、Z-電位進行相關(guān)性分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低溫脫脂大豆粕 山東禹王有限公司;MTGase(活性130 U/g) 江蘇瑞欣食品生物科技有限公司;1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS) Sigma公司進口;K2HPO4、KH2PO4、NaCl 優(yōu)級純;其余試劑 均為分析純。

F-7000FL220-240V熒光光譜儀 Watter公司;Alpha1-2冷凍干燥機 錫山市林洲干燥機廠;TG16-WS高速離心機 上海市盧湘儀離心機儀器有限公司;722S型分光光度計 上海市精密科學儀器有限公司;恒溫加熱磁力攪拌器 北京市科偉永興儀器有限公司;Malvern激光粒度儀 上海市思百吉儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆7S球蛋白的制備 參照劉春等[10]的方法制備大豆7S球蛋白。

1.2.2 MTGase交聯(lián)處理大豆7S球蛋白

1.2.2.1 MTGase添加量對大豆7S球蛋白功能特性及溶液性質(zhì)的影響 將制得的7S球蛋白,溶于0.01 mol/L、pH7.0的PBS緩沖液中,配制成1%(W/V)7S球蛋白溶液,調(diào)pH至7.0,然后分別加入10、20、30、40、50 U/g MTGase,聚合物在55 ℃下反應(yīng)2 h后,80 ℃水浴5 min,滅酶,測定MTGase添加量對蛋白質(zhì)表面疏水性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、平均粒徑和Zeta電位的影響[11-13]。

1.2.2.2 pH對大豆7S球蛋白功能特性及溶液性質(zhì)的影響 將制得的7S球蛋白溶于0.01 mol/L、pH7.0PBS緩沖液中,配制成1%(W/V)7S球蛋白溶液,分別調(diào)pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0,分別加入20 U/g MTGase,聚合物在55 ℃下反應(yīng)2 h后,80 ℃水浴5 min,滅酶,測定不同pH對蛋白質(zhì)表面疏水性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、平均粒徑和Zeta電位的影響。

1.2.2.3 溫度對大豆7S球蛋白功能特性及溶液性質(zhì)的影響 將制得的7S球蛋白,溶于0.01 mol/L、pH7.0 PBS緩沖液中,配制成1%(W/V)7S球蛋白溶液,調(diào)pH至7.0,加入20 U/g MTGase,聚合物分別在40、45、50、55、60 ℃下反應(yīng)2 h后,80 ℃水浴5 min,滅酶,測定不同溫度對蛋白質(zhì)表面疏水性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、平均粒徑和Zeta電位的影響。

1.2.3 指標測定方法

1.2.3.1 表面疏水性的測定 采用ANS熒光探針法[14]測定蛋白質(zhì)的疏水性。將MTGase交聯(lián)處理大豆7S球蛋白樣品溶于0.01 mol/L、pH7.0的PBS緩沖液中,制成0.005%、0.01%、0.02%、0.1%、0.2%(W/V)的溶液。取樣品液4 mL,加入50 μL 8 mmol/L ANS,充分振蕩后,室溫下靜置3 min。熒光發(fā)射光譜測試條件:采用290 nm為激發(fā)光波長,掃描范圍300～400 nm,激發(fā)狹縫寬5 nm,發(fā)射狹縫5 nm測定熒光強度。以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標,熒光強度為縱坐標制作曲線,曲線初始階段的斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)(S0)。

1.2.3.2 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定 配制1%(W/V)的MTGase交聯(lián)處理大豆7S球蛋白溶液,取15 mL樣品溶液與5 mL大豆油置于燒杯中混合,在高速剪切均質(zhì)機下10000 r/min乳化2 min,形成均一的乳化液。室溫下,分別于靜置后的第0和第30 min取20 μL的乳狀液與5 mL 0.1%SDS溶液均勻混合，取樣點固定在離燒杯底部0.5 cm處,在500 nm波長處測定其吸光值,分別記為A0和A30,用0.1%的SDS做空白對照[15-16]。

計算公式如下:

式中:T-2.303;N-稀釋倍數(shù),250;C-乳化液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,g/mL;φ-乳化液中油的體積分數(shù),0.25。

式中:A0-所得樣品后直接測吸光值;A30-放置30 min后重新吸取所測的吸光值。

1.2.3.3 粒徑分布的測定 根據(jù)李楊等[17]的方法,采用馬爾文激光粒度分析儀測定MTGase交聯(lián)處理大豆7S球蛋白的流體動力學粒徑及其分布。將蛋白質(zhì)樣品用pH7.0的磷酸鹽緩沖液配制成0.1%的蛋白溶液,過0.45 μm水系醋酸纖維素濾膜,室溫下進行測定,取3次測定的平均值。

1.2.3.4 Zeta電位的測定 根據(jù)Crudden等[18]的測定方法,采用馬爾文電位儀測定MTGase交聯(lián)處理大豆7S球蛋白溶液的Zeta電位。將7S球蛋白樣品用緩沖液稀釋至質(zhì)量分數(shù)為0.2%,上樣體積為1 mL,測定溫度為25 ℃,溫度平衡時間為2 min。

1.2.4 MTGase交聯(lián)處理7S球蛋白相關(guān)性分析 將經(jīng)MTGase交聯(lián)處理的大豆7S球蛋白分別測定蛋白質(zhì)表面疏水性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、平均粒徑和Zeta電位后,對MTGase交聯(lián)處理的大豆7S球蛋白蛋白質(zhì)表面疏水性與乳化性、乳化穩(wěn)定性、平均粒徑、Zeta電位進行相關(guān)性分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析包括單因素方差分析和相關(guān)性分析,均采用SPSS 17.0軟件,方差分析差異性顯著(P<0.05)時采用Duncan方法進行多重比較。圖譜的分析處理和圖表的制作采用Origin 8.5軟件進行。

圖1 不同MTGase酶添加量對7S球蛋白功能特性及溶液性質(zhì)的影響Fig.1 Effect of different MTGase enzyme additions on the functional properties and solution properties of 7S globulin注:a.對表面疏水性的影響;b.對乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響;c.對平均粒徑的影響;d.對Zeat電位的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 MTGase交聯(lián)處理對7S球蛋白功能特性及溶液性質(zhì)的影響

2.1.1 MTGase酶添加量對7S球蛋白功能特性及溶液性質(zhì)的影響 蛋白質(zhì)的表面疏水性是由于蛋白質(zhì)中許多氨基酸殘基側(cè)鏈趨向于聚集,暴露于蛋白質(zhì)表面引起的,是兩個不溶于水的分子間的相互作用,是衡量蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的關(guān)鍵指標之一,即蛋白質(zhì)的表面疏水性與蛋白質(zhì)的功能、結(jié)構(gòu)特性等密切相關(guān)[19-20];從圖1a可以看出,隨著加酶量不斷增大,蛋白質(zhì)表面疏水性不斷增加,加酶量為20 U/g時疏水性增加到最大值,繼續(xù)增大加酶量蛋白質(zhì)表面疏水性降低,分析原因是MTGase催化7S球蛋白的活性明顯增強,使埋藏于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的MTGase的有效作用位點暴露于MTGase,從而使蛋白質(zhì)聚合速率增加,聚合物分子量不斷增長,在20 U/g時聚合物達到最大,當聚合物分子量到一定值時可能會產(chǎn)生一定的空間位阻,降低MTGase對蛋白的三級結(jié)構(gòu)影響,酶量繼續(xù)增加,蛋白質(zhì)不再聚合,蛋白質(zhì)表面疏水性趨于穩(wěn)定。這與姜巍巍[13]不同加酶量對不同大豆蛋白表面疏水性的影響分析結(jié)果一致。

大豆蛋白作為乳化劑被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中,乳化性是大豆蛋白最重要的特性之一[21]。如圖1b所示,隨著加酶量不斷增大,蛋白質(zhì)乳化性不斷增大,加酶量為20 U/g時乳化性增加到最大值,繼續(xù)增大加酶量蛋白質(zhì)乳化性降低,乳化穩(wěn)定性降低。分析原因是7S球蛋白乳化性受蛋白質(zhì)表面疏水性的影響,MTGase催化7S球蛋白的活性明顯增強[22-23],使蛋白質(zhì)表面疏水性增強,提升蛋白質(zhì)對油脂的吸附速率,從而改善蛋白質(zhì)乳化性[24],在酶添加量為20 U/g時乳化性達到最大,當酶添加量繼續(xù)增大,MTGase酶聚合蛋白質(zhì)能力達到飽和,產(chǎn)生一定的空間位阻,降低MTGase對蛋白的聚合速率,導(dǎo)致蛋白表面疏水性趨于穩(wěn)定,乳化性不再改變。

在蛋白質(zhì)聚集過程中,蛋白質(zhì)的平均粒徑不僅可以表征蛋白質(zhì)的聚集程度,同時也能夠反映出蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的改變[25]。由圖1c可以看出,7S球蛋白的平均粒徑隨MTGase酶添加量的增加,呈先增大后減小的趨勢,由于酶的交聯(lián)作用破壞了維持蛋白質(zhì)的主要作用力如疏水作用、靜電作用等,從而增加了蛋白質(zhì)碰撞幾率,使蛋白質(zhì)分子聚集現(xiàn)象增加,聚集物增大,表現(xiàn)為蛋白質(zhì)分子平均粒徑的增大,在酶添加量為20 U/g時達到最大,酶作用趨于飽和,繼續(xù)添加MTGase酶,產(chǎn)生空間位阻,蛋白質(zhì)不再繼續(xù)聚集,導(dǎo)致蛋白質(zhì)平均粒徑趨于穩(wěn)定[26-27]。

圖2 不同交聯(lián)pH對7S球蛋白功能特性及溶液性質(zhì)的影響Fig.2 Effect of different pH on the functional properties and solution properties of 7S globulin注:a.對表面疏水性的影響;b.對乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響;c.對平均粒徑的影響;d.對Zeat電位的影響。

Zeta電位是蛋白質(zhì)溶液中粒子表面和分散溶液之間的電勢,通過蛋白質(zhì)顆粒之間相互排斥或吸引[28]。由圖1d可以看出,7S球蛋白Zeta電位絕對值均大于20 mV,說明其體系整體趨于穩(wěn)定,而隨MTGase酶添加量增加,電位絕對值先下降后增加,由于酶添加量增大加快蛋白質(zhì)聚集速率,溶液變得不穩(wěn)定,加快蛋白質(zhì)疏水基團內(nèi)卷,分子間靜電斥力小于分子間引力,蛋白質(zhì)Zeta電位值降低,隨后由于酶催化活性降低,蛋白聚集作用降低,蛋白質(zhì)之間靜電斥力增大,體系趨于穩(wěn)定,Zeta電位絕對值增大。

2.1.2 交聯(lián)pH對7S球蛋白功能特性及溶液性質(zhì)的影響 預(yù)實驗可知7S球蛋白的表面疏水性為1024,由圖2a可以看出,隨著pH不斷增大,蛋白質(zhì)表面疏水性呈現(xiàn)先下降后增大的趨勢,當pH為5時表面疏水性降到最低,隨后pH增大表面疏水性開始明顯增加?？赡苁且驗榈鞍踪|(zhì)是兩性電解質(zhì),7S球蛋白的等電點為4.8,此時蛋白質(zhì)在電場中不遷移,其分子正負電荷相等,凈電荷為零,溶液中的蛋白質(zhì)顆粒因不存在同種電荷的相互排斥[28],分子易凝聚而產(chǎn)生沉淀,從而影響MTGase酶對7S球蛋白的催化作用,酶損失嚴重,當pH大于小于5時MTGase酶對7S球蛋白催化作用增強,蛋白質(zhì)表面疏水性增強。

預(yù)實驗可知7S球蛋白的乳化性為23.99 m2/g,大豆7S球蛋白在堿性環(huán)境中的乳化性和乳化穩(wěn)定性明顯優(yōu)于酸性環(huán)境,并且在pH為5時乳化性最低[29],這是因為7S球蛋白的等電點為4.8,而溶液的pH接近蛋白質(zhì)的等電點時,溶解性降低,乳化性降到最低,此時乳化性值為20.33 m2/g,且唐傳核[11]曾報道過MTGase在pH5.0～7.0范圍內(nèi)是相當穩(wěn)定的,pH小于4.0或pH9.0時該酶不穩(wěn)定,酶活損失嚴重,微酸狀態(tài)更有利于該酶的催化活性,因此7S球蛋白的乳化性在pH大于或小于這一區(qū)域,乳化性開始增加[30-31],在pH6.0～7.0時趨于穩(wěn)定。

預(yù)實驗可知7S球蛋白的平均粒徑為78.55 nm,由圖2c可知隨著pH不斷增大,蛋白質(zhì)平均粒徑呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢,當pH為5時蛋白質(zhì)平均粒徑增加到最大,由于7S球蛋白的等電點為4.8,此時蛋白質(zhì)顆粒在溶液中因沒有靜電排斥作用,蛋白質(zhì)溶解度最低,分子容易凝聚而產(chǎn)生沉淀,使蛋白質(zhì)分子平均粒徑增大,大于或小于等電點時平均粒徑減小,這與嚴江殷[32]pH對7S球蛋白粒度影響的結(jié)果相一致。

7S球蛋白的Zeta電位在pH3.0～7.0時,隨pH增大先降低后增大,在pH為5.0時最低,分析是pH為5時比較接近7S球蛋白的等電點,蛋白質(zhì)溶解度最低,此時蛋白易絮凝,蛋白質(zhì)分子間作用力減弱,靜電斥力減弱,從而使蛋白質(zhì)Zeta電位降低,大于或小于此區(qū)域時Zeta電位值增大[32]。

2.1.3 交聯(lián)溫度對7S球蛋白功能特性及溶液性質(zhì)的影響 由圖3可以看出,交聯(lián)溫度在45～55 ℃,蛋白質(zhì)表面疏水性比較大,溫度為55 ℃時疏水性增加到最大值,45、50、55 ℃時表面疏水性分別為1256.4、1260.7、1268.7,溫度繼續(xù)升高蛋白質(zhì)表面疏水性降低,分析原因是因為溫度的增加有利于大豆7S球蛋白結(jié)構(gòu)伸展,同時溫度增加會使MTGase催化交聯(lián)作用增強,蛋白表面疏水性增強,但當溫度繼續(xù)升高時,MTGase發(fā)生熱變性,使大豆7S球蛋白表面疏水性降低,這與姜巍巍[13]不同溫度對大豆蛋白表面疏水性影響的結(jié)果相似。

圖3 不同溫度對7S球蛋白功能特性及溶液性質(zhì)的影響Fig.3 Effect of different temperature on the functional properties and solution properties of 7S globulin注:a.對表面疏水性的影響;b.對乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響;c.對平均粒徑的影響;d.對Zeat電位的影響。

表1 表面疏水性對乳化性、乳化穩(wěn)定性、平均粒徑、Zeta電位的相關(guān)分析Table 1 Correlation analysis of surface hydrophobicity to emulsifying,emulsion stability,average particle size and zeta potential

注:*表示在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。隨著交聯(lián)溫度不斷增大,蛋白質(zhì)乳化性不斷增加,溫度為55 ℃時乳化性增加到最大值,為31.29 m2/g,溫度繼續(xù)升高蛋白質(zhì)乳化性降低,分析原因是因為溫度的增加有利于大豆7S球蛋白結(jié)構(gòu)伸展,同時MTGase在50～55 ℃時相對酶活呈直線增加[5,12],使MTGase催化交聯(lián)作用增強,蛋白表面疏水性增強,從而改善蛋白質(zhì)乳化性,但當溫度繼續(xù)升高時,MTGase發(fā)生熱變性,使大豆7S球蛋白表面疏水性降低,也降低了其乳化性。

隨著交聯(lián)溫度不斷增大,蛋白質(zhì)平均粒徑不斷增加,溫度為55 ℃時平均粒徑增加到最大值,為99.03 nm,溫度繼續(xù)升高蛋白質(zhì)平均粒徑降低,分析原因是熱處理破壞了維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力,使大豆7S球蛋白結(jié)構(gòu)伸展,同時溫度增加有利于MTGase酶催化活性,蛋白質(zhì)平均粒徑增大,當溫度繼續(xù)升高時,MTGase發(fā)生熱變性,在此溫度下7S球蛋白分子聚集作用降低,使其平均粒徑減小[28]。

隨著交聯(lián)溫度不斷增大,破壞了維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力,有利于大豆7S球蛋白結(jié)構(gòu)伸展,蛋白質(zhì)表面疏水性不斷增加,蛋白質(zhì)平均粒徑不斷增加,蛋白質(zhì)分子間作用力減弱,靜電斥力減弱[28],同時溫度增加會使MTGase催化交聯(lián)作用增強,增大蛋白質(zhì)表面疏水性,同樣會降低蛋白質(zhì)之間的靜電作用,導(dǎo)致蛋白電位降低,但當溫度繼續(xù)升高時,MTGase發(fā)生熱變性,在此溫度下7S球蛋白分子聚集作用降低,使其平均粒徑減小,蛋白質(zhì)之間靜電斥力增強,Zeta電位增大,這與本實驗中平均粒徑的分析結(jié)果一致。

2.2 7S球蛋白表面疏水性與功能特性及溶液性質(zhì)的相關(guān)分析

通過表1可知,蛋白質(zhì)表面疏水性與乳化性、平均粒徑、Zeta電位之間存在一定的相關(guān)性,這與劉春雷等[33]的實驗結(jié)果分析相一致。相關(guān)性表明:蛋白質(zhì)表面疏水性與乳化性存在正相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)為0.718(P=0.003);而表面疏水性與乳化穩(wěn)定性之間相關(guān)性不明顯,相關(guān)系數(shù)為0.304(P=0.270)。分析蛋白質(zhì)表面疏水性與乳化性的相關(guān)性,可能因為7S球蛋白具有豐富的疏水氨基酸含量,在其表面存在大量的疏水區(qū),所以它能很快地吸附在油滴的表面,使7S球蛋白乳化性增加,而蛋白質(zhì)表面疏水性和乳化穩(wěn)定性沒有相關(guān)性[34-35]。

相關(guān)性表明:蛋白質(zhì)表面疏水性與平均粒徑存在正相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)為0.860(P=0.005)。分析蛋白質(zhì)表面疏水性與平均粒徑的相關(guān)性,可能因為蛋白表面疏水性越大,蛋白質(zhì)分子之間的吸引力作用越大,蛋白質(zhì)相互聚集程度越大,平均粒徑越大,相反蛋白質(zhì)表面疏水性減小,蛋白質(zhì)平均粒徑減小。

相關(guān)性表明:蛋白質(zhì)表面疏水性與Zeta電位存在顯著負相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.727(P=0.02)。當Zeta電位絕對值較低時,溶液中蛋白質(zhì)分子表面電荷較少,蛋白質(zhì)分子間靜電斥力減弱,溶液中蛋白質(zhì)顆粒傾向聚集,使蛋白質(zhì)表面疏水性增大,相反蛋白質(zhì)溶液Zeta電位絕對值較大時,蛋白質(zhì)表面電荷增加,蛋白質(zhì)分子間靜電斥力增強,蛋白質(zhì)表面疏水性增強[36]。

3 結(jié)論與展望

MTGase交聯(lián)處理(酶添加量、pH、溫度)大豆7S球蛋白,結(jié)果表明:酶添加量為20 U/g,pH7.0,溫度55 ℃時,對其表面疏水性、乳化性、乳化穩(wěn)定性和平均粒徑影響較大,表面疏水性值為1268.7,乳化性值為31.29 m2/g,乳化穩(wěn)定性值為225.05 min,平均粒徑99.03 nm;通過相關(guān)性分析,大豆7S球蛋白的表面疏水性與乳化性成正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.718(P=0.003);而表面疏水性與乳化穩(wěn)定性之間相關(guān)性不明顯,相關(guān)系數(shù)為0.304(P=0.270);蛋白質(zhì)表面疏水性與平均粒徑存在正相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)為0.860(P=0.005);與Zeta電位成負相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為-0.727(P=0.02)。

(MTGase酶)改性技術(shù)是決定食品的色、香、味以及質(zhì)構(gòu)的一種重要手段。表面疏水性顯著影響大豆蛋白質(zhì)的功能特性及溶液性質(zhì),明確大豆蛋白質(zhì)功能特性及溶液性質(zhì)與表面疏水性的相關(guān)性,對今后開發(fā)特定功能性產(chǎn)品并進行分子設(shè)計和重組有重要意義。